CN112147238B - 茯苓中核苷含量的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了茯苓中核苷含量的检测方法，其包括以下步骤：以栀子苷为内标，通过高效液相色谱检测茯苓供试品溶液中核苷的含量即可。本发明对茯苓中的尿苷、鸟苷和腺苷的检测方法测得的各核苷的含量较高，可有效的对茯苓标准汤剂和茯苓配方颗粒进行质量控制，并且采用了内标法对茯苓供试品溶液中的各核苷的含量进行高效液相色谱的检测，采用外标一点法对茯苓供试品溶液中的各核苷的含量进行计算，测量的误差较小，操作简单、稳定、重现性好、检测效率高，具有较强实用性。

Description

茯苓中核苷含量的检测方法
技术领域
本发明涉及茯苓中核苷含量的检测方法。
背景技术
茯苓(Poria cocos(Schw.)Wolf)是临床应用历史悠久的常用中药。为多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，味甘、淡，性平，具有利水渗湿、健脾宁心之功效，中医有“十药九茯苓”之说。
中药配方颗粒是由单味中药饮片经水提取、浓缩、干燥、制粒而成，在中医临床配方后，供患者冲服使用。由于配方颗粒已失去中药饮片的外在形态特征，因此其质量控制与标准制定尤为重要和关键，建立的相应质量标准务求能有效且客观地反映不同药材的内在质量与特征，以保证临床用药的可靠和量效。
目前，多认为茯苓中的生物活性物质为三萜类和多糖类组分。对于茯苓中的三萜类成分，国内已开展诸多研究。刘校妃等报道了(时珍国医国药，2016(3)，516-518)茯苓中去氢土莫酸和茯苓酸含量的高效液相色谱波长切换法同时测定。周军等报道了(天津药学，2015，27(6)，12-17)HPL C法测定茯苓配方颗粒中茯苓酸的含量，但是这些检测项的含量极低，单一成分的含量大多不足万分之一，这可能也是截止2015年版的《中国药典》至今均未将其列为茯苓药材及饮片含量测定项的主要原因。
目前，现有技术中对于茯苓的质量控制项还没有达到药典中可作为药物的质量控制项的含量的标准，因此，急需一种合适的质量控制项对茯苓进行有效的质量控制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中茯苓的质量控制项如三萜类物质的测定的含量均较低，因而缺乏有效的针对茯苓质量控制的检测方法，且对于核苷类含量的测定方法采用外标法，误差较大，而提供了茯苓中核苷含量的检测方法。本发明对茯苓中的核苷的检测方法测得的各核苷的含量较高，可有效的对茯苓标准汤剂和茯苓配方颗粒进行质量控制，并且采用了内标法对茯苓供试品溶液中的各核苷的含量进行高效液相色谱的检测，同时采用外标一点法对茯苓供试品溶液中的各核苷的含量进行计算，测量的误差较小，操作简单、稳定、重现性好、检测效率高，具有较强实用性。
本发明收集不同产地二十二批次的茯苓药材，采用水煎煮法制备茯苓配方颗粒的标准汤剂，拟采用内标法以减小其测定误差，并且通过付出创造性劳动摸索出了本发明中内标法中的内标物以及高效液相色谱的流动相洗脱梯度，可较好实现对茯苓配方颗粒中的核苷类的分析。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
本发明提供了茯苓中核苷含量的检测方法，其包括以下步骤：
以栀子苷为内标，通过高效液相色谱检测茯苓供试品溶液中核苷的含量即可。
本发明中，所述的核苷一般包括尿苷、鸟苷、腺苷、尿嘧啶、鸟嘧啶和腺嘧啶的一种或多种；较佳地为尿苷、鸟苷和腺苷中的一种或多种；例如尿苷、鸟苷和腺苷。
本发明中，所述高效液相色谱检测中，一般采用梯度洗脱的方式进行。
本发明中，所述高效液相色谱检测中，采用的流动相一般为体积百分比为0～0.1％的甲酸水溶液和乙腈；较佳地，所述梯度洗脱的流动相为水和乙腈，或，所述梯度洗脱的流动相为体积百分比为0.05％的甲酸水溶液和乙腈；更佳地，所述梯度洗脱的流动相为水和乙腈。
本发明，当所述流动相为水和乙腈时，梯度洗脱条件较佳地按下述方式中的任意一种进行：
方式I：
Figure BDA0002108576930000021
