CN109307728B

CN109307728B - 检测样品中氨基酸、有机酸或磷酸糖代谢产物的新型内标物

Info

Publication number: CN109307728B
Application number: CN201710618104.2A
Authority: CN
Inventors: 储炬; 刘秀; 王永红; 杭海峰; 田锡炜; 沈玉婷
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2017-07-26
Filing date: 2017-07-26
Publication date: 2020-11-03
Anticipated expiration: 2037-07-26
Also published as: CN109307728A

Abstract

本发明涉及检测样品中氨基酸、有机酸或磷酸糖代谢产物的新型内标物。本发明揭示了适用于在检测待测样品中氨基酸、有机酸或磷酸糖代谢产物的过程中作为内标物的新型化合物，并建立了检测方法。本发明的内标物以及检测方法可有效地提高发酵代谢产物的检测精确度，并且过程简便，成本较低。

Description

检测样品中氨基酸、有机酸或磷酸糖代谢产物的新型内标物

技术领域

本发明属于物质检测领域，更具体地，本发明涉及检测样品中氨基酸、有机酸或磷酸糖代谢产物的新型内标物。

背景技术

在发酵工业中，胞内代谢物的检测是普遍需要的。由于中间代谢物具有种类多、浓度低和周转快等特点，气相色谱-质谱法(GC-MS)已应用于这些物质的定性与定量分析(GUOMeng-Lei，LIU Xiao-Yun，HUANG Ming-Zhi，et al.¹³C-assisted ultra-high performanceliquid chromatography triple quadrupole mass spectrometry method for precisedetermination of intracellular metabolites in Pichia pastoris.ChineseJ.Anal.Chem.，2016，44(2):232-240)。目前胞内代谢物的检测多采用同位素稀释-质谱定量法(简称IDMS)，通过测量样品的未标记代谢物和作为内标的全标记代谢物的比值实现定量分析(Hellerstein M K，Neese R A.Mass isotopomer distribution analysis ateight years:theoretical， analytic，and experimentalconsiderations.Am.J.Physiol.276，E1146-E1170[J]. American Journal ofPhysiology，1999，276(6Pt 1):E1146)。此方法精确性高，重现性好，但¹³C内标物获取过程较繁琐，菌体发酵必须使用合成培养基、以U-¹³C-Glu为底物、需将¹³C胞内代谢物提取出来且所获得的¹³C内标物浓度未知，应用中的添加量仍需摸索等，除¹³C同位素的高价格，这一系列程序也在无形中增加了实际操作成本。

为了解决以上问题，本领域已采用代谢物内标法，即以性质相对稳定且不影响各中间物的化合物对氨基苯甲酸作为内标物，以取代¹³C同位素对代谢物进行定性或定量分析。

然而，本发明人在前期研究过程中，发现以对氨基苯甲酸作为氨基酸类发酵代谢物、有机酸类发酵代谢物、磷酸糖类发酵代谢物的内标物时，存在信号值不够理想，作为低浓度代谢产物的内标时灵敏度不高等问题。因此，需要研究解决这类问题的方法，以在实践中进一步地改进发酵代谢产物的检测水平。

发明内容

本发明的目的在于提供检测样品中氨基酸、有机酸或磷酸糖代谢产物的新型内标物。

在本发明的第一方面，提供一种检测待测样品中氨基酸、有机酸或磷酸糖代谢产物的方法，所述方法包括：以GC-MS方法对待测样品进行检测，并且，检测待测样品中氨基酸时，以正亮氨酸(NLE)作为内标物；或

