CN106324128A - 中药材中马兜铃酸类化合物含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种中药材中马兜铃酸类化合物含量测定方法。本发明的所述方法能够同时测定含马兜铃酸类中药材中马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C，马兜铃酸D的含量，不仅能完善含马兜铃酸类化合物的中药材的质量评价，而且还能为马兜铃酸类化合物安全性评价提供科学依据。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种中药材中马兜铃酸类化合物含量测定方法。
背景技术
马兜铃酸类化合物是一类硝基菲羧酸，这类化合物天然存在于诸如马兜铃属(Aristolochia)及细辛属(Asarum)等马兜铃科植物中，其中诸如广防己、青木香、天仙藤、马兜铃、寻骨风、朱砂莲等药材仍然被列入2015年版中国药典中，早期发现马兜铃酸类化合物具有抗癌和抗感染等活性，可用于支气管炎、扁桃体炎、肾炎、前列腺炎等感染性疾病，但现在马兜铃酸类成分已经被确认为有明确的肾毒性、致癌、致畸作用，用药不当产生强烈的毒性反应，危急病人生命健康。因此，这些中药材中马兜铃酸类物质的质量控制研究可以为毒理学研究和保证临床用药安全提供科学的指导依据。目前，文献报道的含马兜铃酸化合物的中药材质量控制指标仅有马兜铃酸A的测定，还没有进行过系统的马兜铃酸类系列化合物的质量控制方法研究，这极大程度上限制了对马兜铃酸类化合物的整体质量控制研究及安全性评价。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种中药材中马兜铃酸类化合物含量测定方法。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种中药材中马兜铃酸类化合物含量测定方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液制备：称取中药材，经前处理，得供试品溶液；
(2)对照品溶液制备：称取标准品，溶解，得对照品溶液；
(3)测定：采用HPLC分别对供试品溶液和对照品溶液进行定性或定量检测。
优选地，所述中药材选自：马兜铃、青木香、天仙藤、寻骨风、朱砂莲。
优选地，所述马兜铃酸类化合物选自马兜铃酸A、马兜铃酸B、马兜铃酸C、马兜铃酸D。
优选地，步骤(1)中，所述前处理包括如下步骤：称取中药材，加入提取溶剂提取，离心，取上清液进行过滤。
进一步优选地，所述提取溶剂为甲醇。更优选，所述提取溶剂为体积百分比为70％的甲醇水溶液。
进一步优选地，每0.2g的中药材中加入提取溶剂3.0～5.0ml提取溶剂。更优选，每0.2g的中药材中加入提取溶剂4.0ml提取溶剂。
进一步优选地，加入提取溶剂提取时进行超声。更优选，所述超声的时间为20～40min。更优选，所述超声的时间为30min。
进一步优选地，所述离心的速度是3000～5000rpm。更优选，所述离心的速度是3500rpm。
进一步优选地，所述过滤采用微孔滤膜。更优选，采用0.22um微孔滤膜过滤。
进一步优选地，过滤后，放弃初滤液后，取续滤液作为供试品。
所述中药材称取时，应当精密称取。
优选地，步骤(2)中，所述标准品选自马兜铃酸A、马兜铃酸B、马兜铃酸C、马兜铃酸D。
优选地，步骤(2)中，对照品溶液的配置方法包括步骤：分别精密称取标准品适量，加入DMF溶解，然后再加入甲醇配置成标准品溶液，作为对照品溶液。
进一步优选地，所述甲醇为体积百分比为50～100％的甲醇水溶液。更优选地，所述甲醇为体积百分比为70％的甲醇水溶液。
优选地，步骤(2)中，对照品溶液中各标准品的浓度为50～100μg/ml。
优选地，步骤(3)中，所述定性方法包括步骤：采用HPLC在相同色谱条件下分别测定供试品溶液和对照品溶液，将获得的供试品溶液的色谱图，与对照品溶液的色谱图进行比较，根据相对保留时间和特征峰，确认供试品溶液中马兜铃酸类化合物的特征峰，从而对供试品溶液中马兜铃酸类化合物成分进行定性。
优选地，步骤(3)中，所述定量方法包括步骤：采用HPLC在相同色谱条件下分别测定供试品溶液和对照品溶液，将获得的供试品溶液的色谱图及其峰面积，按照内标法计算供试品溶液中马兜铃酸类化合物成分的含量。
优选地，所述内标法是指：分别移取一系列不同体积的标准品溶液，配置一系列不同浓度的对照品溶液，采用HPLC进样分析，获得对照品溶液中马兜铃酸类化合物含量与峰面积的线形关系，计算得到各标准工作曲线的回归方程；再将供试品采用HPLC检测，将获得的供试品中马兜铃酸类化合物的色谱峰面积分别代入相应的标准曲线工作回归方程中，计算可得到相应马兜铃酸类化合物的含量。
优选地，步骤(3)中，HPLC所用色谱柱为：Agilent proshell EC-C18 4.6*50mm2.7um。
优选地，流动相中，A相为乙腈，B相为0.1～0.5％(体积百分含量)乙酸水溶液，A相与B相的体积比为：(30～70)：(70～30)。
更优选地，流动相中，A相为乙腈，B相为0.2％(体积百分含量)乙酸水溶液，A相与B相的体积比为40：60。