Figure BDA0002108576930000031
表中百分号的含义为体积百分数。
方式II：
时间/min 乙腈/％ 水/％
0～5 0→5 100→95
5～10 5 95
10～20 5→20 95→80
20～25 20 80
25～26 20→0 80→100
26～40 0 100
表中百分号的含义为体积百分数。
当所述流动相为水和乙腈，梯度洗脱条件更佳地按方式I中的梯度洗脱条件进行。
当所述的流动相为0.05％甲酸水溶液和乙腈时，所述的梯度洗脱条件按下述方式进行：
时间/min 乙腈/％ 0.05％甲酸/水
0～12 0 100
12～17 0→2 100→98
17～27 2 98
27～45 2→20 98→80
表中百分号的含义为体积百分数。
上述洗脱条件中，以流动相为水和乙腈中的方式I中的梯度洗脱条件为例，12～20min内，水“100→98”表示流动相中水百分含量的变化是均匀变化的。
本发明中，所述高效液相色谱检测中，采用的色谱柱可为本领域常规，较佳地为耐水反相柱。所述耐水反相柱一般为硅胶键合相色谱柱，较佳地为十八烷基硅烷键合色谱柱；更佳地为Agilent Zorbax SB-Aq色谱柱，规格内径4.6mm*柱长250mm，填料粒径5μm。
其中，所述十八烷基硅烷键合色谱柱的规格可为本领域常规。所述十八烷基硅烷键合色谱柱的柱长较佳地为150～250mm，更佳地为250mm。所述十八烷基硅烷键合色谱柱的内径较佳地为2.1～4.6mm，更佳地为4.6mm。所述十八烷基硅烷键合色谱柱的填料粒径较佳地为3～5μm，更佳地为5μm。
本发明中，所述高效液相色谱检测中，所述流动相的流速可为本领域常规，较佳地为0.5～1.0mL/min，更佳地为0.8mL/min。
其中，所述色谱柱的柱温可为本领域常规，较佳地为25～30℃，更佳地为30℃。
本发明中，所述高效液相色谱检测中，检测波长可为本领域常规，较佳地为250～280nm，更佳地为260nm。
本发明中，所述高效液相色谱检测中，进样体积可为本领域常规，较佳地为10～20μL，更佳地为10μL。
本发明中，所述的茯苓中核苷含量的检测方法较佳地包括以下步骤：步骤(1)制备内标溶液；
步骤(2)制备含内标的混合对照品溶液并经所述的高效液相色谱检测，记录各核苷的峰面积或峰高；
步骤(3)制备含内标的茯苓供试品溶液并经所述的高效液相色谱检测，记录各核苷的峰面积或者峰高；
步骤(4)按外标一点法计算茯苓供试品溶液中各核苷的浓度即可。
步骤(1)中，所述内标溶液的制备方法可为本领域常规，一般包括以下步骤：精密称定栀子苷置于容量瓶中，加溶剂定容即可。所述的内标溶液中，栀子苷的浓度为0.5～1.0mg/mL，较佳地为0.6mg/mL。所述内标溶液中的溶剂可为本领域常规，较佳地为水和/或甲醇，更佳地为甲醇。
步骤(2)中，含内标的所述混合对照品溶液的制备可为本领域常规，以所述的核苷为鸟苷、鸟苷和腺苷为例，例如通过下述步骤制得：分别取尿苷、鸟苷和腺苷对照品适量，精密称定，置于同一容量瓶中，加入溶剂溶解，得混合对照品贮备液，精密移取所述混合对照品贮备液适量，置于容量瓶中，精密加入步骤(1)中制备的内标溶液，加水至刻度，摇匀，过滤，即得。
其中，所述的混合对照品贮备液的溶剂的种类可为本领域常规，一般使得对照品充分溶解即可，例如水。
其中，所述的混合对照品贮备液中所述尿苷的浓度可为本领域常规，较佳地为0.01～1mg/mL，例如0.1mg/mL、0.2mg/mL。
其中，所述的混合对照品贮备液中所述鸟苷的浓度可为本领域常规，较佳地为0.05～0.5mg/mL，例如0.1mg/mL、0.2mg/mL。
其中，所述的混合对照品贮备液中所述腺苷的浓度可为本领域常规，较佳地为0.01～1mg/mL，例如0.1mg/mL、0.2mg/mL。
其中，含内标的所述混合对照品溶液的溶剂使得核苷能够充分溶解即可，较佳地为水或体积百分比为5～15％的甲醇水溶液，更佳地为体积百分比为10％的甲醇水溶液。
其中，含内标的所述混合对照品溶液中尿苷的浓度可为本领域常规，较佳地为0.001～0.1mg/mL，例如0.005mg/mL、0.01mg/mL、0.02mg/mL或者0.05mg/mL。
