CN117805273A

CN117805273A - 一种克痢痧胶囊中5种马兜铃酸类物质的定量检测方法及应用

Info

Publication number: CN117805273A
Application number: CN202311847119.8A
Authority: CN
Inventors: 梁爱华; 刘素彦; 鲁潇; 杨涛; 宋燕红; 苏艳
Original assignee: Zhejiang Sukean Pharmaceutical Co ltd; Institute of Materia Medica of CACMS
Current assignee: Zhejiang Sukean Pharmaceutical Co ltd; Institute of Materia Medica of CACMS
Priority date: 2023-12-28
Filing date: 2023-12-28
Publication date: 2024-04-02
Anticipated expiration: 2043-12-28
Also published as: CN117805273B

Abstract

本发明开发了一种克痢痧胶囊中5种马兜铃酸类物质的定量检测方法及应用，属于色谱分析领域。所述的定量检测方法包括使用超高效液相色谱串联质谱法；所述的超高效液相色谱条件包括：流动相A中包含4.0‑6.0mM醋酸铵和质量分数0.05％‑0.15％甲酸，溶剂为水；流动相B为甲醇。该方法能同时检测5种马兜铃酸类成分的含量。本方法专属性好、检测限低、重复性好，为克痢痧胶囊的质量检测提供新的选择。

Description

一种克痢痧胶囊中5种马兜铃酸类物质的定量检测方法及应用

技术领域

本发明属于色谱分析领域，具体涉及一种克痢痧胶囊中5种马兜铃酸类物质的定量检测方法及应用。

背景技术

克痢痧胶囊，解毒辟秽，理气止泻；用于泄泻和痧气(中暑)。克痢痧胶囊由白芷、苍术、石菖蒲、细辛、荜茇、鹅不食草、猪牙皂、雄黄、丁香、硝石、白矾、冰片十二种中药材制作而成。

马兜铃酸，简称AAs，是一类硝基菲羧酸类化合物，主要存在于马兜铃属和细辛属药材中。其中，马兜铃属中含有马兜铃酸的药材有大叶青木香、朱砂莲、马兜铃、天仙藤、青木香、广防己等。细辛一般为马兜铃科植物北细辛、汉城细辛或华细辛的干燥根茎。

高剂量的马兜铃酸(AAs)能够直接引起急性肾小管上皮细胞坏死，进而引起肾间质纤维化，最终导致肾衰竭。大多数急性马兜铃酸肾病患者肾功能无法恢复而转为慢性马兜铃酸肾病。低剂量长期摄入马兜铃酸也会引起肾脏的不可逆损伤。马兜铃酸I和马兜铃酸II为主要的肾毒性物质成分。马兜铃酸I经过代谢后，能够在肾内形成马兜铃内酰胺-DNA加合物，这种加合物性质稳定、难以降解，会在肾内长期存在。该加合物的形成会导致基因突变，进而导致肾小管损伤和肾间质纤维化，使病人患肾病和上尿路上皮癌的概率大大增高，马兜铃酸为Ⅰ类致癌物。马兜铃酸II也具有肾毒性，但是相对于马兜铃酸I，其肾毒性明显减轻。研究显示，马兜铃酸I和马兜铃酸II共同暴露时，可提高马兜铃酸I的生物活化，增加马兜铃酸I和DNA加合物的形成，因此马兜铃酸I和马兜铃酸II共存时致癌风险更高。马兜铃内酰胺I的细胞毒性比马兜铃酸I强，但是体内长期毒性比马兜铃酸I低。

细辛中主要马兜铃酸类成分为马兜铃酸IVa和马兜铃内酰胺I。除此之外，还含有少量的马兜铃酸I。据统计，目前有两百多种含细辛的中成药应用于临床，因此建立细辛及含细辛中成药中马兜铃酸类物质快速、简便、灵敏的分析技术对该类药物的安全评估及质量监控有重要意义。