优选地，流速为0.5～1.5ml min-1。更优选为0.65ml min-1。
优选地，柱温为20～40℃。更优选为30℃。
优选地，检测波长为200～300nm。更优选地为254nm。
优选地，进样量为5～30μL。更优选为10μL。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的方法能够同时测定含马兜铃酸类中药材中马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C，马兜铃酸D的含量，不仅能完善含马兜铃酸类化合物的中药材的质量评价，而且还能为马兜铃酸类化合物安全性评价提供科学依据。
附图说明
图1为马兜铃酸A对照品色谱图。
图2为马兜铃酸B对照品色谱图。
图3为马兜铃酸C对照品色谱图。
图4为马兜铃酸D对照品色谱图。
图5为马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D对照品色谱图。
图6为马兜铃药材中含量测定色谱图。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1
马兜铃药材中马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C，马兜铃酸D的含量测定
1-1：实验仪器和试剂：
Agilent1200型高效液相色谱仪，配置四元泵，在线真空脱气机，二极管阵列检测器，柱温箱。
甲醇，乙腈(色谱纯，购自honeywell公司)；甲醇(分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司)；自制超纯水。
马兜铃酸A(AAⅠ含量97％)；马兜铃酸B(AAⅢ含量95.94％)；马兜铃酸C(AAⅢ含量96.1％)；马兜铃酸D(AAⅣa含量97.1％)诗丹德生物技术有限公司；
马兜铃酸药材，MDL01-MDL09购自安徽亳州药材饮片市场、河北安国药材饮片市场。
1-2：色谱条件：
色谱柱：Agilent proshell EC-C18 4.6*50mm 2.7um；流动相：乙腈-0.2％乙酸水(40:60)；流速0.65ml/min；检测波长：254nm；柱温：30℃,进样量：10μL。
1-3：供试品溶液制备：
精密称取药材0.2g，精密加入4.0ml 70％甲醇水溶液，浸润15min，超声30min，3500rpm离心，分离上清液，向残渣中精密加入4.5ml70％甲醇水溶液，超声30min，3500rpm离心合并两次上清液，定容到10ml容量瓶中。0.22um微孔滤膜过滤，即得。
1-4：对照品溶液制备：
精密称取马兜铃酸A 5.36mg，马兜铃酸B 2.9mg，马兜铃酸C 2.15mg，马兜铃酸D1.89mg，少量DMF溶解，用70％甲醇水溶液配制成浓度为马兜铃酸A 134ug/ml，马兜铃酸B72.5ug/ml，马兜铃酸C 53.75ug/ml，马兜铃酸D 47.25ug/ml的标准品溶液。
1-5：线性与范围：
取马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C，马兜铃酸D混合对照品溶液，按比例稀释至一定浓度，按1-2项下色谱条件进行实验，记录峰面积，计算线性方程，相关系数。结果表明：马兜铃酸A的线性方程为：y＝31946.15x-26.79，R2＝0.9992，在134～0.13ug/ml范围内线性关系良好。马兜铃酸B的线性方程为：y＝44118.13x-6.74，R2＝0.9995，在72.5～0.071ug/ml范围内线性关系良好。马兜铃酸C线性方程为：y＝18492.5x+42.67，R2＝0.9994；分别在53.75～1.075ug/ml范围内线性关系良好。马兜铃酸D的线性方程为：y＝21689.02x+38.18，R2＝0.9995；分别在47.25～0.945ug/ml范围内线性关系良好。
1-6：准确度实验：
取药材0.1g，精密称定6份，分别加入一定量的对照品溶液，按供试品制备方法制备，按1-2项下色谱条件进行实验，记录峰面积，分别计算马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D的含量，计算准确度，计算RSD值，结果表明，马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C，马兜铃酸D回收率平均值分别为101.24％，100.03％，102.99％，103.57％，RSD值分别为2.35％，1.78％，3,12％，1.96％，表明准确度良好。
1-7：重复性实验：
按供试品制备方法，制备六份供试品溶液，按1-2项下色谱条件进行实验，记录峰面积，分别计算马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D的含量，计算RSD值，结果表明马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D含量RSD值分别为1.02％，0.98％，1.34％，1.26％，供试品溶液重复性良好。
