CN116148385A - 一种同时检测黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种同时检测黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸含量的方法，采用超声辅助提取法对黑蒜进行提取，得提取液；所得提取液经固相萃取后进行PITC衍生化，衍生化处理后得样品液；对所得样品液进行UPLC‑MS检测，经计算分别得到黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸含量。

Description

一种同时检测黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸含量 的方法

技术领域

本发明属于分析检测领域，具体涉及一种UPLC-MS(超高效液相色谱-单四级杆质谱法)结合柱前衍生化同时检测黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸含量的方法。

背景技术

黑蒜又名黑大蒜、发酵黑蒜，是由新鲜生蒜为原料，在高温高压的环境中发酵而来的大蒜深加工制品。大蒜发酵完成后，其蒜瓣变为黑褐色，刺激性气味和辛辣感消失，口感软糯、香甜。大量研究表明，同大蒜相比，发酵后的黑蒜生物活性增强，且多种营养物质含量增加，具有抗氧化、抗肿瘤、保护肝脏、调节血糖血脂水平、抗过敏、抗炎等生理功能。

硒是人体必需的微量元素之一，参与了人体多项生理活动过程，对人体健康十分重要。硒摄入量不足，会使人体免疫力下降，引起多种疾病，如：克山病、大骨病、地方性心肌炎等，硒过量则会导致人体中毒。因此，人体及时补充适量的硒是至关重要的。硒分为无机硒和有机硒，有机硒因低毒性、高生物活性，更适合人体吸收利用。从植物中获取硒，是目前公认的人体摄取硒的最主要途径。植物中的有机硒主要以硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸的形式存在。黑蒜因含硒而成为大众青睐的补硒食物之一，因此能够快速准确检测黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸的含量，可以为黑蒜质量和安全性评价提供重要参考依据。

目前，硒代蛋氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸的检测方法主要有气相色谱-质谱法、液相色谱-原子荧光光谱法、高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法。目前，尚未见黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸PITC衍生化检测的方法。

发明内容

本发明提供一种同时检测黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸含量的方法，本发明拟通过优化提取、萃取、衍生化条件参数，建立一种基于柱前PITC衍生化的高效液相色谱-单四级杆质谱法，同时快速检测黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸含量，并对5个不同产地黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸含量进行分析，为黑蒜质量提供参考依据。

一种同时检测黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸含量的方法，包括：

(1)将黑蒜去皮、均匀碾压成泥状后真空干燥；取干燥后的黑蒜并按比例加入甲醇水溶液，充分混匀后在20～50℃下超声10～40min；离心分离后取上清液；

(2)将所得上清液经固相萃取并以甲醇水溶液进行洗脱，收集所有洗脱液；将所得洗脱液旋蒸浓缩后再次溶解于甲醇水溶液中，混匀后过滤取滤液(提取液)；

(3)向所得滤液(提取液)中加入内标溶液、三乙胺乙腈溶液以及PITC乙腈溶液，充分混匀后20～60℃进行衍生化反应1～3h；反应结束后取上清液于自动进样瓶，待测；；

(4)将所得待测样品液进行UPLC-MS检测，记录吸收峰面积并代入标准曲线，计算得到黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸各自的含量。

本发明的方法，采用超声辅助提取法对黑蒜进行提取，得提取液；所得提取液经固相萃取后进行PITC衍生化，衍生化处理后得样品液；对所得样品液进行UPLC-MS检测，经计算得到黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸含量。

可选的，步骤(1)中，所述甲醇水溶液为体积百分比为0～80％的甲醇水溶液；黑蒜与甲醇水溶液的质量体积比为1g:10～25mL。

可选的，步骤(2)中，所述甲醇水溶液为体积百分浓度为10～80％的甲醇水溶液。

可选的，步骤(1)中，所述甲醇水溶液为体积百分浓度为20％的甲醇水溶液；黑蒜与甲醇水溶液的质量体积比为1g:10mL；充分混匀后在40℃下超声30min；步骤(2)中，所述甲醇水溶液为体积百分浓度为40％的甲醇水溶液。

可选的，步骤(3)中滤液、三乙胺乙腈溶液和PITC乙腈溶液的体积比为5:2.5:1；其中三乙胺乙腈溶液中三乙胺的浓度为1mol/L；PITC乙腈溶液中PITC的浓度为0.1mol/L。

