CN115728408B

CN115728408B - 一种同时测定黄花蒿中七种青蒿素类相关化合物的方法

Info

Publication number: CN115728408B
Application number: CN202211261629.2A
Authority: CN
Inventors: 邬兰; 师玉华; 向丽; 陈士林; 王梦月; 王星文; 尹青岗; 高冉冉
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2022-10-14
Filing date: 2022-10-14
Publication date: 2024-05-07
Anticipated expiration: 2042-10-14
Also published as: CN115728408A

Abstract

本发明属于化学领域，提供了一种同时测定黄花蒿中七种青蒿素类相关化合物的方法，所述方法包括使用超高效液相色谱‑串联质谱检测黄花蒿提取物中青蒿素、青蒿素B、青蒿酸、青蒿烯、双氢青蒿酸、青蒿醛、紫穗槐‑4,11‑二烯的含量。本发明的方法操作简便、灵敏度高、准确性好。

Description

一种同时测定黄花蒿中七种青蒿素类相关化合物的方法

技术领域

本发明属于化学领域，涉及多种代谢物含量检测。

背景技术

青蒿素(Artemisinin)是从菊科植物黄花蒿Artemisia annua L.中分离得到的倍半萜内酯化合物，是世界卫生组织推荐的抗疟药物。

目前，青蒿素以及衍生物的检测方法主要有分光光度计、薄层色谱法、柱前衍生-高效液相色谱法、蒸发光散射-高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等。分光光度计及薄层色谱方法干扰因素大、不准确。青蒿素分子中不含有双键，无紫外吸收，仅在203nm或210nm处有较弱的末端吸收，采用高效液相色谱法直接进行青蒿素检测有一定难度，因此采用柱前衍生法，将其与碱反应后，再调节pH至酸性，转化的衍生物由于在260nm处有最大紫外吸收，可用于HPLC测定；但青蒿素衍生化步骤需要加碱和加酸两步反应，过程较为繁琐，假如条件调节控制不当会引起较大误差。上述方法存在过程复杂、定量不准确、分析速度慢、检测化合物单一等一定的局限性，实际应用并不广泛。

发明内容

本发明的目的是提供一种超高效液相色谱-串联质谱法同时测定黄花蒿中七种青蒿素类相关化合物的方法，该方法快速、操作简便、灵敏度高、准确性好，可同时定量检测黄花蒿中青蒿素合成途径七种代谢物。

为了实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种同时测定黄花蒿中七种青蒿素类相关化合物的方法，所述方法包括使用超高效液相色谱-串联质谱对黄花蒿提取物进行检测。

优选地，所述七种青蒿素类相关化合物为青蒿素、青蒿素B、青蒿酸、青蒿烯、双氢青蒿酸、青蒿醛、紫穗槐-4,11-二烯。

优选地，黄花蒿提取物为黄花蒿甲醇提取物。

在优选实施方式中，所述方法包括：

取黄花蒿提取物，利用超高效液相色谱-串联质谱仪进行检测，其中，

液相色谱条件为：

色谱柱：Eclipse Plus C₁₈，RRHD 2.1×50mm，1.8μm；液相洗脱梯度：A相为含0.1％甲酸和5mM甲酸铵的水溶液，B相为甲醇；B相变化：0-8min，55％-100％；8-11min，100％；11-11.01min，100％-55％；11.01-14min，55％；流速：0.6mL/min；柱温：40℃；进样量：5μL；

质谱条件为：

大气压化学电离源(APCI)，正离子模式，干燥气温度：300℃，干燥气流速：4L/min，蒸发室温度：400℃，雾化器压力：50psi，毛细管电压：2500V，电晕针电流：4μA，采集模式为多反应监测模式(MRM)，其中，七种青蒿素类相关化合物的出峰时间、母离子、子离子、碰撞能量和碎裂电压(Fragmentor电压)分别为：

*为定量离子。

优选地，所述超高效液相色谱-串联质谱仪为液相色谱-三重四极杆质谱联用系统Agilent1290-6470。

优选地，所述黄花蒿甲醇提取物的制备方法为：称取黄花蒿叶片粉末样品50mg，加入2.5mL甲醇，振荡混合均匀，超声提取15min，静置5min后取上清液经0.22μm滤膜过滤。

在优选的实施方式中，所述方法还包括：使用七种青蒿素类相关化合物标准品构建标准曲线，再根据标准曲线计算黄花蒿提取物中七种青蒿素类相关化合物的含量。

进一步优选地，构建标准曲线时，七种青蒿素类相关化合物每种的浓度范围为0.01～1μg/mL。

本发明利用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用方法，兼顾有液相色谱的强分离能力和质谱的良好选择性、高灵敏度、定量准确等优点，适合青蒿素这类无紫外吸收化合物的定量分析，具有快速、灵敏度高、准确性高、检测通量高、样品前处理简便等优点，为黄花蒿中青蒿素类相关化合物的含量测定提供了一个实用方法。且本发明中检测的这七种青蒿素类相关化合物覆盖了青蒿素合成途径的前、中、后段，是青蒿素合成途径上的代表性化合物。本发明的方法可以用于黄花蒿种质评价，青蒿素原料收购、合成途径相关代谢物、合成途径代谢产物提取和精制过程中的含量测定，以及成品质量控制。