1-8:精密度实验：
按供试品制备方法，连续三日每日制备三份供试品溶液，按1-2项下色谱条件进行实验，记录峰面积，分别计算马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D的含量，计算RSD值，结果表明马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D含量RSD值分别为1.15％，1.36％，2.14％，2.31％，供试品溶液日内、日间精密度良好。
1-9：稳定性试验：
取相同的供试品溶液，按1-2项下色谱条件进行实验，分别在0,2,4,8,12,24h进行测定，记录峰面积，分别计算马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D的含量，计算RSD值，结果表明马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D含量RSD值分别为1.32％，2.14％，1.72％，2.18％，供试品溶液在24h内稳定性良好。
1-10：样品测定：
按供试品制备方法测定药材中马兜铃酸A，B，C，D的含量，结果如下：
表1马兜铃酸药材中马兜铃酸A,B,C,D含量测定结果
此外，马兜铃酸A对照品色谱图如图1所示。马兜铃酸B对照品色谱图如图2所示。马兜铃酸C对照品色谱图如图3所示。马兜铃酸C对照品色谱图如图4所示。马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D对照品色谱图如图5所示。马兜铃药材中含量测定色谱图如图6所示。
实施例2
青木香药材中马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C，马兜铃酸D的含量测定
1-1：实验仪器和试剂：
Agilent1200型高效液相色谱仪，配置四元泵，在线真空脱气机，二极管阵列检测器，柱温箱。
甲醇，乙腈(色谱纯，购自honeywell公司)；甲醇(分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司)；自制超纯水。
马兜铃酸A(AAⅠ含量97％)；马兜铃酸B(AAⅢ含量95.94％)；马兜铃酸C(AAⅢ含量96.1％)；马兜铃酸D(AAⅣa含量97.1％)诗丹德生物技术有限公司；
青木香药材，购自安徽亳州药材饮片市场。
1-2：色谱条件：
色谱柱：Agilent proshell EC-C18 4.6*50mm 2.7um；流动相：乙腈-0.2％乙酸水(40:60)；流速0.65ml/min；检测波长：254nm；柱温：30℃,进样量：10μL。
1-3：供试品溶液制备：
精密称取药材0.2g，精密加入4.0ml 70％甲醇水溶液，浸润15min，超声30min，3500rpm离心，分离上清液，向残渣中精密加入4.5ml70％甲醇水溶液，超声30min，3500rpm离心合并两次上清液，定容到10ml容量瓶中。0.22um微孔滤膜过滤，即得。
1-4：对照品溶液制备：
精密称取马兜铃酸A 5.12mg，马兜铃酸B 3.21mg，马兜铃酸C 2.56mg，马兜铃酸D2.01mg，少量DMF溶解，用70％甲醇水溶液配制成浓度为马兜铃酸A 128ug/ml，马兜铃酸B80.25ug/ml，马兜铃酸C 64ug/ml，马兜铃酸D 50.25ug/ml的标准品溶液。
1-5：线性与范围：
取马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C，马兜铃酸D混合对照品溶液，按比例稀释至一定浓度，按1-2项下色谱条件进行实验，记录峰面积，计算线性方程，相关系数。结果表明：马兜铃酸A的线性方程为：y＝33523.15x-18.17，R2＝0.9994，在128～0.13ug/ml范围内线性关系良好。马兜铃酸B的线性方程为：y＝45634.13x–10.24，R2＝0.9991，在80.25～0.1605ug/ml范围内线性关系良好。马兜铃酸C线性方程为：y＝17995.2x+28.32，R2＝0.9993；分别在64～0.128ug/ml范围内线性关系良好。马兜铃酸D的线性方程为：y＝22654.22x+41.32，R2＝0.9992；分别在50.25～0.11ug/ml范围内线性关系良好。
1-6：准确度实验：
取药材0.1g，精密称定6份，分别加入一定量的对照品溶液，按供试品制备方法制备，按1-2项下色谱条件进行实验，记录峰面积，分别计算马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D的含量，计算准确度，计算RSD值，结果表明，马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C，马兜铃酸D回收率平均值分别为101.24％，99.97％，100.54％，98.52％，RSD值分别为1.67％，1.45％，2.14％，2.03％，表明准确度良好。
1-7：重复性实验：
