CN112147239A

CN112147239A - 猪苓中核苷含量的检测方法

Info

Publication number: CN112147239A
Application number: CN201910563427.5A
Authority: CN
Inventors: 华茉莉; 徐云辉; 刘洁; 张倩倩; 朱敏航; 周靖
Original assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; China State Institute of Pharmaceutical Industry
Current assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; China State Institute of Pharmaceutical Industry
Priority date: 2019-06-26
Filing date: 2019-06-26
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2039-06-26
Also published as: CN112147239B

Abstract

本发明公开了一种猪苓中核苷含量的检测方法。该检测方法包括下述步骤：以栀子苷为内标，采用高效液相色谱检测猪苓供试品溶液中的核苷即可。本发明中将核苷类成分作为猪苓标准汤剂和配方颗粒的质量控制项，结合内标物，可较好实现对其中所含核苷类成分的含量测定。本发明的检测方法操作简单、稳定、重现性好、检测效率高，具有较强实用性。

Description

猪苓中核苷含量的检测方法

技术领域

本发明涉及一种猪苓中核苷含量的检测方法。

背景技术

猪苓(Polyporus umbellatus(Pers.)Fries)为我国常用的菌类药材，已有2000多年的药用历史，在国内外享有盛名。猪苓为多孔菌科真菌猪苓(Polyporus umbellatus(Pers.)Fries.)的干燥菌核，味甘、淡，性平，具有利水渗湿之功效。

中药配方颗粒是由单味中药饮片经水提取、浓缩、干燥、制粒而成，在中医临床配方后，供患者冲服使用。由于配方颗粒已失去中药饮片的外在形态特征，因此其质量控制与标准制定尤为重要和关键，建立的相应质量标准务求能有效且客观地反映不同药材的内在质量与特征，以保证临床用药的可靠和量效。中药中的成分种类及含量是评价药材质量的重要参考指标，单一成分难以客观评价药材质量，一测多评不仅能从质上对药材加以区分，更能量化药材质量，因此深受科研人员青睐。

研究表明，猪苓药材中主要化学成分为多糖类、甾体类和氨基酸类等，而甾体类成分中的麦角甾酮与麦角甾醇是其主要利尿活性成分。目前，对猪苓原药材中麦角甾酮与麦角甾醇的定性与定量研究建立了较多方法，如HPLC-UV法、HPLC-FLD法和RRLC-MS法等。截止2015年版《中国药典》，猪苓药材项下规定其中麦角甾醇含量不得低于0.07％。现有技术中，对于猪苓药材一般采用有机溶剂提取，麦角甾醇含量相对较高，且是猪苓中比较特征的成分，故药典中将其作为含量测定相。研究显示：猪苓中主要甾体成分麦角甾醇组分在药材中含量极低，大多不足千分之一，例如“HPLC法同时测定猪苓中6个甾体类成分的含量”(谭庆龙等，中药材，2018,40(8):1892-1894)；例如“HPLC-APCI-MS/MS法同时测定猪苓颗粒中麦角甾酮与麦角甾醇的含量”(李思明等，药物分析杂志，2014,34(4):649-653)，无法将其作为有效的含量测定项。

而且，由于甾体类组分复杂，有效分析测定其准确含量难度较大，难以保证药材质量的一致性及质量优劣，因而严重制约了猪苓药用价值的广泛研究和开发利用。目前，对于猪苓药材而言，现有技术中急需找到合适的质量评价方法。而且，现有技术中还没有对猪苓中的核苷类物质进行含量测定的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺乏有效的针对猪苓配方颗粒质量的检测方法，提供了一种猪苓中核苷含量的检测方法。本发明猪苓中核苷含量的检测方法应用了药用真菌中重要的生物活性物质核苷类，可有效地检测分析猪苓标准汤剂和配方颗粒的质量。本发明所述方法操作简单、稳定、重现性好、检测效率高，具有较强实用性。

标准汤剂中猪苓的甾体类成分的提取转移率极低，即便配制每毫升含10g生药的供试品溶液，HPLC法对猪苓中甾体类成分的检测仍低于现有文献中的检测限。本发明收集不同产地二十余批次的猪苓药材，采用水煎煮法制备配方颗粒的标准汤剂，拟采用内标法以减小其测定误差，并且通过付出创造性劳动摸索出了本发明所述的HPLC的流动相洗脱梯度，较好实现对猪苓配方颗粒中的核苷类的分析。