其中，含内标的所述混合对照品溶液中鸟苷的浓度可为本领域常规，较佳地为0.0005～0.05mg/mL，例如0.0025mg/mL、0.005mg/mL、0.01mg/mL或者0.025mg/mL。
其中，含内标的所述混合对照品溶液中腺苷的浓度可为本领域常规，较佳地为0.001～0.1mg/mL，例如0.005mg/mL、0.01mg/mL、0.02mg/mL或者0.05mg/mL。
其中，含内标的所述混合对照品溶液中栀子苷的浓度可为本领域常规，较佳地为0.04～0.1mg/mL，例如0.06mg/mL。
步骤(3)中，含内标的所述茯苓供试品溶液的制备方法可为本领域常规，例如通过下述步骤制得：取茯苓供试品适量，精密称定，置于容量瓶中，加入溶剂溶解所述茯苓供试品后，得茯苓供试品贮备液，在所述的茯苓供试品贮备液中加入内标溶液，加水至刻度线定容，过滤即得。
其中，溶解所述茯苓供试品的溶剂可为本领域常规，一般能够使得茯苓供试品充分溶解即可。较佳地为水和/或浓度为5～20％甲醇水溶液，更佳地为水。
其中，所述溶解的方式可为本领域常规，例如超声，所述超声的时间使得茯苓供试品完全溶解即可，较佳地为10～60min，例如30min。
其中，所述茯苓供试品贮备液中茯苓供试品的浓度可为本领域常规，较佳地为10～40mg/mL，例如25mg/mL。
其中，含内标的所述茯苓供试品溶液的溶剂使得茯苓供试品和栀子苷能够充分溶解即可，较佳地为水或体积百分比为4.5～28％的甲醇水溶液，例如体积百分比为10％的甲醇水溶液。
其中，含内标的所述茯苓供试品溶液中茯苓供试品的浓度可为本领域常规，较佳地为10～30mg/mL，例如20mg/mL。
其中，含内标的所述茯苓供试品溶液中栀子苷的浓度可为本领域常规，较佳地为0.04～0.1mg/mL，例如0.06mg/mL；
其中，所述的茯苓供试品可为本领域常规，通常可为茯苓标准汤剂和/或茯苓配方颗粒，例如茯苓标准汤剂。
所述的茯苓标准汤剂可通过本领域常规的方法制得，一般将茯苓饮片通过水煎煮、过滤、浓缩、冷冻干燥即可，例如通过下述步骤制得：称取待测的茯苓饮片，加9倍质量的水浸泡60min，煮沸后再煎煮30min，过滤；药渣加7倍量水煮沸后再煎煮25min，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩，冷冻干燥，即得茯苓标准汤剂。
其中，所述的茯苓配方颗粒可为本领域常规，通常由茯苓标准汤剂经制粒而得。
本发明中，所述容量瓶的规格根据待测样品的质量合理的选择即可。较佳地为10mL规格的容量瓶。
步骤(4)中，所述的外标一点法为本领域常规，代入中国药典中记载的外标法的计算公式即可。外标法的计算公式如下：
Figure BDA0002108576930000071
式中，Cx为供试品溶液中待测核苷的浓度，Cs为经高效液相色谱检测得到的供试品溶液中待测核苷的峰面积或峰高，Fx为含内标的对照品混合液中待测核苷的浓度，Cs为经高效液相色谱检测得到的含内标的对照品混合液中待测核苷的峰面积或峰高。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的茯苓质量控制的含量检测方法可有效的对茯苓标准汤剂和茯苓配方颗粒进行质量控制，采用了内标法对茯苓供试品溶液中的各核苷的含量进行高效液相色谱的检测，采用外标一点法对茯苓供试品溶液中的各核苷的含量进行计算，内标法减少了测量的误差，操作简单、稳定、重现性好、检测效率高，具有较强实用性。
附图说明
图1为实施例1中步骤5制得的含内标的茯苓供试品溶液、步骤2制得的内标溶液、步骤5中的茯苓供试品贮备液的HPLC色谱对比图，其中，峰1为尿苷，峰2为鸟苷，峰3为腺苷，峰4为栀子苷。
图2为实施例1中步骤3制得的含内标的混合对照品溶液的色谱图，其中，峰1为尿苷，峰2为鸟苷，峰3为腺苷，峰4为栀子苷。
图3为实施例2中含内标的茯苓供试品溶液的色谱图，其中，峰1为尿苷，峰2为鸟苷，峰3为腺苷，峰4为栀子苷。
图4为实施例3中不含内标的茯苓供试品贮备液的色谱图，其中，峰1为尿苷，峰2为鸟苷，峰3为腺苷。