检测待测样品中有机酸时，以丙二酸(PPD)或己二酸(HEX)作为内标物；较佳地，以己二酸作为内标物；或

检测待测样品中磷酸糖时，以磷酸单丁酯(MBP)作为内标物。

在一个优选例中，所述的待测样品包括(但不限于)：溶液，悬浮液。

在另一优选例中，所述的待测样品是生物发酵液。

在本发明的另一方面，提供正亮氨酸的用途，用于在GC-MS方法检测待测样品时，作为氨基酸的内标物。

在本发明的另一方面，提供丙二酸或己二酸的用途，用于在GC-MS方法检测待测样品时，作为有机酸的内标物。

在本发明的另一方面，提供磷酸单丁酯的用途，用于在GC-MS方法检测待测样品时，作为磷酸糖的内标物。

在本发明的另一方面，提供一种用于检测待测样品中氨基酸、有机酸或磷酸糖代谢产物的试剂盒，所述的试剂盒中包括：

正亮氨酸，用于检测待测样品中氨基酸时作为内标物；

丙二酸或己二酸，较佳地为己二酸，用于检测待测样品中有机酸时作为内标物；和

磷酸单丁酯，用于检测样品中磷酸糖时作为内标物。

在本发明的另一方面，提供一种检测黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钠的发酵产物中氨基酸、有机酸或磷酸糖代谢产物的方法，所述方法包括：以GC-MS 方法对待测样品进行检测，并且，检测发酵产物中氨基酸时，以正亮氨酸(NLE) 作为内标物；

检测发酵产物中有机酸时，以丙二酸(PPD)或己二酸(HEX)作为内标物；较佳地，以己二酸(HEX)作为内标物；或

检测发酵产物中磷酸糖时，以磷酸单丁酯(MBP)作为内标物。

在另一优选例中，所述方法还包括：用不同梯度浓度的标准品混合液分别建立发酵产物氨基酸、有机酸、磷酸糖的标准曲线，用于发酵产物中氨基酸、有机酸、磷酸糖浓度的确定。

本发明的其它方面由于本发明的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、内标PABA和NLE对18种氨基酸混合标准品检测的影响。

图2、内标PABA、PPD和HEX对7种有机酸混合标准品检测的影响。

图3、内标PABA和MBP对8种磷酸糖混合标准品检测的影响。

图4、内标PABA在磷酸糖检测中的拖尾现象。

具体实施方式

为了解决现有技术中发酵代谢产物检测效果不理想的问题，本发明人经过广泛的研究筛选，选择到了一些适用于在检测待测样品中氨基酸、有机酸或磷酸糖代谢产物的过程中作为内标物的新型化合物，并建立了检测方法。本发明的内标物以及检测方法可有效地提高发酵代谢产物的检测精确度，并且过程简便，成本较低。

在发酵代谢产物的研究过程中，本发明人试图找到性质相对稳定且不影响各中间物的化合物作为内标，以取代¹³C同位素对代谢物进行定性或定量，并且最好找到比对氨基苯甲酸(PABA)更为理想的化合物作为内标物。

由于溶解衍生和仪器检测等过程中，胞内代谢物会受到一定的干扰，因此内标物在GC-MS检测中主要起到了“参考”作用。内标物的选择遵循一定的原则，如物化性质稳定，与待测物是一类物质，菌体自身没有合成等，另外，考虑到实际问题，内标物较容易购买也是必要条件之一。但单一的内标物对种类多样的代谢物而言不一定都是理想的选择。本发明前期采用 GC-MS以对氨基苯甲酸为内标物检测所有的胞内代谢物，发现对氨基苯甲酸的峰型有严重拖尾现象，不便于面积积分准确定量。因此，较优内标物的选择是较为困难的，不仅要求内标物信号强度较强，峰型好，不拖尾，检测出的代谢物数目要尽可能的多；而且还要求内标物出峰时间与其他代谢物分开，互不干扰等。

为了获得满足所需的内标物，本发明人考察了大量的化合物，综合考虑氨基酸类、有机酸类、磷酸糖类代谢物的分子结构以及候选化合物的分子结构、结合本发明人的研究经验以及化合物的制备或购买成本，选择到了合适的化合物。

根据本发明人的新发现，本发明提供了一种检测待测样品中氨基酸、有机酸或磷酸糖代谢产物的方法，包括：以GC-MS方法对待测样品进行检测，并且，检测待测样品中氨基酸时，以正亮氨酸(NLE)作为内标物；检测待测样品中有机酸时，以丙二酸(PPD)或己二酸(HEX)作为内标物，较佳地以己二酸作为内标物；或检测待测样品中磷酸糖时，以磷酸单丁酯(MBP)作为内标物。

