CN117517537A - 一种基于消除基质效应检测百草油中马兜铃酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于检测技术领域，具体涉及一种基于消除基质效应检测百草油中马兜铃酸的方法。本发明通过选择合适的样品预处理方法，通过分析得到最优的色谱分离条件兼顾基质效应和回收率两方面因素，建立了基于多反应监测(MRM)的液质联用检测方法，同时快速筛查本品中是否含有马兜铃酸Ι、马兜铃酸Ⅱ、马兜铃酸Ⅲa、马兜铃酸Ⅳa和马兜铃内酰胺Ι等五种马兜铃酸类成分，并快速准确测定五成分的含量，为本品安全性研究提供了科学依据，也为其他含细辛中成药中马兜铃酸类成分的检测提供了技术参考。
Description
技术领域
本发明属于检测技术领域，具体涉及一种液相色谱-质谱联用检测百草油中马兜铃酸的方法。
背景技术
百草油是由甘草、黄芩、黄柏、大黄、厚朴、陈皮、草果、豆蔻、柴胡、白芷、青蒿、大皂角、细辛、紫草、沉香、诃子、艾叶、薄荷油、丁香罗勒油、肉桂油和广藿香油等二十一味药及辅料食用植物油组成的中药复方制剂，具有清暑去湿，避秽止呕，提神醒脑的功效，用于伤风感冒，呕吐腹痛，舟车晕浪，皮肤瘙痒。
百草油处方中含有辛温解表药细辛，研究表明细辛药材中含有痕量的马兜铃酸类成分。马兜铃酸类成分是一系列结构类似的硝基菲类化合物，包括马兜铃酸和马兜铃内酰胺两种结构类型，天然存在于马兜铃属(Aristolochia)及细辛属(Asarum)等马兜铃科植物中。自1993年马兜铃酸肾毒性首次报道以来，其安全性问题一直备受关注，目前国内外已有大量研究证实马兜铃酸具有肾毒性、致癌和致突变作用。2008年，国际癌症研究机构将马兜铃酸列为I类致癌物，并于2012年将含有马兜铃酸的植物列为Ⅰ类致癌物，且2020年版药典对细辛马兜铃酸Ⅰ的限度（<0.001%）做了规定。鉴于马兜铃酸类成分对人体的严重危害性，确定百草油中是否含有毒性成分马兜铃酸Ι及其他马兜铃酸类成分，进一步加强百草油的风险评估至关重要。
马兜铃酸类成分在百草油中的检测为痕量检测，然而，含细辛药材的百草油药味复杂且辅料为植物油，其基质效应问题不容忽视，传统的处理方法，难以检测出百草油中的马兜铃酸成分。
发明内容
针对现有技术中存在的检测空白，本发明提供了一种液相色谱-质谱联用检测百草油中马兜铃酸的方法。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种基于消除基质效应检测百草油中马兜铃酸的方法，该方法前处理过程中，采用三氯甲烷-甲醇混合溶液提取百草油中马兜铃酸，制备供试品溶液。
本发明提供的检测方法，具体包括以下步骤：
（1）制备对照溶液：分别配置混合对照品溶液、马兜铃酸Ⅰ对照品贮备液、马兜铃酸Ⅰ对照品溶液；
（2）制备供试品溶液：精密量取百草油样品，加三氯甲烷-甲醇混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，取续滤液即得；
（3）制备阴性对照溶液、阴性加对照品溶液；
（4）采用超高效液相色谱-质谱法进行定性定量分析。
本发明检测过程中，所述混合对照品溶液具体的制备方法为：分别精密称取马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅱ、马兜铃酸Ⅲa、马兜铃酸Ⅳa和马兜铃内酰胺Ι对照品适量，加70%甲醇制成每1ml含10ng的混合溶液，即得。
进一步的，步骤（1）中，所述马兜铃酸Ⅰ对照品贮备液的制备方法为：精密称取马兜铃酸Ⅰ对照品18.95mg，加70%甲醇溶解并稀释，摇匀即得，浓度为75.12ng/ml；所述马兜铃酸Ⅰ对照品溶液的制备方法为：精密量取马兜铃酸Ⅰ对照品贮备液60μl，加三氯甲烷-甲醇混合溶液稀释，摇匀，即得，浓度为0.45ng/ml。
进一步的，步骤（2）中，所述百草油样品和混合溶液的体积比为1:49。
进一步的，步骤（2）中，所述混合溶液中，三氯甲烷和甲醇的体积比为3:7。
进一步的，步骤（3）中，所述阴性对照溶液的制备方法为：取处方中除去细辛的其他药味，按处方比例制成缺细辛阴性对照样品，按照供试品溶液的制备方法制得缺细辛阴性对照溶液；所述阴性加对照品溶液的制备方法为：精密量取百草油阴性样品，加马兜铃酸Ⅰ对照品贮备液，加三氯甲烷-甲醇混合溶液溶解并稀释，摇匀，取续滤液即得。
进一步的，步骤（3）中，所述百草油阴性样品和马兜铃酸Ⅰ对照品贮备液的体积比为1:0.3；所述三氯甲烷-甲醇的体积比为3:7。
进一步的，步骤（4）中，所述超高效液相色谱的条件为：采用岛津Shim-pack VeloxC18：2.1×100mm，2.7µm色谱柱，流动相A为甲醇，流动相B为含5mmol/L甲酸铵的0.1%甲酸溶液，梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml，进样量为2μl。