图5为对比例1中的肌苷为内标的内标溶液和实施例1中不含内标的茯苓供试品贮备液的HPLC色谱对比图，其中，峰1为尿苷，峰2为鸟苷，峰3为腺苷，峰4为栀子苷。
图6为对比例2中的红景天苷为内标的内标溶液和实施例1中不含内标的茯苓供试品贮备液的HPLC色谱对比图，其中，峰1为尿苷，峰2为鸟苷，峰3为腺苷，峰4为栀子苷。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明实施例和对比例中的22批茯苓供试品的批号和产地如下表1所示：
表1 22批茯苓的批号和产地
Figure BDA0002108576930000081
实施例1
1、本实施例中采用的高效液相色谱检测的条件如下：Zorbax SB-Aq色谱柱(5μm，4.6×250mm，Agilent)，检测波长：260nm，柱温30℃，流速：0.8mL/min，进样体积：10μL，流动相为乙腈和水，梯度洗脱条件见下表2：
表2梯度洗脱条件
时间/min 水/％ 乙腈/％
0～12 100 0
12～20 100→98 0→2
20～45 98→80 2→20
45～46 80→100 20→0
46～60 100 0
表中百分号的含义为体积百分数。
2、内标溶液的制备
精密称取栀子苷，置于10mL的容量瓶中，加甲醇溶解定容，制备成0.6mg/mL的内标溶液。
3、含内标的混合对照品溶液的制备
分别精密量取尿苷、鸟苷和腺苷对照品，置于同一10mL的容量瓶中，加水溶解，制备成每毫升含的0.2mg尿苷、0.1mg鸟苷和0.2mg腺苷的混合对照品贮备液。精密移取上述制备的混合对照品贮备液1mL，置于10mL容量瓶中，精密加入步骤(2)中制备的内标溶液1mL，加水至刻度，摇匀，过滤，即得含内标的混合对照品溶液。
4、茯苓标准汤剂的制备
称取待测的茯苓饮片(例如药材批号为BFL-001的茯苓药材)100g，加9倍量水浸泡60min，煮沸后再煎煮30min，过滤；药渣加7倍量水煮沸后再煎煮25min，过滤，合并滤液。滤液减压浓缩，冷冻干燥，即得。
5、含内标的茯苓供试品溶液的制备
精密称取前述步骤4中制得的茯苓标准汤剂200mg，置于10mL容量瓶中，加8mL水超声30min，制得茯苓供试品贮备液；再在茯苓供试品贮备液中精密加入1mL内标溶液，加水至刻度线定容，过滤，即得含内标的茯苓供试品溶液。
在实施例1中步骤1中的高效液相色谱检测的条件下，对本实施例步骤5制得的含内标的茯苓供试品溶液、步骤2制得的内标溶液、步骤5中的茯苓供试品贮备液进行检测。图1为步骤5制得的含内标的茯苓供试品溶液、步骤2制得的内标溶液、步骤5中的茯苓供试品贮备液的HPLC色谱对比图。其中，图1中a为本实施例步骤5制得的含内标的茯苓供试品溶液的HPLC图谱，图1中b为步骤2制得的内标溶液的HPLC色谱图，图1中c为步骤5中的茯苓供试品贮备液的HPLC色谱图。其中，峰1为尿苷，峰2为鸟苷，峰3为腺苷，峰4为栀子苷。
在实施例1步骤1中高效液相色谱条件下，将步骤3制得的含内标的混合对照品溶液进行检测。图2为步骤3制得的含内标的混合对照品溶液的HPLC色谱图，其中峰1为尿苷，峰2为鸟苷，峰3为腺苷，峰4为栀子苷。
效果实施例1
1、内标法与外标法的比较
采用与实施例1尿苷、鸟苷和腺苷对照品，采用内标法和外标法分别进样3次，发现内标法测得的RSD值明显小于外标法测得的RSD值(见下表3)，从表中可以看出，内标法的RSD值明显小于外标法的RSD值，说明内标法能够有效的减少测量误差。以尿苷为例，内标法是将含内标的混合对照品溶液在实施例1中的高效液相色谱检测的条件下进样，记录尿苷的峰峰面积与栀子苷峰面积的比值；外标法是分别取混合对照品贮备液和茯苓供试品贮备液在实施例1中的高效液相色谱检测的条件下进样，分别记录尿苷的峰面积。鸟苷和腺苷的内标法和外标法的比较检测同上述尿苷。
表3内标法和外标法RSD值的比较
Figure BDA0002108576930000101
Figure BDA0002108576930000111
2、线性关系的考察