现有技术CN113252810B公开了一种细辛中6种马兜铃酸类成分的含量测定方法，以乙腈为流动相A，0.1％-0.2％甲酸为流动相B，采用梯度洗脱，同时测定细辛中马兜铃酸A、马兜铃酸B、马兜铃酸C、马兜铃酸D、马兜铃酸Ⅲ及马兜铃酸Ⅶa六种成分含量的测定方法。该方法重复性试验RSD为7.5％-8.5％，重复性较差。细辛中马兜铃酸类成分以马兜铃酸IVa及马兜铃内酰胺I为主，该方法并未能对马兜铃内酰胺I进行定量分析。

现有技术CN111650316A公开了一种基于UPLC法对追风透骨胶囊中马兜铃酸Ⅰ含量检测的方法及样品前处理方法，该方法通过采用液液萃取和固相萃取相结合的方式对追风透骨胶囊样品进行前处理，结合UPLC对追风透骨胶囊中的马兜铃酸Ⅰ含量进行分析，流动相的组成为10mmol/L乙酸铵溶液(含0.05％冰乙酸)-乙腈，该方法前处理繁琐，仅能检测马兜铃酸Ⅰ的含量。

发明内容

为了解决上述问题，本发明开发了一种克痢痧胶囊中5种马兜铃酸类物质定量检测方法及应用。该方法用于5种马兜铃酸类成分的含量检测。所述的马兜铃酸类成分包括马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃酸IIIa、马兜铃酸IVa和马兜铃内酰胺I中的一种或多种。

一方面，本发明提供了一种马兜铃酸类成分的定量检测方法。

具体地，所述的定量检测方法包括使用超高效液相色谱串联质谱法；所述的超高效液相色谱条件包括：

流动相A中包含4.0-6.0mM醋酸铵和质量分数为0.05％-0.15％甲酸，溶剂为水；

流动相B为甲醇。

优选地，所述的流动相A中包含5.0mM醋酸铵和质量分数0.1％甲酸。

具体地，所述的超高效液相色谱条件还包括梯度洗脱程序：

优选地，所述的梯度洗脱程序为：

起始时间/min	流动相A/％	流动相B/％
			0	80	20
1.0	80	20
			7.0	25	75
7.2	10	90
			10.2	10	90
10.3	80	20
			12.0	80	20

。

具体地，所述的超高效液相色谱的色谱柱为BEH C18，规格为1.7μm，2.1mm×50mm。

具体地，所述质谱的条件包括使用三重四级杆质谱仪。

优选地，所述的三重四级杆质谱仪采用Xevo TQ-S。

具体地，所述质谱的条件还包括定量检测扫描；所述的定量检测扫描方式为多反应监测扫描；采用正离子模式采集。

具体地，所述质谱的条件还包括：锥孔温度150±10℃，脱溶剂气温度500±10℃，脱溶剂气流速800±200L/h。

另一方面，本发明提供了上述定量检测方法在马兜铃酸类成分评价中的应用。

具体地，用于评价马兜铃酸类成分的种类和/或含量。

作为优选，评价的对象可以是药物；所述的药物中包括马兜铃属药材和/或细辛属药材作为原料。

具体地，所述的马兜铃酸类成分包括马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃酸IIIa、马兜铃酸IVa和马兜铃内酰胺I中的一种或多种。