上述梯度洗脱的程序为：0～5min，36～50%A； 5～11min，50～70%A；11～13min，70%A。
进一步的，步骤（4）中，所述质谱的条件为：采用质谱检测器，电喷雾正离子模式（ESI+），进行多反应监测（MRM）；接口温度：300℃，脱溶剂温度：400℃，加热气流量：20L/min。
基质效应是指目标分析物不稳定或基质中干扰组分让目标分析物发生改变，如聚合、酯化等，或者是干扰组分与目标分析物的保留时间相同，干扰组分弱化了目标分析物的离子化，是液质联用分析测定中影响准确性和灵敏度的关键因子，选择合理的基质效应评价方法和合适的消除手段对降低或消除基质效应有着至关重要的作用。本发明提供的方法，能够兼顾基质效应和回收率两方面因素，实现百草油中马兜铃酸成分的痕量检测。
本发明的有益效果为：
本发明通过选择合适的样品预处理方法，通过分析得到最优的色谱分离条件兼顾基质效应和回收率两方面因素，建立了基于多反应监测(MRM)的液质联用检测方法，同时快速筛查本品中是否含有马兜铃酸Ι、马兜铃酸Ⅱ、马兜铃酸Ⅲa、马兜铃酸Ⅳa和马兜铃内酰胺Ι等五种马兜铃酸类成分，并快速准确测定五成分的含量，为本品安全性研究提供了科学依据，也为其他含细辛中成药中马兜铃酸类成分的检测提供了技术参考。
附图说明
图1为混合对照的MRM色谱图；其中，1.马兜铃酸Ⅲa、2.马兜铃酸Ⅳa、3.马兜铃酸Ⅱ、4.马兜铃酸Ⅰ、5.马兜铃内酰胺Ι；
图2为百草油样品的MRM色谱图；
图3为混合对照品专属性MRM色谱图；其中，1.马兜铃酸Ⅲa、2.马兜铃酸Ⅳa、3.马兜铃酸Ⅱ、4.马兜铃酸Ⅰ、5.马兜铃内酰胺Ι；
图4为样品加对照品溶液专属性MRM色谱图；
图5为阴性对照品的专属性MRM色谱图；
图6为流动相为乙腈时对照品（0.45ng/ml）MRM峰；
图7为流动相为乙腈时样品MRM峰
图8为流动相为甲醇时对照品（0.45ng/ml）MRM峰；
图9为流动相为甲醇时样品MRM峰
图10为空白溶剂MRM峰；
图11为基质加标的MRM峰；
图12 为溶剂为纯三氯甲烷的MRM峰；
图13为溶剂为纯甲醇时溶液状态。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
如无特别说明，本发明所使用的70%甲醇、0.1%甲酸溶液均为体积浓度。
本发明所使用的百草油按照标准WS3-B-2507-97制备。
实施例1
1材料
1.1仪器
岛津LCMS-8050三重四级杆液相色谱-质谱联用仪（日本岛津公司），SartoriusCP225D电子天平（德国Sartorius），数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率500W，频率40kHz），高速粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）
1.2试药
对照品马兜铃酸Ⅰ（批号：110746-201912，99.1%）购自中国食品药品检定研究院、马兜铃酸Ⅱ（批号：P13J10F90613，99.4%）、马兜铃内酰胺Ι（批号：P27N10S104067，98.4%）均购自上海源叶生物科技有限公司、马兜铃酸Ⅲa（批号：ZZS-20-190-A6，99.73%）、马兜铃酸Ⅳa（批号：ZZS-20-602-A6，98.15%）均购自上海甄准生物科技有限公司。甲醇（批号：11108107133）为质谱纯，购自默克股份有限公司，甲酸（批号：E2128234）、甲酸铵（批号：B1808018）为色谱纯，均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，水为Millipore制备的纯化水，百草油制剂样品共10批。
2.方法与结果
2.1 UPLC-MS/MS分析条件
2.1.1色谱条件
采用岛津Shim-pack Velox C18（2.1×100mm，2.7µm）色谱柱，流动相为通过考察甲醇、乙腈、水、甲酸以及甲酸铵的组合，最终优选以甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（含5mmol/L甲酸铵）（B），梯度洗脱（0～5min，36～50%A； 5～11min，50～70%A；11～13min，70%A）；流速为每分钟0.3ml，进样量为2μl。
2.1.2质谱条件
采用质谱检测器，电喷雾正离子模式（ESI+），进行多反应监测（MRM）；接口温度：300℃，脱溶剂温度：400℃，加热气流量：20L/min5种马兜铃酸类成分的质谱参数详见表1：