本发明通过下述技术方案解决上述技术问题。

本发明提供了一种猪苓中核苷含量的检测方法，其包括下述步骤：

以栀子苷为内标，采用高效液相色谱检测猪苓供试品溶液中的核苷即可。

本发明中，所述核苷一般包括尿苷、鸟苷、腺苷、腺嘌呤、鸟嘌呤和尿嘧啶中的一种或多种；优选包括尿苷、鸟苷和腺苷中的一种或多种。

本发明中，所述高效液相色谱检测中，一般采用梯度洗脱的方式进行。

本发明中，所述高效液相色谱检测中，采用的流动相优选包括水和乙腈，梯度洗脱条件优选如下所示：

时间/min	水/％	乙腈/％
			0～12	100	0
12～20	100→98	0→2
			20～45	98→80	2→20
45～46	80→100	20→0
			46～60	100	0

上述百分比为体积百分比。根据本领域常识可知，以时间为12～20min为例，水“100→98”表示流动相中水百分含量的变化是均匀变化的。

本发明中，所述高效液相色谱检测中，采用的色谱柱可为本领域常规，优选为耐水反相柱。所述耐水反相柱一般为硅胶键合相色谱柱，优选为十八烷基硅烷键合色谱柱；更优选为Agilent Zorbax SB-Aq色谱柱，规格内径4.6mm*柱长250mm，填料粒径5μm。

其中，所述十八烷基硅烷键合色谱柱的规格可为本领域常规。所述十八烷基硅烷键合色谱柱的柱长优选为150～250mm，更优选为250mm。所述十八烷基硅烷键合色谱柱的内径优选为2.1～4.6mm，更优选为4.6mm。所述十八烷基硅烷键合色谱柱的填料粒径优选为3～5μm，更优选为5μm。

本发明中，所述高效液相色谱检测中，所述流动相的流速可为本领域常规，优选为0.5～1.0mL/min，更优选0.8mL/min。

本发明中，所述高效液相色谱检测中，所述色谱柱的柱温可为本领域常规，优选为25～30℃，更优选为30℃。

本发明中，所述高效液相色谱检测中，检测波长可为本领域常规，优选为250～280nm，更优选为260nm。

本发明中，所述高效液相色谱检测中，进样体积可为本领域常规，优选为10～20μL，更优选为10μL。

本发明中，所述检测方法优选包括下述步骤：

步骤(1)制备内标溶液；

步骤(2)制备含内标的混合对照品溶液并经所述的高效液相色谱检测，记录各核苷的峰面积或峰高；

步骤(3)制备含内标的猪苓供试品溶液并经所述的高效液相色谱检测，记录各核苷的峰面积或者峰高；

步骤(4)按外标一点法计算猪苓供试品溶液中各核苷的浓度即可。

步骤(1)中，所述内标溶液的制备方法可为本领域常规，一般包括以下步骤：精密称定栀子苷置于容量瓶中，加溶剂定容即可。

步骤(1)中，所述内标溶液中，栀子苷的浓度一般为0.5～1.0mg/mL，优选0.6mg/mL。所述内标溶液中的溶剂可为本领域常规，优选为水和/或甲醇，更优选为甲醇。

步骤(2)中，所述含内标的混合对照品溶液的制备方法可为本领域常规。以所述的核苷为尿苷、鸟苷和腺苷为例，例如通过下述步骤制得：分别取尿苷、鸟苷和腺苷对照品适量，精密称定，置于同一容量瓶中，加入溶剂溶解，得混合对照品贮备液，精密移取所述混合对照品贮备液适量，置于容量瓶中，精密加入步骤(1)中制备的内标溶液，加水至刻度，摇匀，过滤，即得。