附图说明

图1为实施例1的对照品溶液中青蒿素B的MRM色谱图；

图2为实施例1的对照品溶液中青蒿烯的MRM色谱图；

图3为实施例1的对照品溶液中青蒿素的MRM色谱图；

图4为实施例1的对照品溶液中双氢青蒿酸的MRM色谱图；

图5为实施例1的对照品溶液中青蒿酸的MRM色谱图；

图6为实施例1的对照品溶液中青蒿醛的MRM色谱图；

图7为实施例1的对照品溶液中紫穗槐-4,11-二烯的MRM色谱图。

具体实施方式

以下将通过具体实施例来说明本发明，但本发明的范围不限于此。本领域技术人员根据常规技术对本发明所作出的改变，都在本发明的范围内。

如无具体说明，以下实施例中所使用的仪器和试剂，都是常规仪器和试剂，可以通过商购的方式获得；所使用的方法为常规方法，本领域技术人员根据实施例的内容，可以毫无疑义地知晓如何完成实施例内容并得到相应的结果。

仪器与试剂

液相色谱-三重四极杆质谱联用系统(Agilent，1290-6470)；ME155DU电子天平(梅特勒托利多仪器有限公司)；KQ-500B超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。

甲醇(质谱级，Fisher公司)，超纯水(屈臣氏蒸馏水)，甲酸(质谱级，Sigma公司)，甲酸铵(质谱级，Sigma公司)。

实施例1：

1)标准品溶液配制

取青蒿素、青蒿素B、青蒿酸、青蒿烯、双氢青蒿酸、青蒿醛、紫穗槐-4,11-二烯的标准品精密称定，置于5mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成1mg/mL的单标储备液；随后根据需要移取适量储备液，用甲醇稀释成适宜浓度的标准工作溶液，避光保存于4℃冰箱中。

分别吸取适量体积的上述标准工作溶液于5mL棕色容量瓶中，定容，得到青蒿素、青蒿素B、青蒿酸、青蒿烯、双氢青蒿酸、青蒿醛、紫穗槐-4,11-二烯组成的终浓度都为1μg/ml的混合标准品溶液。

2)供试品溶液的制备

准确称取黄花蒿(重庆野生种，CQ)叶片粉末样品50mg，加入2.5mL甲醇，振荡混合均匀，超声提取15min，静置5min后取上清液经0.22μm滤膜过滤。过滤后样品用甲醇稀释100倍。稀释前后的样品分别进样定量分析。

3)青蒿素类相关化合物的检测方法

使用液相色谱-三重四极杆质谱联用系统(Agilent，1290-6470)，其中，

(1)液相色谱条件：

色谱柱：Eclipse Plus C₁₈，RRHD 2.1×50mm，1.8μm；液相洗脱梯度：A相为含0.1％甲酸和5mM甲酸铵的水溶液，B相为甲醇；B相变化：0-8min，55％-100％；8-11min，100％；11-11.01min，100％-55％；11.01-14min，55％；流速：0.6mL/min；柱温：40℃；进样量：5μL。

(2)质谱条件：

大气压化学电离源(APCI)，正离子模式，干燥气温度：300℃，干燥气流速：4L/min，蒸发室温度：400℃，雾化器压力：50psi，毛细管电压：2500V，电晕针电流：4μA，采集模式为多反应监测模式(MRM)，七种青蒿素类相关化合物的出峰时间、母离子、子离子、碰撞能量和碎裂电压分别为：

*为定量离子

取上述1)或2)中配制的标准品或供试品溶液，采用上述液相色谱条件和质谱条件，进行质谱检测，再根据标准曲线即可得到供试品黄花蒿中七种青蒿素类相关化合物的含量。检测结果：

(1)标准曲线绘制结果

将1)配制的混合标准品溶液稀释至终浓度为100％、80％、40％、10％、4％、1％(6个)的系列浓度，采用超高效液相色谱-串联质谱仪器(Agilent，1290-6470)检测，采用上述液相色谱条件和质谱条件测定，得出化合物浓度与峰面积的关系，绘制对应的标准曲线并得到各化合物的线性范围结果(见表1)。通过标准品检测结果可见，本方法回归系数好，线性范围较宽，可以同时有效地检测七种化合物。