表1马兜铃酸类成分的监测离子对及碰撞电压
2.2溶液的制备
2.2.1 5成分混合对照品溶液
分别精密称取马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅱ、马兜铃酸Ⅲa、马兜铃酸Ⅳa和马兜铃内酰胺Ι对照品适量，加70%甲醇制成每1ml约含10ng的混合溶液，即得；其中，混合溶液中，马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅱ、马兜铃酸Ⅲa、马兜铃酸Ⅳa和马兜铃内酰胺Ι对照品的添加量相同。
2.2.2马兜铃酸Ⅰ对照品贮备液
精密称取马兜铃酸Ⅰ对照品18.95mg置250ml量瓶中，加70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液100μl，置100ml量瓶中，加三氯甲烷-甲醇（3：7）混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀即得对照品贮备液，浓度为75.12ng/ml。
2.2.3马兜铃酸Ⅰ对照品溶液
精密量取马兜铃酸Ⅰ对照品贮备液60μl，置10ml量瓶中，加三氯甲烷-甲醇（3：7）混合溶液溶解稀释至刻度，摇匀，即得到浓度为0.45ng/ml的溶剂对照品溶液。
2.2.4供试品溶液
精密量取1ml百草油样品，置50ml量瓶中加三氯甲烷-甲醇（3：7）混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，取续滤液即得。
2.2.5 阴性对照溶液
取处方中除去细辛的其他药味，按处方比例制成缺细辛阴性对照样品，照以上供试品溶液的制备方法制得缺细辛阴性对照溶液。
2.2.6阴性加对照品溶液
精密量取1ml百草油阴性样品，置50ml量瓶中加300μl马兜铃酸Ⅰ对照品贮备液，加三氯甲烷-甲醇（3：7）混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，取续滤液即得。
2.3马兜铃酸类成分的筛查
分别精密吸取5成分混合对照品溶液与10批供试品溶液各2μl，注入超高效液相色谱-质谱仪，按“2.1”项下条件进行测定。结果收集到的10批百草油样品中均未检出以上5种马兜铃酸类成分。MRM色谱图见图1-图2。
实施例2 方法学考察
（一）专属性考察
分别精密吸取“2.2”项下的混合对照品溶液、阴性加对照品溶液及阴性对照溶液各2μl，注入超高效液相色谱-质谱仪，进行测定。结果样品加对照品溶液色谱中，在与对照品色谱保留时间相同的位置上，有相应色谱峰，而阴性对照色谱中无相应色谱峰。说明处方中其他药味对测定结果无干扰。MRM色谱图见图3-图5。
（二）线性关系考察
精密量取“2.2”项下的马兜铃酸Ι对照品贮备液6μl、15μl、30μl、60μl、150μl和300μl，置1ml量瓶中，加三氯甲烷-甲醇（3：7）混合溶液稀释至刻度，摇匀，即得到马兜铃酸Ι的系列浓度对照品溶液①-⑥。分别精密吸取上述系列浓度对照品溶液各2μl，注入超高效液相色谱-质谱仪，测定峰面积积分值。以对照品进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，得到回归方程。结果表明：马兜铃酸Ⅰ在0.45～22.54pg范围内线性关系良好，可以满足测定需要。线性回归结果分别为，y = 19689x-1150.6.r= 0.9996。
（三）仪器检测限和定量限
当马兜铃酸Ⅰ浓度为0.14ng/ml时， S/N约为3，计算出该方法马兜铃酸Ⅰ成分的检测限（LOD）为7ng/ml。
当马兜铃酸Ⅰ浓度为0.45ng/ml时， S/N约为10，计算出该方法马兜铃酸Ⅰ成分的定量限（LOQ）分别为22ng/g。
（四）基质效应的考察
分别精密量取“2.2”项下马兜铃酸Ⅰ对照品溶液和阴性加对照品溶液各2μl，注入超高效液相色谱-质谱仪，按“2.1”项下条件进行测定。基质效应为96%，在90～110%范围内，表明基质基本无影响，可以采用溶剂配制对照品溶液用于检测。
（五）仪器精密度试验
精密吸取“2.2”项下的马兜铃酸Ⅰ对照品溶液2μl，注入超高效液相色谱-质谱仪，连续进样6次，测其峰面积积分值，RSD为2.94%。试验结果表明，仪器精密度良好。
（六）方法重复性试验
因样品未检出，故按照“2.2.4”项下阴性加对照品溶液的制备方法，平行制备6份供试品溶液，分别精密吸取2μl，注入超高效液相色谱-质谱仪，测定。其马兜铃酸Ⅰ的RSD为2.92%。结果表明，该测定方法的重复性良好。
（七）加样回收率试验