GC是气相色谱法的简称，MS是质谱法的简称。气相色谱法是指用气体作为流动相的色谱法。由于样品在气相中传递速度快，因此样品组分在流动相和固定相之间可以瞬间地达到平衡。另外加上可选作固定相的物质很多，因此气相色谱法是一个分析速度快和分离效率高的分离分析方法。质谱分析法是通过对被测样品离子的质荷比的测定来进行分析的一种分析方法；被分析的样品首先要离子化，然后利用不同离子在电场或磁场的运动行为的不同，把离子按质荷比(m/z)分开而得到质谱，通过样品的质谱和相关信息，可以得到样品的定性定量结果。本发明中，所述的GC-MS方法是气相色谱-质谱法联用的一种技术。

适合应用本发明的方法进行检测的待测样品是多种多样的，可以是但不限于：溶液，悬浮液等。例如，在本发明的实施例中，所述的待测样品是生物发酵液。本发明的方法，对于产生发酵液的生物菌种没有特别的限制，其适用于多种发酵体系中。

根据本发明人的新发现，本发明还提供了正亮氨酸的用途，用于在 GC-MS方法检测待测样品时，作为氨基酸的内标物。本发明还提供了丙二酸或己二酸的用途，用于在GC-MS方法检测待测样品时，作为有机酸的内标物。本发明还提供了磷酸单丁酯的用途，用于在GC-MS方法检测待测样品时，作为磷酸糖的内标物。这些化合物在本领域中尽管为已知化合物，但是在现有技术中尚未被应用于作为内标物。

根据本发明人的新发现，本发明还提供了一种用于检测待测样品中氨基酸、有机酸或磷酸糖代谢产物的试剂盒，所述的试剂盒中包括：正亮氨酸，用于检测待测样品中氨基酸时作为内标物；丙二酸或己二酸，较佳的为己二酸，用于检测待测样品中有机酸时作为内标物；和磷酸单丁酯，用于检测样品中磷酸糖时作为内标物。

所述的试剂盒中，还可包含应用GC-MS方法检测时所需的其它试剂。以及，还可以包括说明应用本发明的内标物进行检测的操作步骤的使用说明书，以方便本领域技术人员使用。

在本发明的具体实施例中，所检测的待测样品是黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钠的发酵液。葡萄糖酸钠是一种多羟基酸，目前广泛地应用于医药、化工、建筑和食品等行业(Ramachandran S，Fontanille P，Pandey A，et al.Gluconic acid: properties，applications and microbial production[J].Food Technology and Biotechnology，2006，44(2):185-195)。黑曲霉深层液体发酵是目前各企业普遍采用的葡萄糖酸钠生产方式(王冲，刘红梅，杨文玲等；葡萄糖酸钠的制备及发展趋势[J]；河北工业科技，2007，24(2):123-125)。因此，作为本发明的一种优选方式，本发明提供了一种检测黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钠的发酵产物中氨基酸、有机酸或磷酸糖代谢产物的方法，包括：以GC-MS方法对待测样品进行检测，并且，检测发酵产物中氨基酸时，以正亮氨酸(NLE)作为内标物；检测发酵产物中有机酸时，以丙二酸(PPD)或己二酸(HEX)作为内标物；或检测发酵产物中磷酸糖时，以磷酸单丁酯(MBP)作为内标物。较佳地，所述方法还包括：用不同梯度浓度的标准品混合液分别建立发酵产物氨基酸、有机酸、磷酸糖的标准曲线，用于发酵产物中氨基酸、有机酸、磷酸糖浓度的确定。