其中，所述的混合对照品贮备液的溶剂的种类可为本领域常规，一般使得对照品充分溶解即可，例如水。

其中，所述的混合对照品贮备液中尿苷的浓度可为本领域常规，优选为0.01～1mg/mL，例如0.1mg/mL、0.2mg/mL。

其中，所述的混合对照品贮备液中鸟苷的浓度可为本领域常规，优选为0.05～0.5mg/mL，例如0.1mg/mL、0.2mg/mL。

其中，所述的混合对照品贮备液中腺苷的浓度可为本领域常规，优选为0.01～1mg/mL，例如0.1mg/mL、0.2mg/mL。

其中，含内标的所述混合对照品溶液的溶剂使得核苷能够充分溶解即可，优选为水或体积百分比为5～15％的甲醇水溶液，更优选为体积百分比为10％的甲醇水溶液。

其中，所述的含内标的混合对照品溶液中尿苷的浓度可为本领域常规，优选为0.001～0.1mg/mL，例如0.005mg/mL、0.01mg/mL、0.02mg/mL或者0.05mg/mL。

其中，所述的含内标的混合对照品溶液中鸟苷的浓度可为本领域常规，优选为0.0005～0.05mg/mL，例如0.0025mg/mL、0.005mg/mL、0.01mg/mL或者0.025mg/mL。

其中，所述的含内标的混合对照品溶液中腺苷的浓度可为本领域常规，优选为0.001～0.1mg/mL，例如0.005mg/mL、0.01mg/mL、0.02mg/mL或者0.05mg/mL。

其中，含内标的所述混合对照品溶液中栀子苷的浓度可为本领域常规，优选为0.04～0.1mg/mL，例如0.06mg/mL。

步骤(3)中，含内标的所述猪苓供试品溶液的制备方法可为本领域常规，例如通过下述步骤制得：取猪苓供试品适量，精密称定，置于容量瓶中，加入溶剂溶解所述猪苓供试品后，得猪苓供试品贮备液，在所述的猪苓供试品贮备液中加入内标溶液，加水至刻度线定容，过滤即得。

其中，溶解所述猪苓供试品的溶剂可为本领域常规，一般能够使得猪苓供试品充分溶解即可，优选为水和/或浓度为5～20％甲醇水溶液，更优选为水。

其中，所述溶解的方式可为本领域常规，例如超声或加热回流，优选为超声。所述超声的时间可为本领域常规，一般使得标准汤剂完全溶解即可，一般10～60min，例如30min。

其中，所述猪苓供试品贮备液中猪苓供试品的浓度可为本领域常规，优选为10～40mg/mL，例如25mg/mL。

其中，含内标的所述猪苓供试品溶液的溶剂使得猪苓供试品和栀子苷能够充分溶解即可，优选为水或体积百分比为4.5～28％的甲醇水溶液，例如体积百分比为10％的甲醇水溶液。

其中，含内标的所述猪苓供试品溶液中猪苓供试品的浓度可为本领域常规，优选为10～30mg/mL，例如20mg/mL。

其中，含内标的所述猪苓供试品溶液中栀子苷的浓度可为本领域常规，优选为0.04～0.1mg/mL，例如0.06mg/mL。

其中，所述猪苓供试品可为本领域常规，通常可为猪苓标准汤剂和/或猪苓配方颗粒，优选为猪苓标准汤剂。

所述猪苓标准汤剂可通过本领域常规方法制得，一般将猪苓饮片通过水煎煮、过滤、浓缩、冷冻干燥即可，例如通过下述步骤制得：称取待测的猪苓饮片100g，加9倍量水浸泡一定时间，煮沸后再煎煮30min，过滤；药渣加7倍量水煮沸后再煎煮25min，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩，冷冻干燥即可。

其中，所述的猪苓配方颗粒可为本领域常规，通常由猪苓标准汤剂经制粒而得。

本发明中，所述容量瓶的规格根据待测样品的质量合理的选择即可，一般为10mL规格的容量瓶。

步骤(4)中，所述的外标一点法为本领域常规，代入中国药典中记载的外标法的计算公式即可。外标法的计算公式如下：

式中，Cx为供试品溶液中待测核苷的浓度，Cs为经高效液相色谱检测得到的供试品溶液中待测核苷的峰面积或峰高，Fx为含内标的对照品混合液中待测核苷的浓度，Cs为经高效液相色谱检测得到的含内标的对照品混合液中待测核苷的峰面积或峰高。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明中将核苷类成分作为猪苓标准汤剂和配方颗粒的质量控制项，采用了内标法对猪苓供试品溶液中的各核苷的含量进行高效液相色谱的检测，采用外标一点法对猪苓供试品溶液中的各核苷的含量进行计算，内标法减少了测量的误差，操作简单、稳定、重现性好、检测效率高，具有较强实用性。

