CN115015446B - 绿茶中l-茶氨酸、咖啡因、茶多酚和十六烷酸同时测定的方法 - Google Patents
绿茶中l-茶氨酸、咖啡因、茶多酚和十六烷酸同时测定的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于分析检测技术领域，涉及绿茶中L‑茶氨酸、咖啡因、茶多酚和十六烷酸同时测定的方法。本发明将茶叶样品经85℃热水浸泡后，用乙腈提取，N‑丙基乙二胺(PSA)和十八烷基硅烷(C18)为净化剂，结合气相色谱/串联三重四级杆质谱仪分析技术，实现了对绿茶品质化合物L‑茶氨酸、十六烷酸、咖啡因、茶多酚准确定性定量分析。本发明的检出限为0.001～0.005mg/kg，方法验证试验结果表明，所述化合物的平均回收率为67.3％～101.7％，相对标准偏差为1.03％～11.20％。通过对市售茶叶样品的检测，进一步验证本发明重现性好，准确度高，操作简单的优点，适用于绿茶中L‑茶氨酸、咖啡因、茶多酚和十六烷酸的同时检测。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及绿茶中L-茶氨酸、咖啡因、茶多酚和十六烷酸同时测定的方法。
背景技术
我国绿茶品种繁多，茶树品种不同，其茶多酚、氨基酸和咖啡碱等品质化学成分含量不同，酶的特性和芳香物质等的化学特性也不同，各理化成分种类和含量不一，而绿茶的风味是茶叶内含物相互作用、不断变化的结果，因此各类绿茶品质滋味均有差异，不同品种茶叶,各具特色的“品种香”。茶多酚是茶叶滋味和色泽的主要成分，是构成茶叶品质的关键性物质，绿茶鲜爽性的主要贡献物。茶叶氨基酸中，以茶氨酸含量最多，占氨基酸总量一半以上，是构成茶汤鲜味的主要成分，也是衡量茶叶品质优劣的重要生化成分。
近年来，诸多研究人员利用不同方法开展了茶叶品质鉴别分析研究。利用计算机视觉图像处理技术结合感官审评结果进行茶叶筛选评级，利用各种类型的电子舌结合不同的化学计量法和模式识别法对茶叶组分定性，电子鼻同样用于茶叶香气识别与品质等级的划分以及加工过程样的监测，气相色谱－嗅觉－质谱测定法(GC-O-MS)等通过定量描述感官分析，GC-MS和GC-O技术在四种功夫红茶中鉴定出64种挥发性化合物，在鉴定绿茶、普洱茶、乌龙茶的特征香气中也取得了较好的效果。
上述方法对茶叶进行品质分析仍以感官评定方法为基础，仪器分析多采用NIST库定性、归一法定量。然而，茶叶品质物理检验结果受主观因素影响，缺乏可参照的标准，重复性较差，常规色质联用分析采用NIST库定性、归一法定量，定性定量均存在不足。
发明内容
本发明的目的在于提供一种绿茶中L-茶氨酸、咖啡因、茶多酚和十六烷酸同时测定的方法，对绿茶品质特征化合物及其含量进行准确定性定量分析，并将北方绿茶与南方绿茶成分对比差异，综合分析以期明确各地绿茶茶叶品质特征，为各地绿茶品质鉴别提供理论依据。
本发明所述的绿茶中L-茶氨酸、咖啡因、茶多酚和十六烷酸同时快速测定的方法，其特征在于，采用气相色谱/串联三重四级杆质谱法对样品进行检测，包括以下步骤：
绿茶中L-茶氨酸、咖啡因、茶多酚和十六烷酸同时测定的方法，其特征在于，采用气相色谱/串联三重四级杆质谱法对样品进行检测，包括以下步骤：
(1)检测条件：
(1-1)色谱条件
色谱柱：HP-5MS，30m×0.25mm i.d.,0.25μm，弹性石英毛细管柱；载气：高纯氦气；碰撞气：高纯氮；流速：1.1ml/min；进样方式：不分流进样；进样口温度：250℃；柱温：初始50℃保持1min，再以10℃/min程序升温至150℃，再以20℃/min程序升温至280℃；进样口温度：260℃；进样量1.0μL；
(1-2)质谱条件