目前大规模采用复合培养基用黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钠，且有关葡萄糖酸钠发酵中胞内代谢物的检测从未报道过。因此本发明首次以不同内标物为切入点，氨基酸类以对氨基苯甲酸和L-正亮氨酸为内标，有机酸类以对氨基苯甲酸、丙二酸和己二酸为内标，磷酸糖类以对氨基苯甲酸和磷酸单丁酯为内标，用GC-MS离子检测模式分别对氨基酸、有机酸和磷酸糖进行绝对定量，通过对比优化，得出上述三类物质定量检测的较优内标物，分别为正亮氨酸、己二酸和磷酸单丁酯。与IDMS相比，这种方法最大优势就是过程简便，成本较低，适用于基础探究。

本发明的方法精度良好，标准曲线相关系数大多达到0.99以上，重现性好。与IDMS方法相比，本发明的方法最大的优势就是过程简便，成本较低，适用于基础探究。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料与方法

1、仪器与试剂

气相色谱-质谱联用仪(Agilent Technologies 7890A GC system)/ MS(AgilentTechnologies 5975C inter MSD)，带自动进样器(7683B Series injector)，真空冷冻抽干机(LINUO，FD-1A-50)，旋转蒸发仪(Rapidvap， LABCONCO)，低温离心机(HETTICHCENTRIFUGEN universal 32R)，低温冷却槽(DC-4006，上海舜宇恒平科学仪器有限公司)，恒温干燥箱 (DHG-9123A，上海华连医疗器械有限公司)，5-L搅拌式生物反应器(上海国强生化装备有限公司)，温度电极(Omega公司)、溶氧和pH电极(Mettler公司)。

2、菌种、培养基和发酵条件

菌种为A.niger(CICC 40350)，由中国山东福洋生物技术有限公司提供。

发酵培养基：葡萄糖300g/L，磷酸二氢钾0.17g/L，磷酸氢二铵0.25g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，玉米浆2g/L，pH 6.5-7.0，消泡剂0.2mL/L，灭菌条件121℃，60min，葡萄糖分开灭菌为115℃，20min。

发酵条件：接种量13％，pH 5.2，温度37℃，通气量4vvm，发酵前6.5 h转速设为500rpm，后调整至800rpm。

3、标准品和内标物的制备

分别配制17种氨基酸、7种有机酸和8种磷酸糖的标准品混合液，混标的终浓度均为200μmol/L，储存在-80℃(表1)。

分别配制5种内标物溶液：对氨基苯甲酸(PABA)、L-正亮氨酸(NLE)、丙二酸(PPD)、己二酸(HEX)和磷酸单丁酯(MBP)，终浓度均为200μmol/L，储存在-80℃。

表1、标准品缩写表

氨基酸标准品、有机酸标准品、磷酸糖标准品(Sigma公司)；衍生剂 TBDMS、衍生剂TMS、吡啶(Sigma公司)；甲醇、乙醇(分析纯AR，上海凌峰化学试剂有限公司)；超纯水由Millipore超滤制水器制备。

4、样品的处理

(1)快速取样、淬灭和提取

快速取3mL发酵液于40mL 40％(w/w)冷甲醇(-26.7℃)中灭活，用0.8μm 纤维滤膜抽滤，再用约120mL 40％冷甲醇冲洗。然后将滤膜与菌体快速放进75℃25mL 95％(v/v)热乙醇(75℃)中，随后迅速转移至95℃下3min破碎细胞。乙醇提取后放在冰上，置于-80℃保存至GC-MS检测。

(2)进样前处理

将上述保存至-80℃的胞内代谢物，4℃，12000r/min离心10min，取上清液，用旋蒸仪浓缩。吸取200μL浓缩后的发酵液于液相小瓶中，并根据所测目标物加入一定量的内标物(如测氨基酸类，以PABA或NLE为内标；有机酸类，以PABA、PPD或HEX为内标；磷酸糖类，以PABA或MBP为内标)，用冷冻抽干机抽干过夜。待恢复至室温，准备溶解衍生(样品溶解衍生方法与标准品的一致)。