按照“2.2.4”项下阴性加对照品溶液的制备方法，精密量取1ml百草油阴性样品，置50ml量瓶中加不同体积的马兜铃酸Ⅰ对照品贮备液（低水平300μl，中水平700ul，高水平1.4ml），加三氯甲烷-甲醇（3：7）混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，取续滤液即得。按上述供试品制备方法，每个水平平行制备3份供试品加标溶液，分别精密吸取2μl，注入超高效液相色谱-质谱仪，测定，结果马兜铃酸Ⅰ的平均回收率分别为低水平（0.45ng/ml线性1）96.8%（RSD=2.99%）、中水平（1.05ng/ml线性2）104.2%（RSD=3.45%），高水平（2.10ng/ml线性3）98.1%（RSD=3.11%），表明该测定方法的回收率良好。具体数值见表2。
（八）样品稳定性试验
取“2.2.6”项下同一供试品溶液1，分别于0、2、4、8、10、12、24h/7个时间点测定马兜铃酸Ⅰ成分的峰面积积分值，结果马兜铃酸Ⅰ峰面积的RSD值为2.92%，表明供试品溶液在24小时内稳定性良好，能够满足测定需要。
实施例3 结果与讨论
（一）色谱条件
筛选百草油中的5种马兜铃酸类成分，其中马兜铃酸Ⅰ与其基质中干扰离子有相同保留时间，为实现两者分离，先后分别以乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水（含5mmol/L甲酸铵）、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水（含5mmol/L甲酸铵）为流动相，发现流动相组成对组分的峰形、分离度和灵敏度均有影响。采用甲醇-0.1%甲酸水（含5mmol/L甲酸铵）流动相梯度洗脱时待测组分可避免相互干扰（达到完全分离），峰形和灵敏度更好，故选择该色谱条件。当流动相为乙腈时，对照品（0.45ng/ml）MRM峰如图6所示，样品加标MRM峰如图7所示；当流动相为甲醇时，对照品（0.45ng/ml）MRM峰如图8所示，样品加标MRM峰如图9所示。
通过优化色谱分离条件使得内源性杂质与待测物分离，达到减少基质对测定的影响。以甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（含5mmol/L甲酸铵）（B），梯度洗脱（0～5min，36～50%A； 5～11min，50～70%A；11～13min，70%A）；流速为每分钟0.3ml，进样量为2μl。
（二）基质效应的消除
基质效应是液质联用分析测定中影响准确性和灵敏度的关键因子，选择合理的基质效应评价方法和合适的消除手段对降低或消除基质效应有着至关重要的作用。常用的样品处理方法包括液液萃取，固相萃取等，但样品前处理过程复杂使其提取回收率降低，增加污染风险。因百草油的制备工艺为油浸法且辅料为食用植物油，故在采用液质检测时基质效应很强，本试验先后通过改变净化方式、改变溶剂比例、改变取样量和优化色谱条件达到降低或消除基质效应的作用。
（1）净化方式对基质的影响（萃取，冷冻）
萃取：精密量取1ml百草油样品，置50ml离心管（先加25ml乙腈饱和的正己烷），再加1ml水，摇匀萃取后，取下层溶液过滤，取续滤液即得。试验得供试品溶液放置于低温（10℃）样品盘中样品即变浑浊，进样后基质效应80%以下，且容易污染色谱柱和检测器，无法继续进行试验。
冷冻：精密量取1ml百草油样品，置50ml量瓶中加乙腈稀释至刻度，摇匀，置-20℃冷冻3小时后，迅速取续滤液即得。此样品前处理方式对试验操作要求较高，且基质效应仍在80%左右。
萃取加冷冻：精密量取1ml百草油样品，置50ml离心管（先加25ml乙腈饱和的正己烷），再加1ml水，摇匀萃取后，冷冻放置1小时后（下层澄清），取下层溶液过滤，迅速取续滤液即得。此样品前处理方式同样对试验操作要求较高，且基质效应在85%左右，未在90～110%范围内，表明仍存在基质效应。
（2）取样量对基质效应的影响
扩大样品取样量（>1ml后溶液即变浑浊），增大料液比例后溶液即变浑浊（微乳状），用有机系滤膜过滤后未见改善，无法进样。
（3）溶剂比例对基质效应的影响
三氯甲烷-甲醇比例大于3：7会对色谱柱损伤严重，使其保留时间变化明显；当仅采用三氯甲烷作为溶剂时，保留时间变化明显，如图12所示；三氯甲烷-甲醇比例小于3：7溶液即变浑浊（微乳状），用有机系滤膜过滤后未见改善，当仅采用甲醇作为溶剂时，无法进样如图13所示。
（4）基质效应的消除
样品前处理考察过程中因此我们选择：精密量取1ml百草油样品，置50ml量瓶中加三氯甲烷-甲醇（3：7）稀释至刻度，摇匀，取续滤液即得。基质效应在96%左右，在90～110%范围内，表明基质效应基本无影响，可以采用溶剂配制对照品溶液用于检测。如图10和图11所示。