按供试品制备方法，制备六份供试品溶液，按1-2项下色谱条件进行实验，记录峰面积，分别计算马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D的含量，计算RSD值，结果表明马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D含量RSD值分别为1.13％，1.22％，1.55％，1.65％，供试品溶液重复性良好。
1-8:精密度实验：
按供试品制备方法，连续三日每日制备三份供试品溶液，按1-2项下色谱条件进行实验，记录峰面积，分别计算马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D的含量，计算RSD值，结果表明马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D含量RSD值分别为1.34％，1.76％，1.73％，1.99％，供试品溶液日内、日间精密度良好。
1-9：稳定性试验：
取相同的供试品溶液，按1-2项下色谱条件进行实验，分别在0,2,4,8,12,24h进行测定，记录峰面积，分别计算马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D的含量，计算RSD值，结果表明马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D含量RSD值分别为1.14％，1.98％，1.65％，2.44％，供试品溶液在24h内稳定性良好。
1-10：样品测定：
按供试品制备方法测定药材中马兜铃酸A，B，C，D的含量，结果如下：
表2青木香药材中马兜铃酸A,B,C,D含量测定结果
实施例3
天仙藤药材中马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C，马兜铃酸D的含量测定
1-1：实验仪器和试剂：
Agilent1200型高效液相色谱仪，配置四元泵，在线真空脱气机，二极管阵列检测器，柱温箱。
甲醇，乙腈(色谱纯，购自honeywell公司)；甲醇(分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司)；自制超纯水。
马兜铃酸A(AAⅠ含量97％)；马兜铃酸B(AAⅢ含量95.94％)；马兜铃酸C(AAⅢ含量96.1％)；马兜铃酸D(AAⅣa含量97.1％)诗丹德生物技术有限公司；
天仙藤药材，购自安徽亳州药材饮片市场。
1-2：色谱条件：
色谱柱：Agilent proshell EC-C18 4.6*50mm 2.7um；流动相：乙腈-0.2％乙酸水(40:60)；流速0.65ml/min；检测波长：254nm；柱温：30℃,进样量：10μL。1-3：供试品溶液制备：
精密称取药材0.2g，精密加入4.0ml 70％甲醇水溶液，浸润15min，超声30min，3500rpm离心，分离上清液，向残渣中精密加入4.5ml70％甲醇水溶液，超声30min，3500rpm离心合并两次上清液，定容到10ml容量瓶中。0.22um微孔滤膜过滤，即得。
1-4：对照品溶液制备：
精密称取马兜铃酸A 5.12mg，马兜铃酸B 3.21mg，马兜铃酸C 2.56mg，马兜铃酸D2.01mg，少量DMF溶解，用70％甲醇水溶液配制成浓度为马兜铃酸A 128ug/ml，马兜铃酸B80.25ug/ml，马兜铃酸C 64ug/ml，马兜铃酸D 50.25ug/ml的标准品溶液。
1-5：线性与范围：
取马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C，马兜铃酸D混合对照品溶液，按比例稀释至一定浓度，按1-2项下色谱条件进行实验，记录峰面积，计算线性方程，相关系数。结果表明：马兜铃酸A的线性方程为：y＝33523.15x-18.17，R2＝0.9994，在128～0.13ug/ml范围内线性关系良好。马兜铃酸B的线性方程为：y＝45634.13x–10.24，R2＝0.9991，在80.25～0.1605ug/ml范围内线性关系良好。马兜铃酸C线性方程为：y＝17995.2x+28.32，R2＝0.9993；分别在64～0.128ug/ml范围内线性关系良好。马兜铃酸D的线性方程为：y＝22654.22x+41.32，R2＝0.9992；分别在50.25～0.11ug/ml范围内线性关系良好。
1-6：准确度实验：
取药材0.1g，精密称定6份，分别加入一定量的对照品溶液，按供试品制备方法制备，按1-2项下色谱条件进行实验，记录峰面积，分别计算马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D的含量，计算准确度，计算RSD值，结果表明，马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C，马兜铃酸D回收率平均值分别为102.76％，103.38％，101.98％，103.33％，RSD值分别为2.11％，2.37％，1.98％，2.85％，表明准确度良好。