离子源：电子电离源；离子源温度：230℃；四级杆质量分析器温度150℃；传输线温度280℃；溶剂延迟：3min；检测方法：多反应监测模式：运行时间23.5min，后运行5min；
(2)标准溶液配制
(2-1)准确称取各化合物标准品，用甲醇溶解，配制质量浓度为1000mg/L的标准储备液，于-18℃保存；移取各化合物的标准储备液1mL，用丙酮+正己烷溶解，配置成浓度为10mg/L的中间液，于0～4℃避光保存；
(2-2)标准工作液的配制：
准确移取各化合物的标准储备液，用丙酮+正己烷稀释成0.01，0.02，0.050，0.10，0.50，1.0，5.0，10.0mg/L标准工作液，现配现用；
(3)待检样品前处理
称取茶叶试样，置于离心管中，加入85℃水浸泡后加入乙腈振荡提取，涡旋，离心，取上清液，加入净化粉末，涡旋，过滤，蒸除溶剂，准确加入丙酮+正己烷定容后，过滤膜，得滤液，供上机分析；
(4)待检样品检测
将步骤(3)获得的滤液进行检测，测定滤液中L-茶氨酸、咖啡因、茶多酚和十六烷酸的含量。
本发明所述的绿茶中L-茶氨酸、咖啡因、茶多酚和十六烷酸同时快速测定的方法，丙酮与正己烷的体积比为3:7。
优选的，待检样品前处理的具体过程为：称取2.0g茶叶试样，置于50mL离心管中，加入20ml 85℃水浸泡30min后加入20mL乙腈振荡提取30min，加入5g氯化钠涡旋1min，以5000r/min离心5min，取上清液10mL，加入400mgPSA、400mgC18QuEChERS净化粉末，涡旋30s，过滤，旋转蒸发蒸除溶剂，准确加入2.0mL丙酮+正己烷定容后，过0.22um滤膜，得滤液，供上机分析。
本发明采用的仪器与设备为：7000B GC-MS/MS气相色谱/串联三重四级杆质谱仪美国安捷伦科技有限公司、IKAK S260振荡器德国IKA公司、Buchi旋转蒸发仪瑞士Buchi公司、TDL-40B离心机上海安亭科学仪器厂、IKAMS3 basic涡旋混匀器德国IKA公司。
本发明采用的材料与试剂为：茶叶样品：日照绿茶(日照百润茶行)、南京绿茶(市售)、杭州龙井(市售)乙腈(色谱纯)美国TEDIA；丙酮(色谱纯)德国Merck；正己烷(色谱纯)德国Merck；氯化钠(分析纯)西陇化工股份有限公司；十六烷酸、L-茶氨酸、茶多酚、上海麦克林生化科技有限公司；咖啡因，质量浓度为1000ug/mL，北京坛墨质检科技有限公司；QuEChERS dSPE美国安捷伦科技有限公司。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.该方法的建立可以对绿茶品质组分L-茶氨酸、十六烷酸、咖啡因、茶多酚进行更准确定性定量，克服了传统绿茶品质分析方法受人为因素影响及定性定量准确性差等缺点，且操作简单、准确、快速、方法学参数良好，可用于各地绿茶品质组分准确定性和定量分析。
2.该方法的建立可以对绿茶品质组分L-茶氨酸、十六烷酸、咖啡因、茶多酚进行更准确定性定量，能够将日照绿茶与南方绿茶品质进行准确区分，解决了绿茶市场出现以次充好、以假乱真等问题，为各地绿茶品质鉴别提供技术支持，对绿茶贸易发展具有重要价值。
附图说明
图1为不同溶剂对茶多酚、咖啡因提取含量的影响；
图2为不同溶剂L-茶氨酸、十六烷酸提取含量的影响；
图3为不同净化剂对茶多酚、咖啡因含量的影响
图4不同净化剂L-茶氨酸、十六烷酸含量的影响
图5为L-茶氨酸MRM图；
图6为咖啡因MRM图；
图7为茶多酚MRM图；
图8为十六烷酸MRM图；
图9为日照春茶4种化合物含量分析。
具体实施方式
实施例1前处理条件的优化
1、绿茶样品称样量的选择