本发明中，所述的马兜铃酸I为：

所述的马兜铃酸II为：

所述的马兜铃酸IIIa为：

所述的马兜铃酸IVa为：

所述的马兜铃内酰胺I为：

优选地，所述的应用为用于评价克痢痧胶囊。

再一方面，本发明提供了一种克痢痧胶囊的质量评价方法。

具体地，包括上述的定量检测方法。

具体地，包括以下步骤：

S1、供试品溶液、标准溶液、阴性对照样品溶液配制；

S2、将S1配制的供试品溶液和标准溶液使用上述定量检测方法检测；

S3、以阴性对照样品溶液为空白基质的标准曲线，计算供试品中马兜铃酸类物质的含量。

本发明的有益效果：

本发明开发了一种克痢痧胶囊中5种马兜铃酸类物质的定量检测方法及应用。所述的定量检测方法包括使用超高效液相色谱串联质谱法；所述的超高效液相色谱条件包括：流动相A中包含4.0-6.0mM醋酸铵和质量分数0.05％-0.15％甲酸，溶剂为水；流动相B为甲醇。该方法能同时检测克痢痧胶囊中5种马兜铃酸类成分的含量。所述的马兜铃酸类成分包括马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃酸IIIa、马兜铃酸IVa和马兜铃内酰胺I中的一种或多种。本方法专属性好、检测限低、重复性好，为克痢痧胶囊的质量检测提供新的选择。

附图说明

图1为专属性实验结果。

图2为流动相A为水(5.0mM醋酸铵，0.1％甲酸)时的离子流色谱图。

图3为流动相A为水(5.0mM醋酸铵)时的离子流色谱图。

图4为流动相A为水(0.1％甲酸)时的离子流色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1样品处理

(1)阴性对照样品溶液

分别称取不含细辛的克痢痧胶囊(浙江南洋药业有限公司提供)样品50.0mg20份，精密加入2.5mL 70％甲醇，超声处理(功率500W，频率40kHz)40min。4500rpm离心20min，取上清，氮气吹干，作为不含细辛的克痢痧胶囊阴性对照样品溶液。

(2)混合标准溶液

a)精密称取马兜铃酸I(中国食品药品检定研究院，110746-201912)，马兜铃酸II(成都普思生物科技有限公司，PS010654)，马兜铃酸IIIa(成都普思生物科技有限公司，PS010029)，马兜铃酸IVa(成都普思生物科技有限公司，PS010039)，马兜铃内酰胺I(成都普思生物科技有限公司，BB06B034)，加入甲醇配制成浓度为10μg/mL的标准储备液。分别从标准储备液中吸取一定量的标准溶液，配制成马兜铃酸I、马兜铃酸II浓度为1800ng/mL，马兜铃酸IIIa、马兜铃酸IVa浓度为1500ng/mL，马兜铃内酰胺I浓度为900ng/mL的混合标准溶液，并逐级稀释为马兜铃酸I、马兜铃酸II(1800.00、600.00、200.00、66.67、22.22、7.41、2.47、1.23ng/mL)，马兜铃酸IIIa和马兜铃酸IVa(1500.00、500.00、166.67、55.56、18.52、6.17、2.06、1.03ng/mL)，马兜铃内酰胺I(900.00、300.00、100.00、33.33、11.11、3.70、1.23、0.62ng/mL)的混合标准溶液备用。

b)分别从标准储备液中吸取一定量的标准溶液，配制成马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃酸IIIa、马兜铃酸IVa和马兜铃内酰胺I浓度为100ng/mL的混合标准溶液。

c)取上述b)混合标准溶液稀释2.5倍，得到浓度为40ng/mL的混合标准溶液。

将(1)中的阴性对照溶液吹干，并将(2)中的a)混合标准溶液加入到吹干的阴性对照溶液中，混匀。12000×g，离心15min后，取上清备用。

(3)供试品溶液

将同一批次的克痢痧胶囊[批1(220320)；批2(211102)；批3(211101)；批4(220321)；批5(210720)；批6(210203)；批7(210103)；批8(220301)；批9(220101)；批10(220203)]外壳去掉，粉末取出并混合均匀。精确称取克痢痧胶囊样品50.0mg，加入2.5mL70％甲醇溶液，超声处理(功率500W，频率40kHz)40min。4500rpm离心20min，取上清，氮气吹干。用1.0mL甲醇复溶，12000×g离心15min，取上清为供试品溶液。