可选的，步骤(3)中，所述内标溶液为蛋氨酸-D3。

可选的，所述内标溶液的浓度1mg/mL；所述内标溶液的加入量与滤液的体积比为0.5：5。

可选的，衍生化反应的温度20℃，衍生化反应的时间1h。

可选的，步骤(4)中，检测条件为：

色谱条件：ACOQUITY

BEH C18色谱柱；流速：0.3mL·min^-1；柱温：45℃；进样量：5μL；检测波长：338nm；流动相：乙腈A-0.01％甲酸水溶液B，梯度洗脱；

质谱条件：电喷雾离子源采用负离子检测；电喷雾毛细管电压设定为3.0kV，氮气用作溶剂蒸发的干燥气体，蒸发温度为172℃，离子传输管温度为300℃，选择性离子监测模式。

可选的，所述滤液(提取液)中硒代蛋氨酸浓度为0.019-1.25μg·mL^-1、硒甲基硒代半胱氨酸浓度为0.078-5.00μg·mL^-1，该条件下线性关系良好。

与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果之一：

(1)本发明选择成本较低、操作简单、耗时较短的超声辅助水提法提取黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸，并从提取溶剂、料液比、提取时间、提取温度四个方面对提取方法进行优化。结果显示当提取溶剂20％甲醇、料液比选择1:10、提取时间为30min、提取温度为40℃时硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸含量最高。

(2)黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸含量较少，本发明选择采用柱前衍生化氨基酸方法提高黑蒜样品中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸检测的灵敏性和特异性；相较于柱后衍生化方法(需要专用氨基酸分析仪)，成本低且灵敏度高，便于实验室应用。

(3)本发明选择PITC为衍生化试剂，进行衍生化反应检测黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸，PITC衍生化法具有良好的选择性，可以与一级氨基酸和二级氨基酸同时反应，衍生化产物稳定性较好，且反应条件温和，成本低廉。

(4)本本发明研究过程中发现LC-MS方法基质影响干扰较大，具有较强的离子抑制效应，因此本发明选用同位素蛋氨酸为内标。

(5)目前尚未见PITC衍生化同时检测黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸的方法，本发明建立了基于超高液相色谱-串联单四级杆质谱技术测定黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸的分析方法，硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸浓度分别在0.019-1.25μg·mL^-1、0.078-5.00μg·mL^-1下线性关系良好，相关系数R²在0.9995～0.9996，检出限分别为4.844mL、0.605ng/mL。

附图说明

图1为硒代蛋氨酸PITC衍生化示意图(A)和硒甲基硒代半胱氨酸PITC衍生化示意图(B)；

图2为实施例2中不同提取条件对硒代蛋氨酸提取效率影响结果图(其中A为不同提取溶剂的结果对比；B为不同料液比的结果对比；C为不同提取时间的结果对比；D为不同提取温度的结果对比)；

图3为实施例3中不同洗脱试剂对硒代蛋氨酸萃取效率影响结果图；

图4为实施例4中不同衍生化条件对衍生化产物的影响结果图(其中A为不同衍生化时间的结果对比；B为不同衍生化温度的结果对比)；

图5为实施例5中硒代蛋氨酸(A)、硒甲基硒代半胱氨酸(B)和内标：蛋氨酸-D3d3(C)的色谱图(其中，左图，空白对照的色谱图；中图，黑蒜样品的色谱图；右图，标准品的色谱图)。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。

材料与试剂

5份黑蒜(市售，样品信息见表1)。

硒代蛋氨酸标准品购自Sigma-Aldrich公司；硒甲基硒代半胱氨酸标准品购自麦克林公司；蛋氨酸-D3d3购自Sigma-Aldrich公司；邻苯甲二醛购自东京化成工业株式会社；巯基丙酸购自北京百灵威科技有限公司；三乙胺购自北京百灵威科技有限公司；乙腈(分析纯)、甲醇(分析纯)均购自北京百灵威科技有限公司；甲酸购自东京化成工业株式会社；超纯水；市售黑蒜。

表1样品信息

仪器与设备

TGL-16B高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；XH-B漩涡混合器(江苏天翎仪器有限公司)；DW-86L338J医用低温保存箱(青岛海尔生物医疗股份有限公司)；KM-410C超声波清洗机(KM-410C超声波清洗机)；CV100-DNA真空离心浓缩仪(北京吉艾姆科技有限公司)；Varian 600M核磁共振仪(美国瓦里安公司)；XH-B漩涡混合器(江苏天翎仪器有限公司)；单四极杆液质联用仪(美国赛默飞世尔科技公司)；ACOQUITY