附图说明

图1为实施例1步骤5含有内标的猪苓供试品溶液的HPLC图谱，其中，峰1为尿苷，峰2为鸟苷，峰3为腺苷，峰4为栀子苷。

图2为实施例1步骤2制得的内标溶液、对步骤5制得的含有内标的猪苓供试品溶液、对步骤5制得的不含有内标的猪苓供试品溶液的HPLC色谱对比图，其中峰1为尿苷，峰2为鸟苷，峰3为腺苷，峰4为栀子苷。

图3为实施例1步骤3制得的含内标的核苷参照物的HPLC谱图，其中，峰1为尿苷，峰2为鸟苷，峰3为腺苷，峰4为栀子苷。

图4为对比例1中含有内标的猪苓供试品溶液的HPLC图谱，其中，峰1为尿苷，峰2为鸟苷，峰3为腺苷，峰4为栀子苷。

图5为对比例2中含有内标的猪苓供试品溶液的HPLC图谱，其中峰1为尿苷，峰2为鸟苷，峰3为腺苷。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明实施例和对比例中的20批猪苓药材的批号和产地如下表1所示：

表1

实施例1

1.液相色谱法测定的条件如下：Zorbax SB-Aq色谱柱(5μm，4.6×250mm，Agilent)，检测波长：260nm，柱温30℃，流速：0.8mL/min，进样量：10μL，流动相为乙腈和水，梯度洗脱条件见下表2：

表2

上述百分比为体积百分比。

2.内标溶液的制备

精密称取栀子苷对照品，置于10mL的容量瓶中，加甲醇溶解定容，制成每1mL含0.6mg的溶液，作为内标溶液。

3.含内标的核苷参照物溶液的制备

分别精密量取尿苷、鸟苷和腺苷对照品，置于同一10mL的容量瓶中，加水溶解，制备成每毫升含的0.2mg尿苷、0.1mg鸟苷和0.2mg腺苷的混合对照品贮备液。精密移取上述制备的混合对照品贮备液1mL，置于10mL容量瓶中，精密加入步骤(2)中制备的内标溶液1mL，加水至刻度，摇匀，过滤，即得含内标的混合对照品溶液。

4.猪苓标准汤剂的制备：

称取待测的猪苓饮片(例如药材批号为ZL-001的猪苓药材)100g，加9倍量水浸泡一定时间，煮沸后再煎煮30min，过滤；药渣加7倍量水煮沸后再煎煮25min，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩，冷冻干燥即可。

5.含内标的猪苓供试品溶液的制备

精密称前述步骤4的标准汤剂200mg，置于10mL容量瓶中，加8mL水超声30min，精密加入1mL内标溶液，加水至刻度线，过滤，即得。重复前述步骤，制得不含有内标的猪苓供试品溶液。

在实施例1步骤1中高效液相色谱条件下，对步骤5制得的含有内标的猪苓供试品溶液进行检测。图1为含有内标的猪苓供试品溶液的HPLC图谱，其中，峰1为尿苷，峰2为鸟苷，峰3为腺苷，峰4为栀子苷。

在实施例1步骤1中高效液相色谱条件下，分别对步骤2制得的内标溶液、对步骤5制得的含有内标的猪苓供试品溶液、对步骤5制得的不含有内标的猪苓供试品溶液进行检测。图2为步骤2制得的内标溶液、对步骤5制得的含有内标的猪苓供试品溶液、对步骤5制得的不含有内标的猪苓供试品溶液的HPLC色谱对比图，其中峰1为尿苷，峰2为鸟苷，峰3为腺苷，峰4为栀子苷。

在实施例1步骤1中高效液相色谱条件下，将步骤3制得的含内标的核苷参照物进行检测。图3为步骤3制得的含内标的核苷参照物的HPLC谱图，其中，峰1为尿苷，峰2为鸟苷，峰3为腺苷，峰4为栀子苷。