以尿苷为例，精密移取0.05、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00mL实施例1步骤3制备的混合对照品贮备液于10mL容量瓶，分别精密加入实施例1步骤2制备的内标溶液1.00mL，加水至刻度线，摇匀，过滤，得不同浓度的含内标的混合对照品溶液。精密吸取上述不同浓度的含内标的混合对照品溶液10μL注入液相色谱仪中，在实施例1步骤1条件下进样，分别记录栀子苷及尿苷的峰面积。以进样的含内标的混合对照品溶液中的尿苷的浓度为横坐标，尿苷与栀子苷的峰面积比为纵坐标作标准曲线。尿苷的线性回归方程为Y＝87.986X+0.0311，R2＝0.9999；表明尿苷在1～100μg/mL范围内有良好的线性关系。
同理，对于鸟苷而言，重复上述实验，记录栀子苷及鸟苷峰面积。鸟苷的线性回归方程为Y＝97.446X+0.0151，R2＝1。表明鸟苷在0.5～50μg/mL范围内有良好的线性关系。
同理，对于腺苷而言，重复上述实验，记录栀子苷及腺苷峰面积。腺苷的线性回归方程为Y＝120.26X+0.0502，R2＝0.9999，表明腺苷在1～100μg/mL范围内有良好的线性关系。
3、精密度的考察
同一批次茯苓供试品按实施例1的方法制备含内标的茯苓供试品溶液，按实施例1中的高效液相色谱检测的条件连续进样6次，计算尿苷、鸟苷和腺苷的峰面积的RSD值，每次测量的峰面积如下表4所示，由此算出茯苓供试品溶液中尿苷、鸟苷和腺苷的RSD值分别为0.87％、0.43％、0.49％，表明仪器精密度良好。
表4茯苓供试品中含量测定的精密度试验
Figure BDA0002108576930000112
Figure BDA0002108576930000121
4、重复性
同一批次茯苓供试品按实施例1的方法平行制备6份含内标的茯苓供试品溶液，在实施例1中的高效液相色谱检测的条件下进样，计算6份茯苓供试品溶液中尿苷、鸟苷、腺苷含量的RSD值，茯苓供试品的RSD值分别为2.65％、1.32％、0.78％，表明该方法重复性良好。
表5茯苓供试品中含量测定的重复性试验
Figure BDA0002108576930000122
Figure BDA0002108576930000131
5、稳定
同一批次茯苓供试品按实施例1的方法制备茯苓供试品溶液，按实施例1中的高效液相色谱检测的条件下进样，分别于1、2、4、6、12、24h进样，计算尿苷、鸟苷、腺苷峰面积的RSD值如下表所示，茯苓供试品峰面积的RSD值分别为0.52％、0.42％、0.46％；表明茯苓供试品溶液在24h内稳定性良好。
表6茯苓供试品中含量测定的稳定性试验
Figure BDA0002108576930000132
6、加样回收率
精密称取已知含量的同一批次茯苓供试品9份，每份0.1g，分别精密加入高中低浓度的尿苷、鸟苷、腺苷对照品，按实施例1的方法制备茯苓供试品溶液，在实施例1中的高效液相色谱检测的条件下进样，计算茯苓供试品溶液中尿苷、鸟苷、腺苷回收率，得出茯苓供试品中尿苷、鸟苷、腺苷的加样回收率范围分别为95.52％～99.05％、98.19％～103.13％、98.76～102.86％，平均加样回收率分别为96.66％(RSD＝1.32％)、99.76％(RSD＝1.56％)、100.15％(RSD＝1.30％)；茯苓供试品中尿苷、鸟苷、腺苷的加样回收率范围分别为98.35％～103.69％、96.54％～101.55％、98.57～103.32％，平均加样回收率分别为101.54％(RSD＝1.85％)、98.13％(RSD＝1.79％)、101.01％(RSD＝1.66％)，表明该方法的准确度好。
表7茯苓供试品中含量测定的加样回收率试验
Figure BDA0002108576930000141
7、茯苓供试品中核苷含量的计算
收集不同产地22批次的茯苓供试品，按实施例1的方法制备22批茯苓供试品溶液，在实施例1中的高效液相色谱检测的条件下进样，记录各核苷色谱峰与内标物栀子苷色谱峰峰面积，按照以下公式计算：
Figure BDA0002108576930000151