BEH C18色谱柱(美国赛默飞世尔科技公司)；ME104E分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；SPE-24D固相萃取仪)(上海熙扬仪器有限公司)；C18固相萃取小柱(美国赛默飞世尔科技公司)；无油真空泵(上海熙扬仪器有限公司)；DZF-6050真空干燥箱(巩义市予华仪器有限责任公司)；2XZ-2旋片式真空泵(临海市谭氏真空设备有限公司)

溶液配制

精密称取硒代蛋氨酸10mg、硒甲基硒代半胱氨酸10mg，用80％(v/v)甲醇溶解并定容于10mL容量瓶中，摇匀得1mg/mL的标准储备液，4℃储存：使用时用80％(v/v)甲醇配制一系列不同浓度标准工作液，现配现用；精密称取蛋氨酸-d3 10mg，用80％(v/v)甲醇溶解并定容于10mL容量瓶中，摇匀得1mg/mL的标准储备液，4℃储存。

实施例1

(1)黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸的提取与固相萃取

提取：选取一定量的黑蒜样品(该实施例以表1中S1进行试验)，去皮，均匀碾压成泥状，放于4℃条件下保存备用。放于真空干燥箱内烘干24h后，准确称取黑蒜样品0.20g，准确加入2.003.00mL 20％(v/v)甲醇，剧烈涡旋10min，在40℃下超声10min，于离心机中10000rp/m离心15min后，分别取上清液2mL加入，至5ml离心管中，待净化。

固相萃取：依次用2mL甲醇和2mL水活化SPE小柱，随后移取2mL上一步提取的提取液至柱中，用1mL 40(v/v)％甲醇水溶液以1ml/min的速度洗脱样品，收集全部洗脱液。洗脱液采用旋转蒸发仪浓缩至近干，用200μL 20％甲醇水溶液溶解，涡旋混匀后，过0.45μm滤膜，滤液置于离心管中，待衍生化。(2)硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸PITC衍生化

取200μL的标准品溶液或固相萃取净化后的黑蒜提取液，向其中分别加入20μL的内标溶液(DL-蛋氨酸-D3)、100μL三乙胺乙腈溶液(其中三乙胺浓度为1mol/L)以及40μLPITC乙腈溶液(其中PITC浓度为0.1mol/L)，剧烈涡旋混匀后室温静置1h进行衍生化反应(图1)。反应完成后加入800μL正己烷萃取多余的PITC。涡旋混匀后静置10min，待分层后取下层PITC衍生物溶液50μL加入450μL含0.1％甲酸的20％(v/v)乙腈溶液，混匀后13000rpm/min离心10min，取上清液200μL于自动进样瓶，待测。

(3)UPLC-MS检测

检测条件

色谱条件：ACOQUITY

BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm)；流速：0.3mL·min-1；柱温：45℃；进样量：5μL；检测波长：338nm；流动相:乙腈(A)-0.01％甲酸水溶液(B)，梯度洗脱，洗脱程序见表2。

质谱条件：电喷雾离子源采用负离子检测；电喷雾毛细管电压设定为3.0kV，氮气用作溶剂蒸发的干燥气体，蒸发温度为172℃，离子传输管温度为300℃，选择性离子监测模式(SIM)，各检测物质衍生化后的定量分析参数见表3。

表2液相色谱梯度洗脱程序

表3衍生化后物质质谱参数

(4)线性关系与定量限

将硒代蛋氨酸标准品溶液逐级稀释成1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039、0.019μg/ml的系列标准工作液，将硒甲基硒代半胱氨酸标准品溶液逐级稀释成5.00、2.50、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078μg/ml的系列标准工作液，按上述方法制备后进样检测，以标准品浓度为横坐标，吸收峰面积为纵坐标做标准曲线，计算得到的线性方程、线性系数和线性范围。

再分别以3倍信噪比(S/N＝3)和10倍信噪比(S/N＝10)确定检出限(LOD)及定量下限(LOQ)。线性关系、检出限和定量限测定结果见表4。

由表4可知，硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸在0.019～5.00ug/ml线性范围内均呈现良好的线性关系，相关系数R²≥0.9995，检出限分别为4.844ng/ml、0.605ng/ml，定量限分别为14.532ng/ml、1.815ng/ml。