实施例2样品检测

(1)液相条件

液相系统为Waters UPLC I-class，配备有FTN自动进样系统。

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm，2.1×50mm)。

流动相A：水(含5.0mM醋酸铵，0.1％甲酸)；

流动相B：甲醇；

柱温：35℃；

流速：0.3mL/min；

流动相梯度如表1所示：

表1流动相梯度洗脱程序

时间(min)	A％	B％
			0	80	20
1.0	80	20
			7.0	25	75
7.2	10	90
			10.2	10	90
10.3	80	20
			12.0	80	20

(2)质谱条件

采用的质谱仪为三重四极杆质谱仪(Waters，Xevo TQ-S)，毛细管电压3.5kV，锥孔温度150℃，脱溶剂气温度500℃，脱溶剂气800L/h。定量检测采用多反应监测(MRM)模式，所有离子均为正离子模式采集。

(3)样品检测

将实施例1的(2)中的标准混合溶液分别进样，按本实施例的(1)和(2)的色谱条件和质谱条件进样测定。

以不含细辛的克痢痧胶囊阴性对照样品溶液为空白基质的标准曲线，计算上述10批次克痢痧胶囊样品各马兜铃酸类物质的含量。结果见表2显示，克痢痧胶囊样品中均未检出马兜铃酸II和马兜铃酸IIIa，马兜铃酸I含量在0.03-0.06μg/g范围内；马兜铃酸IVa含量在1.89-2.16μg/g范围内；马兜铃内酰胺I含量在0.55-1.60μg/g范围内。

表2按照阴性对照标准曲线计算出的克痢痧胶囊中马兜铃酸的含量测定值

注释：-代表未检测到。

多反应监测(MRM)模式下的5种马兜铃酸类物质离子对及质谱参数如表3所示。

表3 5种马兜铃酸类物质离子对及质谱参数

表3中*为定量离子对，另一个为定性离子对。

实施例3方法学考察

(1)专属性考察

分别将按实施例1中的(1)-(3)处理得到的不含细辛的克痢痧胶囊阴性对照溶液，含有马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃酸IIIa、马兜铃酸IVa及马兜铃内酰胺I的混合标准工作溶液，克痢痧胶囊供试品溶液按照实施例2的(1)和(2)的色谱质谱条件进样测定。

结果见图1。其中图1中的：

(A)不含细辛的克痢痧胶囊阴性对照样品的总离子流色谱图(TIC)；

(B)含有马兜铃酸I(AA I)、马兜铃酸II(AA II)、马兜铃酸IIIa(AA IIIa)、马兜铃酸IVa(AA IVa)和马兜铃内酰胺I(AL I)的混合标准工作溶液TIC图；

(C)克痢痧胶囊样品TIC图；(C)的插图为克痢痧胶囊样品中检测到的马兜铃酸I提取离子流局部放大图。

结果显示，不含细辛的阴性对照样品色谱图中，在与标准工作溶液色谱保留时间相同的位置上无相应色谱峰干扰。说明该方法专属性良好。

(2)线性关系考察

将实施例1的(2)处理得到的含有马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃酸IIIa、马兜铃酸IVa及马兜铃内酰胺I的混合标准工作溶液按照实施例2的(1)和(2)的色谱质谱条件进样测定，得到的各物质线性范围、线性方程及线性相关系数如表4所示。

表4线性关系考察结果

物质	线性范围(ng/mL)	线性方程	线性相关系数R
				马兜铃酸I	1.23-1800	y＝1929.96x+759.577	0.9999
马兜铃酸II	1.23-1800	y＝2636.55x-171.511	0.9996
				马兜铃酸IIIa	1.03-1500	y＝604.038x-106.772	0.9998
马兜铃酸IVa	1.03-1500	y＝387.89x+7.21426	0.9996
				马兜铃内酰胺I	1.23-900	y＝13288.8x+4961.09	0.9991