效果实施例1

1.线性关系的考察

以尿苷为例，精密移取0.05、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00mL实施例1步骤3制备的混合对照品贮备液于10mL容量瓶，分别精密加入实施例1步骤2制备的内标溶液1.00mL，加水至刻度线，摇匀，过滤，得不同浓度的含内标的混合对照品溶液。精密吸取上述不同浓度的含内标的混合对照品溶液10μL注入液相色谱仪中，在实施例1步骤1条件下进样，记录栀子苷及尿苷峰面积。以进样的对照品的浓度为横坐标，尿苷与栀子苷的峰面积比为纵坐标作标准曲线。尿苷的线性回归方程为Y＝87.986X+0.0311，R²＝0.9999；表明尿苷在1～100μg/mL范围内有良好的线性关系。

同理，对于鸟苷而言，重复上述实验，记录栀子苷及鸟苷峰面积。鸟苷的线性回归方程为Y＝97.446X+0.0151，R²＝1。表明鸟苷在0.5～50μg/mL范围内有良好的线性关系。

同理，对于腺苷而言，重复上述实验，记录栀子苷及腺苷峰面积。腺苷的线性回归方程为Y＝120.26X+0.0502，R²＝0.9999，表明腺苷在1～100μg/mL范围内有良好的线性关系。

2.精密度的考察

同一批次猪苓供试品按实施例1的方法制备含内标的猪苓供试品溶液，在实施例1步骤1的高效液相色谱条件下连续进样6次，计算尿苷、鸟苷、腺苷的峰面积的RSD值，猪苓样品的RSD值分别为0.38％、1.20％、0.15％，表明仪器精密度良好。具体结果如表3所示。其中，RSD为相对标准偏差(relative standard deviation)，指标准偏差与计算结果算术平均值的比值。

表3

3.重复性的考察

同一批次猪苓供试品按实施例1步骤5平行制备6份含有内标供试品溶液，在实施例1步骤1的高效液相色谱条件下进样，计算6份含有内标供试品溶液中尿苷、鸟苷、腺苷含量的RSD值，猪苓样品的RSD值分别为1.39％、0.60％、1.92％，表明该方法重复性良好。具体结果如表4所示。

表4

4.稳定性的考察

同一批次猪苓供试品按实施例1的方法制备含内标的猪苓供试品溶液，在实施例1步骤1的高效液相色谱条件下，分别于0、2、4、8、12、24h进样，计算尿苷、鸟苷、腺苷峰面积的RSD值，猪苓样品的RSD值分别为0.58％、0.55％、0.69％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。具体测试结果如表5所示。

表5

5.加样回收率的考察

精密称取已知含量的同一批次猪苓供试品样品9份，每份0.1g，分别精密加入高中低浓度的尿苷、鸟苷、腺苷对照品，按实施例1步骤5方法制备供试品溶液(含内标，内标物的浓度如实施例1中步骤5)，在实施例1步骤1的高效液相色谱条件下进样，计算供试品溶液中尿苷、鸟苷、腺苷回收率，结果猪苓样品的尿苷、鸟苷、腺苷加样回收率范围分别为98.35％～103.69％、96.54％～101.55％、98.57～103.32％，平均加样回收率分别为101.54％(RSD＝1.85％)、98.13％(RSD＝1.79％)、101.01％(RSD＝1.66％)，表明该方法的准确度好。具体测试结果如表6所示。

表6

效果实施例2：含量的计算

收集不同产地20批次的猪苓供试品，按实施例1步骤5分别制备猪苓的供试品溶液(含内标，内标物的浓度如实施例1中步骤5)，在实施例1步骤1的高效液相色谱条件下进样，记录各核苷色谱峰与内标物栀子苷色谱峰峰面积的比值，按照以下公式计算含量：

(Cx为供试品溶液中待测核苷的浓度，Cs为经高效液相色谱检测得到的供试品溶液中待测核苷的峰面积或峰高，Fx为含内标的对照品混合液中待测核苷的浓度，Cs为经高效液相色谱检测得到的含内标的对照品混合液中待测核苷的峰面积或峰高)。结果各样品的出膏率和含量测定结果见下表。各供试样品的出膏率和含量测定结果见下表7。