式中，Cx为供试品溶液中待测核苷的浓度，Cs为经高效液相色谱检测得到的供试品溶液中待测核苷的峰面积或峰高，Fx为含内标的对照品混合液中待测核苷的浓度，Cs为经高效液相色谱检测得到的含内标的对照品混合液中待测核苷的峰面积或峰高。22种茯苓供试品的出膏率和含量测定结果见下表8。
表8茯苓供试品的出膏率和含量测定
Figure BDA0002108576930000152
实施例2
本对比例中采用的液相色谱法测定的条件如下：Zorbax SB-Aq色谱柱(5μm，4.6×250mm，Agilent)，检测波长260nm，柱温30℃，流速0.5mL/min，进样体积：10μL，流动相为乙腈和水，本对比例的梯度洗脱条件见下表9：
表9梯度洗脱条件
时间/min 乙腈/％ 水/％
0～5 0→5 100→95
5～10 5 95
10～20 5→20 95→80
20～25 20 80
25～26 20→0 80→100
26～40 0 100
表中百分号的含义为体积百分数。
按照实施例1的方法制备不含内标的茯苓供试品溶液，按表9的梯度洗脱条件进行检测，所得色谱图如图4所示。从图中可以看出，该梯度洗脱条件下色谱峰也可以得到较好的基线分离。
实施例3
本对比例中采用的液相色谱法测定的条件如下：Zorbax SB-Aq色谱柱(5μm，4.6×250mm，Agilent)，检测波长：260nm，柱温30℃，流速：0.5mL/min，进样体积：10μL，流动相：乙腈和0.05％甲酸/水溶液(V/V)，本对比例的梯度洗脱条件见下表9：
表10梯度洗脱条件
时间/min 乙腈/％ 0.05％甲酸/水
0～12 0 100
12～17 0→2 100→98
17～27 2 98
27～45 2→20 98→80
表中百分号的含义为体积百分数。
按照实施例1的方法制备不含内标的茯苓供试品溶液，按表10的梯度洗脱条件进行检测，所得色谱图如图3所示。从图中可以看出该洗脱条件下色谱峰可以得到较好的基线分离。
对比例3(内标为肌苷)
精密称取肌苷对照品，加甲醇溶解定容，制成0.6mg/mL的溶液，作为内标溶液。精密移取1mL置于10mL容量瓶中，加水至刻度线，过滤，精密吸取10μL按照实施例2中高效液相色谱检测的条件进样。图5为本对比例中肌苷为内标的内标溶液和不含内标的茯苓供试品贮备液的HPLC色谱对比图，其中，图5中a为本对比例中肌苷为内标的内标溶液的色谱图，图5中b为不含内标的茯苓供试品贮备液的色谱图。结果显示，茯苓供试品溶液中含少量的肌苷，肌苷不适合作内标。
对比例4：(内标为红景天苷)
精密称取红景天苷对照品，加甲醇溶解定容，制成0.6mg/mL的溶液，作为内标溶液。精密移取1mL置于10mL容量瓶中，加水至刻度线，过滤，精密吸取10μL按照实施例2中高效液相色谱检测的条件进样。图6为本对比例中红景天苷为内标的内标溶液和不含内标的茯苓供试品贮备液的HPLC色谱对比图，其中图6中a为本对比例中红景天苷为内标的内标溶液的色谱图，b为不含内标的茯苓供试品贮备液的色谱图。结果显示，红景天苷在该洗脱条件下的响应值太低，不适合作内标。

Claims (10)

1.一种茯苓中核苷含量的检测方法，其特征在于，其包括以下步骤：以栀子苷为内标，通过高效液相色谱检测茯苓供试品溶液中核苷的含量即可；所述的核苷为尿苷、鸟苷和腺苷；所述的高效液相色谱检测采用梯度洗脱的方式进行；所述的梯度洗脱的条件按下述方式中的任意一种进行：
方式I：
时间/min 乙腈/% 水/% 0~12 0 100 12~20 0→2 100→98 20~45 2→20 98→80 45~46 20→0 80→100 46~60 0 100
表中百分号的含义为体积百分数，
方式II：
时间/min 乙腈/% 水/% 0~5 0→5 100→95 5~10 5 95 10~20 5→20 95→80 20~25 20 80 25~26 20→0 80→100 26~40 0 100
表中百分号的含义为体积百分数；
方式Ⅲ：
时间/min 乙腈/% 0.05%甲酸/水 0~12 0 100 12~17 0→2 100→98 17~27 2 98 27~45 2→20 98→80
表中百分号的含义为体积百分数；