溶解：配制20mg/mL甲氧胺吡啶溶液(现配现用)，在每个样品瓶中加100μL甲氧胺吡啶，放入烘箱60℃，60min，每隔20min摇一次。

衍生：

A.测氨基酸和有机酸类：待样品冷却至室温，再加入室温的100μL MTBSTFA(N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺)放入烘箱60℃，60 min，每隔20min摇一次。

B.测磷酸糖类：待样品冷却至室温，再加入室温的100μL MSTFA/TMCS(1000:50，v/v)，60℃，60min，每隔20min摇一次。

离心：待样品瓶冷却至室温，将样品转移至尖底EP管离心(12000rpm， 1min)。所得上清转至内衬管，盖上有孔盖子准备进样。

5、GC-MS分析条件

(1)氨基酸类和有机酸类

色谱条件：Agilent Technologies HP-5HS色谱柱(30m×0.25mm)，柱温 280℃，进样体积1μL，高纯氦气的流量1mL/min，分流比10:1。氨基酸和有机酸类梯度升温程序见表2。

质谱条件：EI离子源，70eV；溶剂延迟5min；质核比扫描范围m/z 70～680。

表2、氨基酸类和有机酸类的气相色谱升温程序

(2)磷酸糖类

色谱条件：Agilent Technologies HP-5HS色谱柱(30m×0.25mm)，柱温 280℃，进样体积1μL，高纯氦气的流量1mL/min，不分流。磷酸糖类梯度升温程序见表3。

表3、磷酸糖类的气相色谱升温程序

实施例1、特征离子碎片的选取

本发明人在前期研究过程中，发现以对氨基苯甲酸(PABA)作为发酵代谢产物的内标物，对于低浓度的代谢产物的检测不够理想，信号值不好。因此，本发明人试图探寻一些以往未应用于作为内标物的化合物，寻找比对氨基苯甲酸(PABA)更为理想的化合物作为内标物，以取代¹³C同位素对代谢物进行定性或半定量分析，同时需要对代谢物相应的出峰面积积分。

本实施例中，通过单离子监测(SIM)方法分析胞内代谢物，获得更高的选择性和灵敏度。碎片断裂方法详见文献Kiefer P，Nicolas C，Letisse F，et al. Determination ofcarbon labeling distribution of intracellular metabolites from singlefragment ions by ion chromatography tandem mass spectrometry[J].AnalyticalBiochemistry，2007，360(2):182-188，其中碎片离子应满足以下条件：特征碎片离子本身信号强度高、总离子流图中其两侧无杂质碎片。根据上述原则，本发明人最终确定了用于检测氨基酸类、有机酸类和磷酸糖类的38个特征离子碎片(表4)。

表4、SIM法-选取的特征离子碎片

注：^a所用衍生剂为MTBSTFA；

^b所用衍生剂为MSTFA/TMCS(1000:50，v/v)；

^c由于磷酸糖类分子量较大，库里没有匹配的数据，自行比较确定相应的物质。

实施例2、氨基酸检测

本发明人考察了大量的化合物，综合考虑氨基酸类代谢物的分子结构以及候选化合物的分子结构、结合本发明人的研究经验以及化合物的制备或购买成本，选择到一系列的候选化合物。主要根据以下基本原则用于最初的筛选或选择：1)自然界中不存在；2)出峰时间可与其它氨基酸分开；3)类似同系物，即结构相近。经过进一步筛选，将正亮氨酸(NLE)应用于作为氨基酸检测用化合物的较佳选择。

在100μL的200μmol/L的18混合氨基酸标准品中分别加入100μL的200μmol/L的对氨基苯甲酸(PABA)和正亮氨酸(NLE)内标物，过程中样品处理程序均一致(详见材料与方法中第4部分)。

结果如图1，显示了内标物PABA和NLE对18种氨基酸混合标准品检测的影响。正亮氨酸组比对氨基苯甲酸组检测出的氨基酸数目多，共检测出 15种氨基酸，且其整体信号更强，比后者高近110000个信号值。其中，内标物NLE的信号明显强于PABA，约是其信号强度的6.75倍。