1-7：重复性实验：
按供试品制备方法，制备六份供试品溶液，按1-2项下色谱条件进行实验，记录峰面积，分别计算马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D的含量，计算RSD值，结果表明马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D含量RSD值分别为1.66％，1.92％，1.86％，1.68％，供试品溶液重复性良好。
1-8：精密度实验：
按供试品制备方法，连续三日每日制备三份供试品溶液，按1-2项下色谱条件进行实验，记录峰面积，分别计算马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D的含量，计算RSD值，结果表明马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D含量RSD值分别为1.55％，1.86％，1.97％，2.15％，供试品溶液日内、日间精密度良好。
1-9：稳定性试验：取相同的供试品溶液，按1-2项下色谱条件进行实验，分别在0,2,4,8,12,24h进行测定，记录峰面积，分别计算马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D的含量，计算RSD值，结果表明马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D含量RSD值分别为1.37％，1.68％，1.46％，1.76％，供试品溶液在24h内稳定性良好。
1-10：样品测定：
按供试品制备方法测定药材中马兜铃酸A，B，C，D的含量，结果如下：
表3天仙藤药材中马兜铃酸A,B,C,D含量测定结果
实施例4
寻骨风药材中马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C，马兜铃酸D的含量测定
1-1：实验仪器和试剂：
Agilent1200型高效液相色谱仪，配置四元泵，在线真空脱气机，二极管阵列检测器，柱温箱。
甲醇，乙腈(色谱纯，购自honeywell公司)；甲醇(分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司)；自制超纯水。
马兜铃酸A(AAⅠ含量97％)；马兜铃酸B(AAⅢ含量95.94％)；马兜铃酸C(AAⅢ含量96.1％)；马兜铃酸D(AAⅣa含量97.1％)诗丹德生物技术有限公司；
寻骨风购自安徽亳州药材饮片市场、河北安国药材饮片市场。
1-2：色谱条件：
色谱柱：Agilent proshell EC-C18 4.6*50mm 2.7um；流动相：乙腈-0.2％乙酸水(40:60)；流速0.65ml/min；检测波长：254nm；柱温：30℃,进样量：10μL。
1-3：供试品溶液制备：
精密称取药材0.2g，精密加入4.0ml 70％甲醇水溶液，浸润15min，超声30min，3500rpm离心，分离上清液，向残渣中精密加入4.5ml70％甲醇水溶液，超声30min，3500rpm离心合并两次上清液，定容到10ml容量瓶中。0.22um微孔滤膜过滤，即得。
1-4：对照品溶液制备：
精密称取马兜铃酸A 5.12mg，马兜铃酸B 3.21mg，马兜铃酸C 2.56mg，马兜铃酸D2.01mg，少量DMF溶解，用70％甲醇水溶液配制成浓度为马兜铃酸A 128ug/ml，马兜铃酸B80.25ug/ml，马兜铃酸C 64ug/ml，马兜铃酸D 50.25ug/ml的标准品溶液。
1-5：线性与范围：
取马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C，马兜铃酸D混合对照品溶液，按比例稀释至一定浓度，按1-2项下色谱条件进行实验，记录峰面积，计算线性方程，相关系数。结果表明：马兜铃酸A的线性方程为：y＝33523.15x-18.17，R2＝0.9994，在128～0.13ug/ml范围内线性关系良好。马兜铃酸B的线性方程为：y＝45634.13x–10.24，R2＝0.9991，在80.25～0.1605ug/ml范围内线性关系良好。马兜铃酸C线性方程为：y＝17995.2x+28.32，R2＝0.9993；分别在64～0.128ug/ml范围内线性关系良好。马兜铃酸D的线性方程为：y＝22654.22x+41.32，R2＝0.9992；分别在50.25～0.11ug/ml范围内线性关系良好。
1-6：准确度实验：
取药材0.1g，精密称定6份，分别加入一定量的对照品溶液，按供试品制备方法制备，按1-2项下色谱条件进行实验，记录峰面积，分别计算马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D的含量，计算准确度，计算RSD值，结果表明，马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C，马兜铃酸D回收率平均值分别为99.65％，95.45％，98.21％，101.87％，RSD值分别为1.98％，2.96％，3.14％，2.99％，表明准确度良好。