表7

效果实施例3：内标法和外标法的比较

采用与实施例1尿苷、鸟苷和腺苷对照品，采用内标法和外标法分别进样3次，发现内标法测得的RSD值明显小于外标法测得的RSD值(见下表8)，从表中可以看出，内标法的RSD值明显小于外标法的RSD值，说明内标法能够有效的减少测量误差。以尿苷为例，内标法是将含内标的混合对照品溶液在实施例1中的高效液相色谱检测的条件下进样，记录尿苷的峰峰面积与栀子苷峰面积的比值；外标法是分别取混合对照品贮备液和猪苓供试品贮备液在实施例1中的高效液相色谱检测的条件下进样，分别记录尿苷的峰面积。鸟苷和腺苷的内标法和外标法的比较检测同上述尿苷。同一样品进样3次，发现内标法的RSD值明显小于外标法的RSD值(见下表8)，说明内标法能够有效的减少测量误差。

表8

对比例1

本对比例中采用的液相色谱法测定的条件如下：Zorbax SB-Aq色谱柱(5μm，4.6×250mm，Agilent)，检测波长260nm，柱温30℃，流速0.5mL/min，流动相乙腈-水，本对比例的梯度洗脱条件见下表9：

表9梯度洗脱条件

时间/min	乙腈/％	水/％
			0～5	0→5	100→95
5～10	5	95
			10～20	5→20	95→80
20～25	20	80
			25～26	20→0	80→100
26～40	0	100

按照实施例1步骤5制备含有内标的猪苓供试品溶液，按照上述液相色谱的条件进行检测，所得色谱图如图4所示，其中，峰1为尿苷，峰2为鸟苷，峰3为腺苷，峰4为栀子苷。由图4可知，含有内标的猪苓供试品溶液的HPLC图谱基线不平。

对比例2

本对比例中采用的液相色谱法测定的条件如下：Zorbax SB-Aq色谱柱(5μm，4.6×250mm，Agilent)，检测波长：260nm，柱温30℃，流速：0.5mL/min，进样量：10μL，流动相：乙腈-0.05％甲酸水溶液(V/V)，本对比例的梯度洗脱条件见下表10：

表10梯度洗脱条件

时间/min	乙腈/％	0.05％甲酸和水溶液
			0～12	0	100
12～17	0→2	100→98
			17～27	2	98
27～45	2→20	98→80

按照实施例1步骤5制备猪苓供试品溶液(无内标)，按照上述液相色谱的条件进行检测，所得色谱图如图5所示，其中峰1为尿苷，峰2为鸟苷，峰3为腺苷。由图5可知，猪苓样品的HPLC图谱基线漂移，且杂峰较多。

对比例3(内标物选为肌苷)

精密称取肌苷对照品，加甲醇溶解定容，制成0.4mg/mL的溶液，作为内标溶液。精密移取1mL置于10mL容量瓶中，加水至刻度线，过滤，精密吸取10μL按照对比例2中的液相色谱条件进样。结果显示，猪苓中的杂峰比较多，肌苷会被杂峰干扰，所以肌苷不适合作内标，如果选的内标物有杂峰干扰或者干扰样品峰，或者响应值低，肯定测定的结果是不准确的。

对比例4(内标物3为红景天苷)

精密称取红景天苷对照品，加甲醇溶解定容，制成0.6mg/mL的溶液，作为内标溶液。精密移取1mL置于10mL容量瓶中，加水至刻度线，过滤，精密吸取10μL按照对比例2中的液相色谱条件进样。猪苓中的杂峰较多，红景天苷会被杂峰干扰，所以红景天苷不适合作内标。

Claims

1.一种猪苓中核苷含量的检测方法，其特征在于，其包括下述步骤：以栀子苷为内标，采用高效液相色谱检测猪苓供试品溶液中的核苷即可。

2.如权利要求1所述的猪苓中核苷含量的检测方法，其特征在于，所述核苷包括尿苷、鸟苷、腺苷、腺嘌呤、鸟嘌呤和尿嘧啶中的一种或多种；优选包括尿苷、鸟苷和腺苷中的一种或多种。

3.如权利要求1所述的猪苓中核苷含量的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测中，采用梯度洗脱的方式；采用的流动相包括水和乙腈，梯度洗脱条件优选如下所示：