另外很重要地是，在所有的检测中，对氨基苯甲酸峰的拖尾现象较严重 (图4)，没有正亮氨酸峰型好。本发明人预期，上述现象可能的解释归结于两者本身的结构和性质，NLE在化学结构上更占优势、且其性能稳定，更适合作为氨基酸检测的内标物。

实施例3、有机酸检测

本发明人考察了大量的化合物，综合考虑有机酸类代谢物的分子结构以及候选化合物的分子结构、结合本发明人的研究经验以及化合物的制备或购买成本，选择到一系列的候选化合物，包括候选化合物为：对氨基苯甲酸、丙二酸和己二酸等。经过进一步筛选，将己二酸(HEX)应用于作为氨基酸检测用化合物的较佳选择。

在100μL的200μmol/L 7种混合有机酸标准品中分别加入100μL的200 μmol/L的对氨基苯甲酸(PABA)、丙二酸(PPD)和己二酸(HEX)内标物，过程中样品处理程序均一致(详见材料与方法中第4部分)，然后用GC/MS检测分析。

结果如图2，分别显示了以PABA、PPD和HEX为内标检测7种有机酸混标的结果。由于硅烷化后的化合物不稳定，草酰乙酸在这三组中都未检测到。三组比较可以看出，己二酸组的整体信号更强，分别比前两者高出41.67％和54.55％。而且内标物HEX的信号明显强于PABA和PPD，都约是其信号强度的10倍。再者，与氨基酸的检测类似，对氨基苯甲酸峰的拖尾现象较严重(图4)，没有丙二酸和己二酸的峰型好。

综合以上检测结果，PPD和HEX为内标应用于检测有机酸类代谢物均比PABA理想；而选取HEX作为三羧酸循环中有机酸检测的内标是最为理想的。

实施例4、磷酸糖类检测

本发明人考察了大量的化合物，综合考虑磷酸糖类代谢物的分子结构以及候选化合物的分子结构、结合本发明人的研究经验以及化合物的制备或购买成本，选择到一系列的候选化合物，包括对氨基苯甲酸、磷酸单丁酯、磷酸萘等。由于磷酸糖类代谢物衍生化后分子量大，在操作上要求高。经过反复研究，将磷酸单丁酯(MBP)应用于作为氨基酸检测用化合物的较佳选择。

在100μL的200μmol/L 8种混合磷酸糖标准品中分别加入100μL的200 μmol/L的对氨基苯甲酸(PABA)和磷酸单丁酯(MBP)内标物，过程中样品处理程序均一致(详见材料与方法中第4部分)，然后用GC/MS检测分析。

结果如图3，分别显示了以PABA和MBP为内标检测8种磷酸糖混标的结果。该结果显示，磷酸单丁酯组能检测出的代谢物数目较多，共检测出的 8种，而对氨基苯甲酸组只能检测到5种。

由于磷酸糖硅烷化合物性质不稳定，所以检测出来的信号强度整体较上面的氨基酸和有机酸的弱。通过比较这两者，可以看出，磷酸单丁酯组的代谢物信号强度更高，且是对氨基苯甲酸组的1.94倍。MBP的信号较PABA 特强，约是后者的18倍，这表明在冷冻抽干、溶解衍生等一系列程序中， MBP有更好的稳定性，尤其是硅烷化后的化合物。再者，PABA的拖尾现象一直很严重(图4)，对内标物的择取而言这是应尽可能避免的。

因此，MBP更适合作为GC/MS检测磷酸糖类的内标。

综上所述，实施例2～4最终选取NLE、HEX和MBP分别作为氨基酸类、有机酸类和磷酸糖类的较优内标物。与IDMS相比，这种方法最大优势就是过程简便，成本较低，适用于基础探究。

实施例5、葡萄糖酸钠发酵中胞内代谢物的定量分析

本实施例中，以将上述建立的胞内代谢物检测方法应用于黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钠中作为举例。