(1)称取4.00g绿茶试样，置于100mL离心管中，加入40mL85℃蒸馏水静置30min，加入40mL乙腈振荡提取30min，加入10g氯化钠涡旋1min，以5000r/min离心5min，取上清液20mL，加入400mgPSA、400mgC18QuEChERS净化粉末，涡旋30s，过滤至鸡心瓶,旋转蒸发至近干，准确加入2.0mL丙酮+正己烷(30+70，体积比)定容后，过0.22um滤膜，并上机测定。
(2)称取2.00g绿茶试样，置于50mL离心管中，加入20mL 85℃蒸馏水静置30min，加入5g氯化钠涡旋1min，以5000r/min离心5min，取上清液10mL，加入400mgPSA、400mgC18QuEChERS净化粉末，涡旋30s，过滤至鸡心瓶，旋转蒸发至近干，准确加入2.0mL丙酮+正己烷(30+70，体积比)定容后，过0.22um滤膜，得滤液，上机测定。
试验发现，4.0g样品经蒸馏水浸泡后样品量较大，提取净化药品试剂消耗量过大，试验过程操作更为繁琐；提取液上机检测，样品中咖啡因、茶多酚含量较高，色谱柱过载，色谱峰形差，导致定量不准确等问题，试验最终确定称样量为2.0g。
2、提取溶剂的优化
茶叶呈香品质组分分析一般采用顶空进样法，而日常饮茶过程中，易挥发呈香化合物在茶汤中含量与干基含量却不相同。绿茶的冲泡温度建议85℃，为更大程度还原人体摄入茶汤中品质组分含量，本试验增加了85℃热水浸泡步骤，充分提取茶叶中品质化合物。
根据茶叶中待测组分的化学性质，本实验采用甲醇、乙酸乙酯、丙酮、0.5％(V/V)甲酸乙腈、乙腈作为提取溶剂，其它条件相同对同一绿茶样品提取效果进行考察。甲醇因极性较强可提取多种极性组分，提取液呈浑浊状态；丙酮可提取多种高色素组分，其提取液颜色为深绿色；乙酸乙酯提取过程色素类化合物较少，根据相似相容原理可提取部分脂类化合物其提取液呈透明浅绿色；酸化乙腈在提取过程中与茶汤中部分碱性化合物反应，提取液呈褐色。上述4种品质化合物不同提取剂提取结果见图表，结果表明乙腈提取绿茶中咖啡因、茶多酚含量最高、效果最好，综合考察提取率及后期净化效果确定乙腈为绿茶提取溶液。
表1不同溶剂对4种化合物提取含量的影响
3、净化条件的优化
茶叶基质复杂，常规茶叶基质前处理方法主要有QuEChERS法和固相萃取法净化，QuEChERS法因其操作简单、试剂消耗少、污染小等优点被推广使用。应用QuEChERS方法进行前处理分析时，常用N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基硅烷(C18)、石墨化炭黑(GCB)3种材料作为吸附剂，PSA能够去除基质中的有机酸、色素、金属离子，C18能够吸附脂肪和脂类等弱极性干扰物，GCB主要吸附基质中的色素。
实验选取同一茶叶样品，按照相同样品前处理过程，以无吸附剂的空白组为对照，分别组合选取PSA、C18和GCB为净化材料，比较不同吸附剂组合对同一样品中4种化合物含量的影响，图表结果显示，不同种类的吸附剂对4种绿茶中品质化合物影响明显，GCB可去除样品中色素类化合物但对茶多酚和十六烷酸吸附较大，C18可以有效去除绿茶中脂类化合物，且可以有效提高非脂溶性化合物茶多酚和咖啡因的提取率，因而使用PSA+C18时，可以有效吸附绿茶中脂类化合物、有机酸等共提取物，提高目标分析物的提取率。
表2不同净化剂对4种化合物含量的影响
从实验结果可以看到，PSA+C18为最佳净化组合，所以选择PSA+C18混合吸附剂作为本方法的净化剂。选取100mgPSA+100mg C18、200mg PSA+200mg C18、300mg PSA+300mgC18、400mgPSA+400mg C18、500mg PSA+500mg C18对净化剂用量进行优化。随着净化剂用量的增加，目标分析物的提取率有所提高。综合考虑4种目标分析物的提取率、经济效益、净化效果，最终净化材料的使用量为400mg PSA+400mg C18。