时间/min 水/％乙腈/％ 0～12 100 0 12～20 100→98 0→2 20～45 98→80 2→20 45～46 80→100 20→0 46～60 100 0

上述百分比为体积百分比。

4.如权利要求3所述的猪苓中核苷含量的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测中，采用的色谱柱为耐水反相柱；所述耐水反相柱优选为十八烷基硅烷键合色谱柱；更优选为Agilent Zorbax SB-Aq色谱柱，规格内径4.6mm*柱长250mm，填料粒径5μm；

和/或，所述高效液相色谱检测中，所述流动相的流速为0.5～1.0mL/min，优选为0.8mL/min；

和/或，所述高效液相色谱检测中，色谱柱的柱温为25～30℃，优选为30℃；

和/或，所述高效液相色谱检测中，检测波长为250～280nm，优选为260nm；

和/或，所述高效液相色谱检测中，进样体积为10～20μL。

5.如权利要求1所述的猪苓中核苷含量的检测方法，其特征在于，猪苓中核苷含量的检测方法包括下述步骤：

(1)制备内标溶液；

(2)制备含内标的混合对照品溶液并经所述的高效液相色谱检测，记录各核苷的峰面积或峰高；

(3)制备含内标的猪苓供试品溶液并经所述的高效液相色谱检测，记录各核苷的峰面积或者峰高；

(4)按外标一点法计算猪苓供试品溶液中各核苷的浓度即可。

6.如权利要求5所述的猪苓中核苷含量的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述内标溶液中，栀子苷的浓度为0.5～1.0mg/mL，优选0.6mg/mL；

和/或，步骤(1)中，所述内标溶液中的溶剂为水和/或甲醇。

7.如权利要求5所述的猪苓中核苷含量的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，含内标的所述混合对照品溶液的溶剂为水或体积百分比为5～15％的甲醇水溶液；

和/或，步骤(2)中，以所述的核苷为尿苷、鸟苷和腺苷为例，所述的含内标的混合对照品溶液中尿苷的浓度为0.001～0.1mg/mL；和/或，所述的含内标的混合对照品溶液中鸟苷的浓度为0.0005～0.05mg/mL；和/或，所述的含内标的混合对照品溶液中腺苷的浓度为0.001～0.1mg/mL；

和/或，步骤(2)中，含内标的所述混合对照品溶液中栀子苷的浓度为0.04～0.1mg/mL。

8.如权利要求7所述的猪苓中核苷含量的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，含内标的所述混合对照品溶液的溶剂为体积百分比为10％的甲醇水溶液；

和/或，步骤(2)中，所述的含内标的混合对照品溶液中尿苷的浓度为0.005mg/mL、0.01mg/mL、0.02mg/mL或者0.05mg/mL；和/或，所述的含内标的混合对照品溶液中鸟苷的浓度为0.0025mg/mL、0.005mg/mL、0.01mg/mL或者0.025mg/mL；和/或，所述的含内标的混合对照品溶液中腺苷的浓度为0.005mg/mL、0.01mg/mL、0.02mg/mL或者0.05mg/mL；

和/或，含内标的所述混合对照品溶液中栀子苷的浓度0.06mg/mL。

9.如权利要求5所述的猪苓中核苷含量的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，含内标的所述猪苓供试品溶液的溶剂为水或体积百分比为4.5～28％的甲醇水溶液；

和/或，步骤(3)中，含内标的所述猪苓供试品溶液中猪苓供试品的浓度为10～30mg/mL；

和/或，步骤(3)中，含内标的所述猪苓供试品溶液中栀子苷的浓度为0.04～0.1mg/mL；

和/或，步骤(3)中，含内标的猪苓供试品溶液中，采用的猪苓供试品为猪苓标准汤剂。

10.如权利要求9所述的猪苓中核苷含量的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，含内标的所述猪苓供试品溶液的溶剂为体积百分比为10％的甲醇水溶液；

和/或，步骤(3)中，含内标的所述猪苓供试品溶液中猪苓供试品的浓度为20mg/mL；

和/或，步骤(3)中，含内标的所述猪苓供试品溶液中栀子苷的浓度为0.06mg/mL。