根据选择的特征性离子碎片和前述获得的不同种类胞内代谢物检测优化后的内标物，用不同梯度的标准品混合液分别建立各个物质的标准曲线，而后用于葡萄糖酸钠发酵中各种胞内代谢物浓度的确定。获得的标准曲线相关系数如表5。

表5、标准曲线相关系数(R²值)

由表5可以看出，该方法共建立了30种胞内代谢物的标准曲线，精度良好，相关系数R²大多在0.99以上。

表6显示了葡萄糖酸钠发酵中黑曲霉胞内代谢物的浓度池大小，此方法稳定，重复性好。明显地，菌体在发酵初期会产生更多的胞内代谢物以适应环境，延滞期过后，胞内代谢物浓度池会减小。其中，Pro、Cys、His、G3P、3PG和FBP的浓度相对较高，而在葡萄糖酸钠发酵中，初始糖浓度较高，而且发酵过程中流加大量的氢氧化钠以调节pH，因此发酵结束时渗透压高达3000mOsm/kg。Saum等人报道，Pro有渗透保护作用(Saum,S.H.,Muller,V.Salinity-Dependent Switching of Osmolyte Strategies in a ModeratelyHalophilic Bacterium:Glutamate Induces Proline Biosynthesis in Halobacillushalophilus[J].The Journal of Bacteriology,2007,189,6968-6975)；而且田锡炜在研究拟干酪乳杆菌抵抗高渗环境的过程中选取了甘露醇、甘油、脯氨酸和天冬氨酸作为潜在的渗透压保护剂(田锡炜.基于过程氧代谢和渗透压应激响应分析的乳酸发酵优化[D].华东理工大学,2015)。另外，His浓度池的大小也与葡萄糖氧化酶(GOD)的表达密切相关，His520与His563为主要活性位点氨基酸残基，在反应过程中通过氢键与底物和辅酶FAD连接发挥催化功能(Witt S,Wohlfahrt G,Schomburg D,et al.Conserved arginine-516 ofPenicillium amagasakiense glucose oxidase is essential for the efficientbinding of beta-D-glucose.[J].Biochemical Journal,2000,347(2):553-9；顾磊.Aspergillus niger葡萄糖氧化酶的异源分泌表达、分子改造和发酵生产[D]. 江南大学,2014)。

表6、葡萄糖酸钠发酵中黑曲霉胞内代谢物的浓度池大小

注：代谢物池的单位μmol/g_DCW，所有代谢物池大小是三次测定的平均值。

结论

本发明最终确定NLE、HEX和MBP分别作为氨基酸类、有机酸类和磷酸糖类的较优内标物。与IDMS相比，这种方法最大优势就是过程简便，成本较低，适用于基础探究。

本发明的方法可以成功运用于黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钠，在代谢角度具有指导意义。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种检测黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钠的发酵产物中氨基酸、有机酸和磷酸糖代谢产物的方法，其特征在于，所述方法包括：以GC-MS方法对发酵产物进行检测，并且，

检测发酵产物中氨基酸时，以正亮氨酸作为内标物；

检测发酵产物中有机酸时，以丙二酸或己二酸作为内标物；及

检测发酵产物中磷酸糖时，以磷酸单丁酯作为内标物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，检测发酵产物中有机酸时，以己二酸作为内标物。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：用不同梯度浓度的标准品混合液分别建立发酵产物氨基酸、有机酸、磷酸糖的标准曲线，用于发酵产物中氨基酸、有机酸、磷酸糖浓度的确定。

4.一种用于检测黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钠的发酵产物中氨基酸、有机酸和磷酸糖代谢产物的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括：

正亮氨酸，用于检测发酵产物中氨基酸时作为内标物；

丙二酸或己二酸，用于检测发酵产物中有机酸时作为内标物；和

磷酸单丁酯，用于黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钠的发酵产物中磷酸糖时作为内标物。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括己二酸，用于检测发酵产物中有机酸时作为内标物。

6.权利要求4或5所述的试剂盒的用途，用于在GC-MS方法检测发酵产物时，提供氨基酸、有机酸和磷酸糖的内标物。