1-7：重复性实验：
按供试品制备方法，制备六份供试品溶液，按1-2项下色谱条件进行实验，记录峰面积，分别计算马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D的含量，计算RSD值，结果表明马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D含量RSD值分别为2.15％，3.32％，2.76％，2.49％，供试品溶液重复性良好。
1-8：精密度实验：
按供试品制备方法，连续三日每日制备三份供试品溶液，按1-2项下色谱条件进行实验，记录峰面积，分别计算马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D的含量，计算RSD值，结果表明马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D含量RSD值分别为2.13％，3.20％，2.54％，3.87％，供试品溶液日内、日间精密度良好。
1-9：稳定性试验：
取相同的供试品溶液，按1-2项下色谱条件进行实验，分别在0,2,4,8,12,24h进行测定，记录峰面积，分别计算马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D的含量，计算RSD值，结果表明马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D含量RSD值分别为2.11％，2.54％，1.98％，3.23％，供试品溶液在24h内稳定性良好。
1-10：样品测定：
按供试品制备方法测定药材中马兜铃酸A，B，C，D的含量，结果如下：
表4寻骨风药材中马兜铃酸A，B，C，D含量测定结果
实施例5
朱砂莲药材中马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C，马兜铃酸D的含量测定
1-1：实验仪器和试剂：
Agilent1200型高效液相色谱仪，配置四元泵，在线真空脱气机，二极管阵列检测器，柱温箱。
甲醇，乙腈(色谱纯，购自honeywell公司)；甲醇(分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司)；自制超纯水。
马兜铃酸A(AAⅠ含量97％)；马兜铃酸B(AAⅢ含量95.94％)；马兜铃酸C(AAⅢ含量96.1％)；马兜铃酸D(AAⅣa含量97.1％)诗丹德生物技术有限公司；
朱砂莲药材，购自河北安国药材饮片市场。
1-2：色谱条件：
色谱柱：Agilent proshell EC-C18 4.6*50mm 2.7um；流动相：乙腈-0.2％乙酸水(40:60)；流速0.65ml/min；检测波长：254nm；柱温：30℃,进样量：10μL。
1-3：供试品溶液制备：
精密称取药材0.2g，精密加入4.0ml 70％甲醇水溶液，浸润15min，超声30min，3500rpm离心，分离上清液，向残渣中精密加入4.5ml70％甲醇水溶液，超声30min，3500rpm离心合并两次上清液，定容到10ml容量瓶中。0.22um微孔滤膜过滤，即得。
1-4：对照品溶液制备：
精密称取马兜铃酸A 5.12mg，马兜铃酸B 3.21mg，马兜铃酸C 2.56mg，马兜铃酸D2.01mg，少量DMF溶解，用70％甲醇水溶液配制成浓度为马兜铃酸A 128ug/ml，马兜铃酸B80.25ug/ml，马兜铃酸5C 64ug/ml，马兜铃酸D 50.25ug/ml的标准品溶液。
1-5：线性与范围：
取马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C，马兜铃酸D混合对照品溶液，按比例稀释至一定浓度，按1-2项下色谱条件进行实验，记录峰面积，计算线性方程，相关系数。结果表明：马兜铃酸A的线性方程为：y＝33523.15x-18.17，R2＝0.9994，在128～0.13ug/ml范围内线性关系良好。马兜铃酸B的线性方程为：y＝45634.13x–10.24，R2＝0.9991，在80.25～0.1605ug/ml范围内线性关系良好。马兜铃酸C线性方程为：y＝17995.2x+28.32，R2＝0.9993；分别在64～0.128ug/ml范围内线性关系良好。马兜铃酸D的线性方程为：y＝22654.22x+41.32，R2＝0.9992；分别在50.25～0.11ug/ml范围内线性关系良好。
1-6：准确度实验：
取药材0.1g，精密称定6份，分别加入一定量的对照品溶液，按供试品制备方法制备，按1-2项下色谱条件进行实验，记录峰面积，分别计算马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D的含量，计算准确度，计算RSD值，结果表明，马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C，马兜铃酸D回收率平均值分别为101.32％，102.99％，99.53％，103.24％，RSD值分别为2.14％，3.22％，2.36％，3.45％，表明准确度良好。