实施例2GC/MS/MS质谱条件的优化
按照欧盟方法学标准，质谱方法定性至少达到4个识别点要求才能准确定性，定性点越多定性越准确。对于三重四级杆质谱MRM监测模式下，至少选择2个离子对进行定性，1对离子对计为2～2.5个定性点，1个母离子加上2个子离子识别点为4,2个母离子，且每个有1个子离子识别点为5。本试验将4种标准溶液配置为10ug/mL的溶剂标准溶液进行全扫描，确定每种化合物的保留时间，并从每种化合物的一级质谱图中选择丰度高、m/z大的母离子碎片，在不同碰撞能量下对母离子进行碰撞解离，选取1组定量离子对和2组定性离子对，按照计算可以达到目标物识别点>4个，提高了定性准确性。
表3 4种化合物色谱保留时间、质谱条件
注：*Quantiative ion
气相色谱/串联三重四级杆质谱检测0.10mg/L4种绿茶中品质化合物标准溶液所得MRM谱图如图5-8所示。
实施例3方法学验证
1线性关系范围与检出限
试验以信噪比S/N＝3和S/N＝10所对应浓度，计算L-茶氨酸、茶多酚、咖啡因和十六烷酸的检出限(limit ofdetection,LOD)和定量限(limit ofquantitation,LOQ)。绿茶中4种品质化合物的检出限为0.001～0.005mg/kg，以目标组分的峰面积Y对相应的质量浓度X(mg/L)，采用溶剂标准溶液绘制了0.01，0.02，0.050，0.10，0.50，1.0，5.0，10.0mg/L的标准工作曲线，其线性相关系数良好(R2＞0.99)，表明4种化合物在气相色谱/串联三重四级杆质谱法检测中具有较好的线性关系，该方法的灵敏度可满足方法学要求。各化合物线性方程、线性相关系数、线性范围和检出限见表4。
表4 4种化合物的线性回归方程、相关系数、线性范围、检出限、基质效应
2回收率和精密度
根据方法学验证要求，试验选取市售南京绿茶为基质，绿茶中咖啡因和茶多酚含量较高，色谱柱过载，峰形较差，定量准确率低，在定量分析时对原始上机液稀释10倍后上机检测。分别添加0.010、0.020、0.100mg/kg三个不同水平的4种化合物标准溶液，每个加标浓度水平平行测定6次，以溶剂配制的标准曲线计算加标样品的浓度，并计算回收率和精密度(relative standard deviation，RSD)，其平均回收率及相对标准偏差见表5。由表5可知，方法的平均回收率在67.3％～101.7％之间，相对标准偏差在1.03％～11.20％之间，表明该方法的准确度高，稳定性好，通用性较强。
表5不同加标水平下4种化合物的加标回收率与相对标准偏差(n＝6)
实施例4对比例
近年来随着茶叶品质化合物分析技术的发展，出现了光学探针分析茶叶中茶多酚类化合技术，但该方法操作繁琐，且仅能对茶多酚类化合物定性，不满足对茶多酚含量的准确定量。色谱法或色质联用技术在茶叶品质化合物测定中也得到广泛应用，该类方法可分析茶叶干物质中茶多酚等组分，采用保留时间定性，归一法定量，该方法对茶叶组分中单一化合物无法准确定量，且保留时间定性准确率低。近红外光谱技术分析茶叶中茶多酚、氨基酸等组分，该方法对于茶叶中具体化合物的定性和定量分析仍存在不足。以上茶叶化学品质分析存在前处理操作复杂、测试时间长效率低，测定结果准确性差等问题。
本方法最大程度还原饮用绿茶中L-茶氨酸、咖啡因、茶多酚、十六烷酸化合物的含量，采用气相色谱/串联三重四级杆质谱仪多反应监测模式(MRM)，选取1组定量离子对和2组定性离子对，对目标组分进行精确定性，定性检测准确性远大于光谱法和常规色谱法，外标法定量其结果准确性优于归一法定量，且该方法同时可以测定茶叶中咖啡因、茶多酚、L-茶氨酸、十六烷酸含量，测定化合物目标明确、操作简单、数据直观、定量定性更准确，通过品质化合物具体含量数值比对能够更快速区分茶叶品质。