结果表明该方法得到的5种马兜铃酸类物质标准曲线线性良好，定量范围较宽，能够满足克痢痧胶囊中上述物质的定量检测。

(3)准确度、检测限和定量限

分别以2.50、50.00和1440.00ng/mL为马兜铃酸I和马兜铃酸II的低、中、高剂量质控样品；以2.50、50.00和1200.00ng/mL为马兜铃酸IIIa和马兜铃酸IVa的低、中、高剂量质控样品；以2.5、50.0和720.0ng/mL为马兜铃内酰胺I和的低、中、高剂量质控样品，按照实施例2的(1)和(2)的色谱质谱条件进样测定。结果显示，各物质准确度在6.79％(相对误差RE，绝对误差除以真实值乘100％得到)以下，满足定量的需求。

以S/N值3：1和10：1分别为方法的检测限和定量限，得到马兜铃酸I方法检测限和定量限分别为29.68、98.95pg/mL；马兜铃酸II方法检测限和定量限分别为36.97、123.24pg/mL；马兜铃酸IIIa方法检测限和定量限分别为182.75、609.18pg/mL；马兜铃酸IVa方法检测限和定量限分别为308.70、1029.00pg/mL；马兜铃内酰胺Ⅰ方法检测限和定量限分别为19.04、63.46pg/mL。

(4)重复性试验

取同一批次克痢痧胶囊(批号220203)50.0mg，精密称定6份，按实施例1(3)的方法制备供试品溶液，按照实施例2的(1)和(2)的色谱质谱条件进样测定。结果显示，克痢痧胶囊样品未检测出马兜铃酸II、马兜铃酸IIIa。克痢痧胶囊中马兜铃酸I含量的RSD(相对标准偏差，由标准偏差除以平均值乘100％得到)值为3.37％；马兜铃酸IVa含量的RSD值分别为1.59％；马兜铃内酰胺I含量的RSD值分别为1.25％，说明方法重复性好。

(5)稳定性试验

取实施例1(2)中b)马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃酸IIIa、马兜铃酸IVa及马兜铃内酰胺I混合标准溶液(100ng/mL)，分别于0、2、4、8、12、22、24h测定峰面积，马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃酸IIIa、马兜铃酸IVa及马兜铃内酰胺I浓度的RSD分别为3.51％、1.77％、3.43％、1.98％、1.78％，表明各物质在24h内稳定性良好。

(6)回收率试验

回收率样品：参照实施例1中的(3)，取50mg的克痢痧胶囊样品(批次220203)，加入适量的马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃酸IIIa、马兜铃酸IVa和马兜铃内酰I的混合标准溶液，整体按照实施例1中的(3)进行提取，制备加标回收样。

平行制备6份加标回收样进样测定，以不添加混合标准溶液的供试品溶液作为对照。结果见表5，结果表明马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃酸IIIa、马兜铃酸IVa及马兜铃内酰胺I的平均回收率分别为85.38％(RSD3.59％)、93.03％(RSD1.57％)，98.92％(RSD2.37％)、93.28％(RSD0.79％)、98.56％(RSD1.70％)。

表5回收率试验考察结果

表5中，克痢痧胶囊中各物质含量(ng)表示不添加混合标准溶液的供试品溶液的检测结果，即供试品克痢胶囊中50mg药物中的各物质含量；加入量(ng)表示加入的混合标准溶液中各物质的含量，即加标回收样相对于供试品溶液增加的物质含量；测得值表示加标回收样实际检测到的各物质含量；回收率＝测得值/(克痢痧胶囊中各物质含量+加入量)×100％。

实施例4流动相条件验证

取实施例1的(2)中的c)马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃酸IIIa、马兜铃酸IVa及马兜铃内酰胺I混合标准溶液(40ng/mL)，分别使用流动相A为水(5.0mM醋酸铵)、流动相A为水(0.1％甲酸)、流动相A为水(5.0mM醋酸铵，0.1％甲酸)和流动相A为水(10.0mM醋酸铵，0.1％甲酸)，其他条件按照实施例2的(1)和(2)的色谱质谱条件进样测定。