1-7：重复性实验：
按供试品制备方法，制备六份供试品溶液，按1-2项下色谱条件进行实验，记录峰面积，分别计算马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D的含量，计算RSD值，结果表明马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D含量RSD值分别为3.11％，2.96％，2.69％，2.55％，供试品溶液重复性良好。
1-8:精密度实验：
按供试品制备方法，连续三日每日制备三份供试品溶液，按1-2项下色谱条件进行实验，记录峰面积，分别计算马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D的含量，计算RSD值，结果表明马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D含量RSD值分别为1.99％，2.46％，2.88％，2.65％，供试品溶液日内、日间精密度良好。
1-9：稳定性试验：
取相同的供试品溶液，按1-2项下色谱条件进行实验，分别在0,2,4,8,12,24h进行测定，记录峰面积，分别计算马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D的含量，计算RSD值，结果表明马兜铃酸A，马兜铃酸B，马兜铃酸C,马兜铃酸D含量RSD值分别为2.32％，2.78％，2.99％，3.12％，供试品溶液在24h内稳定性良好。
1-10：样品测定：
按供试品制备方法测定药材中马兜铃酸A，B，C，D的含量，结果如下：
表5朱砂莲药材中马兜铃酸A，B，C，D含量测定结果
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种中药材中马兜铃酸类化合物含量测定方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液制备：称取中药材，经前处理，得供试品溶液；
(2)对照品溶液制备：称取标准品，溶解，得对照品溶液；
(3)测定：采用HPLC分别对供试品溶液和对照品溶液进行定性或定量检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中药材选自：马兜铃、青木香、天仙藤、寻骨风、朱砂莲。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述马兜铃酸类化合物选自马兜铃酸A、马兜铃酸B、马兜铃酸C、马兜铃酸D。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述前处理包括如下步骤：称取中药材，加入提取溶剂提取，离心，取上清液进行过滤。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，还包括以下特征中的任一项或多项：
1)所述提取溶剂为甲醇；
2)每0.2g的中药材中加入提取溶剂3.0～5.0ml提取溶剂；
3)加入提取溶剂提取时进行超声；
4)所述离心的速度是3000～5000rpm；
5)所述过滤采用微孔滤膜。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述标准品选自马兜铃酸A、马兜铃酸B、马兜铃酸C、马兜铃酸D。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，对照品溶液的配置方法包括步骤：分别精密称取标准品适量，加入DMF溶解，然后再加入甲醇配置成标准品溶液，作为对照品溶液。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述定性方法包括步骤：采用HPLC在相同色谱条件下分别测定供试品溶液和对照品溶液，将获得的供试品溶液的色谱图，与对照品溶液的色谱图进行比较，根据相对保留时间和特征峰，确认供试品溶液中马兜铃酸类化合物的特征峰，从而对供试品溶液中马兜铃酸类化合物成分进行定性。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述定量方法包括步骤：采用HPLC在相同色谱条件下分别测定供试品溶液和对照品溶液，将获得的供试品 溶液的色谱图及其峰面积，按照内标法计算供试品溶液中马兜铃酸类化合物成分的含量。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，还包括以下特征中的任一项或多项：
1)HPLC所用色谱柱为：Agilent proshell EC-C18 4.6*50mm 2.7um；
2)流动相中，A相为乙腈，B相为0.1～0.5％(体积百分含量)乙酸水溶液，A相与B相的体积比为：(30～70)：(70～30)；
3)流速为0.5～1.5ml min-1；