表1：7种青蒿素类相关化合物标准曲线、相关系数及线性范围结果

序号	中文名	线性方程	回归系数(R²)	线性范围(μg/mL)
					1	青蒿素B	y＝287.28x-396.32	1	0.01～1
2	青蒿烯	y＝124.71x-114.58	1	0.01～1
					3	青蒿素	y＝182.21x-425.35	0.9999	0.01～1
4	双氢青蒿酸	y＝75.107x-565.41	0.9994	0.01～1
					5	青蒿酸	y＝120.32x-1526.4	0.9998	0.01～1
6	青蒿醛	y＝112.73x-717.28	0.9992	0.01～1
					7	紫穗槐-4,11-二烯	y＝144.21x+491.79	0.9998	0.01～1

(2)精密度检测结果

取1)中配制的混合标准品溶液(200ng/mL)，连续进样6次，测定并计算7个化合物峰面积的RSD值。RSD均小于4％，表明仪器和方法精密度良好，结果见表2。

表2：精密度检测结果

序号	中文名	RSD％
			1	青蒿素B	3.4
2	青蒿烯	1.7
			3	青蒿素	2.4
4	双氢青蒿酸	2.9
			5	青蒿酸	3.5
6	青蒿醛	2.2
			7	紫穗槐-4,11-二烯	3.2

(3)方法重复性验证

准确称取黄花蒿(重庆野生种，CQ)叶片样品粉末50mg，平行制备供试品溶液6份，进行测定。供试品溶液中7种化合物浓度的RSD小于5％，表明该方法重现性良好，结果见表3。

表3：重复性考察

序号	中文名	RSD％
			1	青蒿素B	4.3
2	青蒿烯	4.0
			3	青蒿素	2.3
4	双氢青蒿酸	3.3
			5	青蒿酸	3.9
6	青蒿醛	4.8
			7	紫穗槐-4,11-二烯	4.7

(4)加样回收率验证

准确称取已知含量的黄花蒿(重庆野生种，CQ)叶片样品50mg，加入与叶片中所含的七种化合物量相等的各标准品，平行6次，按照2)所述的步骤提取和稀释，测定含量，计算七种化合物的平均回收率和相对标准偏差。七种化合物的平均回收率在80～120％之间，RSD小于9％，结果见表4。表4的结果进一步表明本发明方法的准确性，说明本发明方法可以有效检测这七种代表性化合物。

表4：加样回收率试验结果

实施例2：不同种质黄花蒿中青蒿素类相关化合物的含量测定

选取两个不同品种的黄花蒿样品粉末(海南野生种：HAN和吉林野生种：JL)，准确称取各粉末样品50mg，加入2.5mL甲醇，振荡混合均匀，超声提取15min，静置5min后取上清液经0.22μm滤膜过滤。过滤后样品用甲醇稀释100倍。稀释前后的样品分别按照实施例1的方法进样定量分析。采用标准曲线计算不同品种的黄花蒿中七种青蒿素类相关化合物的含量。

表5：不同品种的黄花蒿中七种青蒿素类相关化合物含量(n＝3)

其中，JL品种中青蒿醛和紫穗槐-4,11-二烯两个成分因含量过低未检测出来。从表5的数据可见，针对不同种质的黄花蒿，本发明方法都可以同时检测出青蒿素合成途径中具有代表性的七种化合物。

Claims

1.一种同时测定黄花蒿中七种青蒿素类相关化合物的方法，所述方法包括使用超高效液相色谱-串联质谱对黄花蒿提取物进行检测，所述七种青蒿素类相关化合物为青蒿素、青蒿素B、青蒿酸、青蒿烯、双氢青蒿酸、青蒿醛、紫穗槐-4,11-二烯，所述超高效液相色谱-串联质谱仪为液相色谱-三重四极杆质谱联用系统Agilent 1290-6470，所述方法包括：

液相色谱条件为：

色谱柱：Eclipse Plus C18，RRHD 2.1×50mm，1.8μm；液相洗脱梯度：A相为含0.1％甲酸和5mM甲酸铵的水溶液，B相为甲醇；B相变化：0-8min，55％-100％；8-11min，100％；11-11.01min，100％-55％；11.01-14min，55％；流速：0.6mL/min；柱温：40℃；进样量：5μL；

质谱条件为：

大气压化学电离源，正离子模式，干燥气温度：300℃，干燥气流速：4L/min，蒸发室温度：400℃，雾化器压力：50psi，毛细管电压：2500V，电晕针电流：4μA，采集模式为多反应监测模式，其中，七种青蒿素类相关化合物的出峰时间、母离子、子离子、碰撞能量和碎裂电压分别为：

*为定量离子；

所述黄花蒿提取物为黄花蒿甲醇提取物；

所述黄花蒿甲醇提取物的制备方法为：称取黄花蒿叶片粉末样品50mg，加入2.5mL甲醇，振荡混合均匀，超声提取15min，静置5min后取上清液经0.22μm滤膜过滤；

所述方法还包括：使用七种青蒿素类相关化合物标准品构建标准曲线，再根据标准曲线计算黄花蒿提取物中七种青蒿素类相关化合物的含量；

其中，构建标准曲线时，七种青蒿素类相关化合物每种的浓度范围为0.01～1μg/mL。