效果实施例：样品测定
10批百草油样品分别按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下UPLC-MS/MS分析条件进样测定，结果均未检出。
表2加样回收率试验结果
。
Claims (10)
1.一种基于消除基质效应检测百草油中马兜铃酸的方法，其特征在于，采用三氯甲烷-甲醇混合溶液提取百草油中马兜铃酸，制备供试品溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）制备对照溶液：分别配置混合对照品溶液、马兜铃酸Ⅰ对照品贮备液、马兜铃酸Ⅰ对照品溶液；
（2）制备供试品溶液：精密量取百草油样品，加三氯甲烷-甲醇混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，取续滤液即得；
（3）制备阴性对照溶液、阴性加对照品溶液；
（4）采用超高效液相色谱-质谱法进行定性定量分析。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述混合对照品溶液具体的制备方法为：分别精密称取马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅱ、马兜铃酸Ⅲa、马兜铃酸Ⅳa和马兜铃内酰胺Ι对照品适量，加70%甲醇制成每1ml含10ng的混合溶液，即得。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述马兜铃酸Ⅰ对照品贮备液的制备方法为：精密称取马兜铃酸Ⅰ对照品18.95mg，加70%甲醇溶解并稀释，摇匀即得，浓度为75.12ng/ml；所述马兜铃酸Ⅰ对照品溶液的制备方法为：精密量取马兜铃酸Ⅰ对照品贮备液60μl，加三氯甲烷-甲醇（3：7）混合溶液稀释，摇匀，即得，浓度为0.45ng/ml。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述百草油样品和混合溶液的体积比为1:49；所述混合溶液中，三氯甲烷和甲醇的体积比为3:7。
6.根据权利要求2或4所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述阴性对照溶液的制备方法为：取处方中除去细辛的其他药味，按处方比例制成缺细辛阴性对照样品，按照供试品溶液的制备方法制得缺细辛阴性对照溶液；所述阴性加对照品溶液的制备方法为：精密量取百草油阴性样品，加马兜铃酸Ⅰ对照品贮备液，加三氯甲烷-甲醇混合溶液溶解并稀释，摇匀，取续滤液即得。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述百草油阴性样品和马兜铃酸Ⅰ对照品贮备液的体积比为1:0.3；所述三氯甲烷-甲醇的体积比为3:7。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述超高效液相色谱的条件为：采用岛津Shim-pack Velox C18：2.1×100mm，2.7µm色谱柱，流动相A为甲醇，流动相B为含5mmol/L甲酸铵的0.1%甲酸溶液，梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml，进样量为2μl。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：0～5min，36～50%A； 5～11min，50～70%A；11～13min，70%A。
10.根据权利要求11-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述质谱的条件为：采用质谱检测器，电喷雾正离子模式（ESI+），进行多反应监测（MRM）；接口温度：300℃，脱溶剂温度：400℃，加热气流量：20L/min。
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| 谭乐俊，于新兰，林林，等.: "液质联用法测定鹭鸶咯丸中马兜铃酸类成分", 《中国现代中药》, vol. 25, no. 9, 26 April 2023 (2023-04-26), pages 1985 - 1991 * |
| 路军章，孙艳，魏锋.: "HPLC-MS用于中药马兜铃中6种马兜铃酸类成分的检测", 《解放军药学学报》, vol. 21, no. 3, 30 June 2005 (2005-06-30), pages 204 - 205 * |
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