4)柱温为20～40℃；
5)检测波长为200～300nm；
6)进样量为5～30μL。
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108627582A (zh) * | 2018-05-08 | 2018-10-09 | 贵州景诚制药有限公司 | 一种用于止痛的大青木香药物 |
| CN109721583A (zh) * | 2019-02-26 | 2019-05-07 | 成都瑞芬思生物科技有限公司 | 一种马兜铃酸a和马兜铃酸b标准品的制备方法 |
| CN113252810A (zh) * | 2021-04-27 | 2021-08-13 | 河北省药品医疗器械检验研究院(河北省化妆品检验研究中心) | 一种细辛中6种马兜铃酸类成分的含量测定方法 |
| CN117147738A (zh) * | 2023-10-31 | 2023-12-01 | 吉林市双士药业有限公司 | 一种醒脑再造丸中马兜铃酸ⅰ的检测方法 |
| CN117517537A (zh) * | 2023-10-27 | 2024-02-06 | 山东省食品药品检验研究院 | 一种基于消除基质效应检测百草油中马兜铃酸的方法 |
| CN117805273A (zh) * | 2023-12-28 | 2024-04-02 | 浙江苏可安药业有限公司 | 一种克痢痧胶囊中5种马兜铃酸类物质的定量检测方法及应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101455695A (zh) * | 2007-12-11 | 2009-06-17 | 广西壮族自治区花红药业股份有限公司 | 细辛药材和消肿止痛酊中马兜铃酸a的质量控制方法 |
| CN102579961A (zh) * | 2011-01-04 | 2012-07-18 | 广西壮族自治区花红药业股份有限公司 | 消肿止痛酊中马兜铃酸a的质量控制方法 |
| CN103018394A (zh) * | 2013-01-01 | 2013-04-03 | 吉林紫鑫药业股份有限公司 | 一种龙胆泻肝颗粒的检测方法 |
-
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101455695A (zh) * | 2007-12-11 | 2009-06-17 | 广西壮族自治区花红药业股份有限公司 | 细辛药材和消肿止痛酊中马兜铃酸a的质量控制方法 |
| CN102579961A (zh) * | 2011-01-04 | 2012-07-18 | 广西壮族自治区花红药业股份有限公司 | 消肿止痛酊中马兜铃酸a的质量控制方法 |
| CN103018394A (zh) * | 2013-01-01 | 2013-04-03 | 吉林紫鑫药业股份有限公司 | 一种龙胆泻肝颗粒的检测方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 《 解放军药学学报》 * |
| 《世界科学技术-中医药现代化》 * |
| 《中成药》 * |
| 《中药材》 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108627582A (zh) * | 2018-05-08 | 2018-10-09 | 贵州景诚制药有限公司 | 一种用于止痛的大青木香药物 |
| CN109721583A (zh) * | 2019-02-26 | 2019-05-07 | 成都瑞芬思生物科技有限公司 | 一种马兜铃酸a和马兜铃酸b标准品的制备方法 |
| CN113252810A (zh) * | 2021-04-27 | 2021-08-13 | 河北省药品医疗器械检验研究院(河北省化妆品检验研究中心) | 一种细辛中6种马兜铃酸类成分的含量测定方法 |
| CN117517537A (zh) * | 2023-10-27 | 2024-02-06 | 山东省食品药品检验研究院 | 一种基于消除基质效应检测百草油中马兜铃酸的方法 |
| CN117147738A (zh) * | 2023-10-31 | 2023-12-01 | 吉林市双士药业有限公司 | 一种醒脑再造丸中马兜铃酸ⅰ的检测方法 |
| CN117147738B (zh) * | 2023-10-31 | 2024-02-27 | 吉林市双士药业有限公司 | 一种醒脑再造丸中马兜铃酸ⅰ的检测方法 |
| CN117805273A (zh) * | 2023-12-28 | 2024-04-02 | 浙江苏可安药业有限公司 | 一种克痢痧胶囊中5种马兜铃酸类物质的定量检测方法及应用 |
| CN117805273B (zh) * | 2023-12-28 | 2024-06-14 | 浙江苏可安药业有限公司 | 一种克痢痧胶囊中5种马兜铃酸类物质的定量检测方法及应用 |
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