实施例5绿茶实际样品分析
利用本发明建立的方法对日照奎山、巨峰、三庄三地三季日照绿茶20个样本作为主要研究对象，选用市售南京绿茶、杭州龙井作为辅助研究对象，对南北方绿茶品质进行分析。
表6绿茶中4种品质组分分析
试验发现，日照绿茶春茶中品质化合物含量：L-茶氨酸0.06～0.10mg/kg、十六烷酸0.03～0.08mg/kg>、咖啡因24～49mg/kg、茶多酚23～43mg/kg。茶多酚和咖啡因随季节变化较大，春茶最高秋茶含量最低，早春茶含量为秋茶2倍；十六烷酸呈先增加再减少又增加趋势，其含量随季节变化明显，温差越大十六烷酸越容易富集，随着温度升高富集能力下降，秋季温度下降，昼夜温差增大后含量逐步提升。沿海春季温度提升较内陆慢，且昼夜温差较内陆小，因而同期沿海绿茶各组分含量低于内陆同期绿茶，南方绿茶与北方绿茶相比L-茶氨酸、咖啡因、茶多酚品质化合物较低，其含量仅接近北方绿茶代表日照绿茶秋茶。
Claims (3)
1.绿茶中L-茶氨酸、咖啡因、茶多酚和十六烷酸同时测定的方法，其特征在于，采用气相色谱/串联三重四级杆质谱法对样品进行检测，包括以下步骤：
(1)检测条件：
(1-1)色谱条件
色谱柱：HP-5MS，30m×0.25mm i.d.,0.25μm，弹性石英毛细管柱；载气：高纯氦气；碰撞气：高纯氮；流速：1.1ml/min；进样方式：不分流进样；进样口温度：250℃；柱温：初始50℃保持1min，再以10℃/min程序升温至150℃，再以20℃/min程序升温至280℃；进样口温度：260℃；进样量1.0μL；
(1-2)质谱条件
离子源：电子电离源；离子源温度：230℃；四级杆质量分析器温度150℃；传输线温度280℃；溶剂延迟：3min；检测方法：多反应监测模式：运行时间23.5min，后运行5min；
(2)标准溶液配制
(2-1)准确称取各化合物标准品，用甲醇溶解，配制质量浓度为1000mg/L的标准储备液，于-18℃保存；移取各化合物的标准储备液1mL，用丙酮+正己烷溶解，配置成浓度为10mg/L的中间液，于0～4℃避光保存；
(2-2)标准工作液的配制：
准确移取各化合物的标准储备液，用丙酮+正己烷稀释成0.01，0.02，0.050，0.10，0.50，1.0，5.0，10.0mg/L标准工作液，现配现用；
(3)待检样品前处理
称取茶叶试样，置于离心管中，加入85℃水浸泡后加入乙腈振荡提取，涡旋，离心，取上清液，加入N-丙基乙二胺、十八烷基硅烷，涡旋，过滤，蒸除溶剂，准确加入丙酮+正己烷定容后，过滤膜，得滤液，供上机分析；
(4)待检样品检测
将步骤(3)获得的滤液进行检测，测定滤液中L-茶氨酸、咖啡因、茶多酚和十六烷酸的含量。
2.根据权利要求1所述的绿茶中L-茶氨酸、咖啡因、茶多酚和十六烷酸同时测定的方法，其特征在于，丙酮与正己烷的体积比为3:7。
3.根据权利要求1所述的绿茶中L-茶氨酸、咖啡因、茶多酚和十六烷酸同时测定的方法，其特征在于，待检样品前处理的具体过程为：称取2.0g茶叶试样，置于50mL离心管中，加入20ml 85℃水浸泡30min后加入20mL乙腈振荡提取30min，加入5g氯化钠涡旋1min，以5000r/min离心5min，取上清液10mL，加入400mgN-丙基乙二胺、400mg十八烷基硅烷，涡旋30s，过滤，旋转蒸发蒸除溶剂，准确加入2.0mL丙酮+正己烷定容后，过0.22um滤膜，得滤液，供上机分析。
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