结果如图3、图4和表6；其中图3为流动相A为水(5.0mM醋酸铵)时的离子流色谱图；图4为流动相A为水(0.1％甲酸)时的离子流色谱图。

结果显示，流动相A中加入甲酸后，马兜铃酸IIIa和马兜铃酸IVa峰形有很大的改善；流动相A为水(5.0mM醋酸铵，0.1％甲酸)时，各物质的质谱响应最高。

表6不同流动相的检测结果

实施例5提取试剂条件验证

(1)提取溶剂类型

精密称取克痢痧胶囊样品(批次220320)(50.0mg)6份，分别加入2.5mL的50％甲醇、70％甲醇和100％甲醇进行提取。超声提取40min，按实施例2的(3)处理后，取上清按照实施例2的(1)和(2)的色谱质谱条件进样测定。结果见表7。

表7不同提取试剂的检测结果

注：ND表示未检测到。

(2)提取溶剂体积

精密称取克痢痧胶囊样品(批次220320)(50.0mg)6份，分别加入1.0mL、2.5mL、5.0mL的70％甲醇进行提取。超声提取40min，按实施例2的(3)处理后，取上清按照实施例2的(1)和(2)的色谱质谱条件进样测定。结果显示，2.5mL和5.0mL提取量高于1.0mL，2.5mL和5.0mL提取量无明显差异。结果见表8。

表8不同提取试剂体积的检测结果

注：ND表示未检测到。

(3)提取时间

精密称取克痢痧胶囊样品(批次220320)(50.0mg)6份，加入2.5mL的70％甲醇后分别超声提取20min、40min和60min。按实施例2的(3)处理后，取上清按照实施例2的(1)和(2)的色谱质谱条件进样测定。结果显示，40min和60min提取量较高。结果见表9。

表9不同提取时间的检测结果

注：ND表示未检测到。

Claims

1.一种马兜铃酸类成分的定量检测方法，其特征在于，所述的定量检测方法包括使用超高效液相色谱串联质谱法；所述的超高效液相色谱条件包括：

流动相A中包含4.0-6.0mM醋酸铵和质量分数0.05％-0.15％甲酸，溶剂为水；

流动相B为甲醇。

2.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，所述的超高效液相色谱条件还包括梯度洗脱程序：

起始时间/min 流动相A/％流动相B/％ 0 70-90 10-30 1.0 70-90 10-30 7.0 15-35 65-85 7.2 5-15 85-95 10.2 5-15 85-95 10.3 70-90 10-30 12.0 70-90 10-30

。

3.根据权利要求2所述的定量检测方法，其特征在于，所述的梯度洗脱程序为：

起始时间/min 流动相A/％流动相B/％ 0 80 20 1.0 80 20 7.0 25 75 7.2 10 90 10.2 10 90 10.3 80 20 12.0 80 20

。

4.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，所述的超高效液相色谱的色谱柱为BEH C18，规格为1.7μm，2.1mm×50mm。

5.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，所述质谱的条件包括：使用三重四级杆质谱仪；定量检测扫描，所述的定量检测扫描方式为多反应监测扫描；采用正离子模式采集。

6.权利要求1-5任一项所述定量检测方法在马兜铃酸类成分评价中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，用于评价马兜铃酸类成分的种类和/或含量；所述的马兜铃酸类成分包括马兜铃酸I、马兜铃酸II、马兜铃酸IIIa、马兜铃酸IVa和马兜铃内酰胺I中的一种或多种。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，用于评价克痢痧胶囊。

9.一种克痢痧胶囊的质量评价方法，其特征在于，包括权利要求1-5任一项所述的定量检测方法。

10.根据权利要求9所述的质量评价方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、供试品溶液、标准溶液、阴性对照样品溶液配制；

S2、将S1配制的供试品溶液和标准溶液使用权利要求1-5任一项所述定量检测方法检测；