表4硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸的线性方程、线性系数、线性范围检出限和定量限

(5)精密度、基质效应和加标回收率

标准品0.313μg/mL、0.625μg/mL、1.250μg/mL衍生化后产物在同一天分别测试5次，结果显示平均RSD小于5％，24小时内小于8％。36和48小时超过10％，说明样品最好在衍生化24小时内检测。在200μl黑蒜提取液和80％溶剂中分别加入20μl等浓度内标溶液，按上述方法进行衍生化后，对产物峰面积IS-PITC进行测定，平行6次，计算基质效应。

结果表明该方法的基质效应值为56.07+0.11％，表示该方法基质影响干扰较大，具有较强的离子抑制效应，必须用同位素内标进行定量检测。在提取液中分别加入0.625μg/mL、1.250μg/mL，2.50μg/mL3种浓度的混合标准溶液，与样品一起进行前处理和测定，每个样品浓度平行测定3次。结果显示硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸回收率在71.4％～91.4％之间。该方法显示，虽然用同位素蛋氨酸为内标，但由于离子抑制作用较大，加标回收率在低浓度和高浓度时偏低在浓度为1.25ug/mL时加标回收率为91.4％，表明该可以满足黑蒜中硒代蛋氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸的定性、定量检测，最好在0.8-2.0ug/mL的浓度范围内进行检测。

实施例2提取的优化

该条件优化实施例中黑蒜均以表1中的S1进行试验。

参照实施例1的试验过程，首先比较了不同提取溶剂对提取效率的影响。选择料液比1g：15mL，提取方式为超声，提取时间20min，提取温度30℃，研究提取溶剂为纯水、20％甲醇(v/v)、40％甲醇(v/v)、80％甲醇(v/v)时(其他同实施例1的提取步骤)，提取液中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸的含量变化。结果如图2中A所示。由图2中A可知，不同提取剂对硒代蛋氨酸的提取无明显影响、当提取溶剂为20％(v/v)甲醇时，固相萃取后的提取液中硒代蛋氨酸含量(对应图2中A的纵坐标)最高，因此选择20％(v/v)甲醇作为硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸提取溶剂。

同时，比较了当料液比(提取步骤中黑蒜与20％(v/v)甲醇的质量体积比(g：mL))分别为：1g:10mL、1g:15mL、1g:20mL、1g:25mL时(其他同实施例1的提取步骤)，黑蒜样品中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸含量的变化，结果如图2中B所示。由图2中B可知，随着料液比的增加，固相萃取后的提取液中硒代蛋氨酸的含量(对应图2中B的纵坐标)逐渐降低，因此硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸的料液比选择1g:10mL较合适。

然后，比较了当提取时间分别为10min，20min，30min，40min时(其他同实施例1的提取步骤)，黑蒜样品中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸含量的变化，结果如图2中C所示。由图2中C可知，随着提取时间的增加，固相萃取后的提取液中硒代蛋氨酸含量(对应图2中C的纵坐标)呈逐渐上升趋势，提取时间为30min时固相萃取后的提取液中硒代蛋氨酸含量最高，因此选择30min作为硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸的提取时间。

最后，本实施例比较了当提取温度分别为10℃，20℃，30℃，40℃时(其他同实施例1的提取步骤)，黑蒜样品中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸含量的变化，结果如图2中D所示。由图2中D可知，随着提取温度的增大，固相萃取后的提取液中硒代蛋氨酸含量(对应图2中D的纵坐标)逐渐上升，当提取温度为40℃时，固相萃取后的提取液中硒代蛋氨酸含量最高。因此选择40℃作为硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸的提取温度。

图2的整体结果显示，当提取溶剂20％甲醇、料液比选择1g:10mL(提取步骤中黑蒜与20％甲醇的质量体积比(g：mL))、提取时间为30min、提取温度为40℃时固相萃取后的提取液中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸含量最高。