所述的高效液相色谱检测中的色谱柱为十八烷基硅烷键合色谱柱。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
流动相的流速为0.5~1.0mL/min；
和/或，所述高效液相色谱检测中，色谱柱的柱温为25~30℃；
和/或，所述的高效液相色谱检测中的检测波长为250~280nm；
和/或，所述的高效液相色谱检测中的进样体积为10~20μL。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.8mL/min；
和/或，所述高效液相色谱检测中，色谱柱的柱温为30℃；
和/或，所述的高效液相色谱检测中的检测波长为260nm；
和/或，所述的高效液相色谱检测中的进样体积为10μL。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述茯苓中核苷含量的检测方法具体包括以下步骤：
步骤（1）制备内标溶液；
步骤（2）制备含内标的混合对照品溶液并经所述的高效液相色谱检测，记录各核苷的峰面积或峰高；
步骤（3）制备含内标的茯苓供试品溶液并经所述的高效液相色谱检测，记录各核苷的峰面积或者峰高；
步骤（4）按外标一点法计算茯苓供试品溶液中各核苷的浓度即可。
5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的内标溶液中栀子苷的浓度为0.5~1.0mg/mL；
和/或，所述内标溶液的溶剂为水和/或甲醇。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的内标溶液中栀子苷的浓度为0.6mg/mL；
和/或，所述内标溶液的溶剂为甲醇。
7.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中，以所述的核苷为鸟苷、鸟苷和腺苷为例，含内标的所述混合对照品溶液中尿苷的浓度为0.001~0.1mg/mL；
和/或，含内标的所述混合对照品溶液中鸟苷的浓度为0.0005~0.05 mg/mL；
和/或，含内标的所述混合对照品溶液中腺苷的浓度为0.001~0.1mg/mL；
和/或，含内标的所述混合对照品溶液中栀子苷的浓度为0.04~0.1mg/mL；
和/或，含内标的所述的混合对照品溶液的溶剂为水或体积百分比为5~15%的甲醇水溶液。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中，含内标的所述混合对照品溶液的溶剂为体积百分比为10%的甲醇水溶液；
和/或，所述的含内标的混合对照品溶液中尿苷的浓度为0.005mg/mL、0.01mg/mL、0.02mg/mL或者0.05mg/mL；和/或，所述的含内标的混合对照品溶液中鸟苷的浓度为0.0025mg/mL、0.005mg/mL、0.01mg/mL或者0.025mg/mL；和/或，所述的含内标的混合对照品溶液中腺苷的浓度为0.005mg/mL、0.01mg/mL、0.02mg/mL或者0.05mg/mL；
和/或，含内标的所述混合对照品溶液中栀子苷的浓度0.06mg/mL。
9.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤（3）中，含内标的所述茯苓供试品溶液中茯苓供试品的浓度为10~30mg/mL；
和/或，含内标的所述茯苓供试品溶液中栀子苷的浓度为0.04~0.1mg/mL；
和/或，含内标的所述茯苓供试品溶液的溶剂为水或体积百分比为4.5~28%的甲醇水溶液；
和/或，含内标的所述茯苓供试品溶液中，采用的茯苓供试品为茯苓标准汤剂。
10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，步骤（3）中，含内标的所述茯苓供试品溶液中茯苓供试品的浓度为20mg/mL；
和/或，含内标的所述茯苓供试品溶液中栀子苷的浓度为0.06mg/mL；
和/或，含内标的所述茯苓供试品溶液的溶剂为体积百分比为10%的甲醇水溶液。
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