实施例3固相萃取的优化

该条件优化实施例中黑蒜均以表1中的S1进行试验。

在固相萃取过程中，洗脱是关键因素之一。本实施例比较了不同萃取溶剂对萃取效率的影响。选择洗脱溶剂为10％甲醇(v/v)、20％甲醇(v/v)、40％甲醇(v/v)、60％甲醇(v/v)、80％甲醇(v/v)进行萃取效果对比(其他萃取条件参照实施例1的萃取步骤)。研究固相萃取过程中，提取步骤参照实施例2确定的最优提取条件：提取溶剂20％甲醇、料液比选择1g:10mL(提取步骤中黑蒜与20％甲醇的质量体积比(g：mL))、提取时间为30min、提取温度为40℃。

结果如图3所示，随着甲醇体积分数的增加，固相萃取后的提取液中硒代蛋氨酸含量(对应图3中的纵坐标)升高，当洗脱溶剂为40％甲醇时硒代蛋氨酸含量升高，随后开始降低当洗脱溶剂为80％甲醇时，固相萃取后的提取液中的硒代蛋氨酸含量最低。因此实验选择40％甲醇溶液为洗脱溶液。

实施例4

参照实施例1中的PITC衍生化方法进行衍生方法的优化，黑蒜选择表1中的S1。本实施例分别考察了不同衍生化时间(1h、1.5h、2h、2.5h、3h)(其他同实施例1的PITC衍生化过程)、不同衍生化温度(20℃、40℃、60℃)(其他同实施例1的PITC衍生化过程)对衍生化产物的影响，以确定最佳的衍生化时间和温度。

其他操作均同实施例1。

结果如图4所示。由图4中A可知，衍生化时间对衍生化结果影响较小，衍生化时间为1h衍生化产物较稳定。由图4中B可知，随着衍生化温度的升高衍生化产物产率降低，衍生化温度为20℃时，衍生化产物较稳定。因此硒半胱氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸的衍生化反应在20℃下，反应1h时，衍生化产物最稳定，为衍生化最佳条件。

实施例5

不同产地黑蒜样品含量测定结果。

准备编号S1-S5(表1)的5个产地黑蒜样品各5份，每份0.2g，按照实施例2中最优提取条件对各产地黑蒜进行提取，按照实施例3中最优萃取方法对黑蒜提取液进行净化，再按照实施例4中最优衍生化方法对萃取后提取液进行衍生化，最后按照实施例1色谱和质谱条件进样，空白对照、典型黑蒜样品和标准样品中硒代蛋氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸和内标：蛋氨酸-d3测定高效液相色谱图分别如图5所示，测定各产地黑蒜样品中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸的平均含量结果见表5。

表5.样品含量测定结果

由表5可知，5个产地的黑蒜样品中均检测出硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸。其中，青海产黑蒜中硒代蛋氨酸含量最高，云南产黑蒜硒代蛋氨酸含量最低；江苏产黑蒜中硒甲基硒代半胱氨酸含量最高，青海产黑蒜次之，云南产黑蒜中硒甲基硒代半胱氨酸含量最低。说明青海产黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸含量均较高。

综上：

(1)本发明实验选择成本较低、操作简单、耗时较短的超声辅助水提法来提取黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸，并从提取溶剂、料液比、提取时间、提取温度四个方面对提取方法进行优化。结果显示当提取溶剂20％甲醇、料液比选择1:10、提取时间为30min、提取温度为40℃时硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸含量最高。

(2)黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸含量较少，本发明采用柱前衍生化氨基酸方法可以提高黑蒜样品中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸检测的灵敏性和特异性。根据衍生化时间的不同衍生化方法可分为柱前衍生化和柱后衍生化两种。相较于柱前衍生化，柱后衍生化方法需要专用氨基酸分析仪，成本较高，灵敏度较低，不便于实验室应用。

(3)本发明实验选择PITC为衍生化试剂，进行衍生化反应检测黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸。目前，最常用的氨基酸柱前衍生化的方法主要有(PITC)法和邻苯二甲醛(OPA)法。OPA法的优点是反应迅速、但是选择性较强，只能用于一级氨基酸的衍生，二级氨基酸不能同时被检测，且衍生化产物稳定性较差，成本较高。PITC衍生化法具有良好的选择性，可以与一级氨基酸和二级氨基酸同时反应，衍生化产物稳定性较好，且反应条件温和，成本低廉。

(4)目前尚未见PITC衍生化检测黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸的方法，本发明建立了基于超高液相色谱-串联单四级杆质谱技术测定黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸的分析方法，并对样品前处理条件和衍生化条件进行了优化。实验选择较快捷的超声水提法进行样品提取，经过C18固相萃取小柱去除大分子干扰后进行PITC衍生化，再上样分析。硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸浓度分别在0.019-1.25、0.078-5.00μg·mL^-1下线性关系良好，相关系R²在0.9995～0.9996，检出限分别为4.844mL、0.605ng/mL。

(5)本发明试验结果显示LC-MS方法基质影响干扰较大，具有较强的离子抑制效应，因此本实验选用同位素蛋氨酸-D3为内标。方法学结果表明建立的LC-MS方法可用于黑蒜中硒代蛋氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸的定量检测。

(6)本发明实验结果表明，5个产地的黑蒜样品中硒代蛋氨酸含量均较低，且含量差异较大。云南产黑蒜硒代蛋氨酸含量远远低于其他四个产地，青海产黑蒜中硒代蛋氨酸含量最高。各产地黑蒜中硒甲基硒代半胱氨酸含量也差异较大，云南产黑蒜中硒硒甲基硒代半胱氨酸含量最低，江苏产黑蒜硒代蛋氨酸含量远远高于于其他四个产地，青海产黑蒜次之。各产地黑蒜样品中硒甲基硒代半胱氨酸均远高于硒代蛋氨酸，4可达5-20倍。总之，5个产地的黑蒜样品中硒甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸含量存在较大差异，可能与气候、土壤等生长栽培条件有关，其中青海产黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸含量均较高，可能是较佳补硒食品。

总之，目前对大蒜中有机硒的定量检测报道较少，本发明建立了基于PITC柱前衍生化的UHPLC-MS方法，同时测定黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸，分别考察了提取溶剂、料液比、提取时间、提取温度等几个因素提取大蒜中两种目标化合物。同时对衍生化条件进行了优化。结果显示建立的UHPLC-MS检测方法快速、可靠，为黑蒜质量检测提供参考依据。各地黑蒜中硒甲基硒代半胱氨酸含量是硒代蛋氨酸的5-20倍，不同产地黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸差异明显，可能与气候、土壤等生长栽培条件有关。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种同时检测黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸含量的方法，其特征在于，包括：

(1)将黑蒜去皮、碾压成泥状后真空干燥；取干燥后的黑蒜并按比例加入甲醇水溶液，充分混匀后在20～50℃下超声10～40min；离心分离后取上清液；

(2)将所得上清液经固相萃取并以甲醇水溶液进行洗脱，收集所有洗脱液；将所得洗脱液旋蒸浓缩后再次溶解于甲醇水溶液中，混匀后过滤取滤液；

(3)向所得滤液中加入内标溶液、三乙胺乙腈溶液以及PITC乙腈溶液，充分混匀后20～60℃进行衍生化反应1～3h；反应结束后取上清液于自动进样瓶，待测；

(4)将所得待测样品液进行UPLC-MS检测，记录吸收峰面积并代入标准曲线，计算得到黑蒜中硒代蛋氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸各自的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述甲醇水溶液为体积百分比为0～80％的甲醇水溶液；黑蒜与甲醇水溶液的质量体积比为1g:10～25mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述甲醇水溶液为体积百分浓度为20％的甲醇水溶液；黑蒜与甲醇水溶液的质量体积比为1g:10mL；充分混匀后在40℃下超声30min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述甲醇水溶液为体积百分浓度为10～80％的甲醇水溶液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述甲醇水溶液为体积百分浓度为40％的甲醇水溶液。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中滤液、三乙胺乙腈溶液和PITC乙腈溶液的体积比为5:2.5:1；其中三乙胺乙腈溶液中三乙胺的浓度为1mol/L；PITC乙腈溶液中PITC的浓度为0.1mol/L。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述内标溶液为蛋氨酸-D3。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，衍生化反应的温度20℃，衍生化反应的时间1h。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，检测条件为：

色谱条件：ACOQUITY

BEH C18色谱柱；流速：0.3mL·min^-1；柱温：45℃；进样量：5μL；检测波长：338nm；流动相：乙腈A-0.01％甲酸水溶液B，梯度洗脱；

质谱条件：电喷雾离子源采用负离子检测；电喷雾毛细管电压设定为3.0kV，氮气用作溶剂蒸发的干燥气体，蒸发温度为172℃，离子传输管温度为300℃，选择性离子监测模式。

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