CN110940749B - 一种同时检测治疗儿童咳嗽的中药四种成分含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时检测治疗儿童咳嗽的中药四种成分含量的方法,所述治疗儿童咳嗽的中药由牛蒡子、桑叶、川贝母、薄荷、板蓝根、荆芥穗、枳壳、前胡、紫苑、甘草十味药材制成,所述四种成分为甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷和牛蒡苷,该方法包括将待测样品用提取溶剂提取后上高效液相色谱仪进行检测的步骤。本发明能同时检测出四种物质的含量,所采用的色谱条件分离效果好,出峰时间短,检测结果重现性好,准确度高,本发明使中药的质量更加可控。
Description
技术领域
本发明属于药物分析领域,具体涉及一种同时检测治疗儿童咳嗽的中药中四种成分含量的方法。
背景技术
CN 101607032A公开了一种治疗儿童咳嗽的中药,它由牛蒡子、桑叶、川贝母、薄荷、板蓝根、荆芥穗、枳壳、前胡、紫苑、甘草十味中药材制成,该中药用于治疗急性气管-支气管炎所致小儿外感咳嗽,目前正在由健民药业集团股份有限公司开展新药临床研究,属于六类中药新药。
目前对该中药的质量控制主要是通过检测牛蒡苷的含量,但是对单一成分的定量检测很难真正控制中药的产品质量,无法彻底杜绝中药掺假、伪劣现象,也不能客观反映和评价中药质量的一致性。因此,迫切需要建立一种针对该中药的新的质量控制方法,以建立可溯源的、与临床疗效高度关联的全程质量控制体系。
发明内容
本发明的目的是针对现有的治疗儿童咳嗽的中药含量测定指标单一的缺陷,提供一种同时检测甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷和牛蒡苷四种成分含量的方法。
为实现上述目的,本发明采用如下技术手段:
一种同时检测治疗儿童咳嗽的中药四种成分含量的方法,所述治疗儿童咳嗽的中药由牛蒡子、桑叶、川贝母、薄荷、板蓝根、荆芥穗、枳壳、前胡、紫苑、甘草十味药材制成,所述四种成分为甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷和牛蒡苷,所述检测方法包括将待测样品用提取溶剂提取后上高效液相色谱仪进行检测的步骤,所述高效液相色谱仪含有紫外检测器,所述紫外检测器的设定检测波长为260~300nm,所述高效液相色谱仪的固定相为DikmaInspire Phenyl-hexyl色谱柱,流动相A为含0.1~1%溴乙烷的乙腈溶液,流动相B为0.1~0.5%磷酸水溶液,采用梯度洗脱,流速为0.5~2ml/min,柱温为25~35℃。
优选地,所述提取溶剂为75%甲醇。
优选地,所述紫外检测器的设定检测波长为280nm。
优选地,所述流动相A为含0.1%溴乙烷的乙腈溶液,所述流动相B为0.2%磷酸水溶液。
优选地,所述梯度洗脱的时间为40min,分为4个时间段,各时间段流动相B的体积变化为:0~20min,流动相B 80%;20~30min,流动相B 80~50%;30~35min,流动相B 50~80%;35~40min,流动相B 80%。具体洗脱程序见表1。
表1梯度洗脱程序
时间min | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0~20 | 20 | 80 |
20~30 | 20--50 | 80--50 |
30~35 | 50--20 | 50--80 |
35~40 | 20 | 80 |
优选地,所述流速为1.0ml/min。
优选地,所述柱温为30℃。
本发明中凡是涉及到的溶液浓度均为体积浓度。
本发明的有益效果是:采用本发明提供的方法能同时检测出治疗儿童咳嗽的中药中四种物质的含量,检测效率高,速度快,费用低,所采用的色谱条件分离效果好,干扰少、出峰时间短、峰面积大,检测结果重现性好,准确度高。采用该方法能更加全面地控制中药内在质量,客观反映中药质量的一致性,彻底杜绝中药掺假、伪劣现象,更有利于对中药生产的各个阶段包括药材投料等环节进行监控,从而建立可溯源的、与临床疗效高度关联的全程质量控制体系。
附图说明
图1是四种混合对照品的HPLC图谱。
图2是实施例1流动相1得到的高效液相色谱图。
图3是实施例1流动相2得到的高效液相色谱图。
图4是实施例1流动相3得到的高效液相色谱图。
图5是实施例2采用XB-NH2色谱柱得到的高效液相色谱图。
图6是实施例2采用Dikma Inspire Phenyl-hexyl色谱柱得到的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细地说明。
以下实施例中所用到的中药(商品名小儿宣肺止咳糖浆)由健民药业集团股份有限公司生产。
处方:牛蒡子 100g 桑叶100g 川贝母35g 薄荷70g
板蓝根 85g 荆芥穗70g 枳壳70g 前胡70g
紫苑 85g 甘草50g
制法:参照CN 101607032A。
试药:小儿宣肺止咳糖浆(批号:190701,由健民药业集团股份有限公司提供);甘草苷对照品(供含测用,批号:111610-201607);柚皮苷(供含测用,批号:110722-201815)、新橙皮苷(供含测用,批号:111857-201804)、牛蒡苷(供含测用,批号:110819-201611),均购自中国食品药品检定研究院;乙腈为色谱纯,磷酸为分析纯,甲醇为分析醇,水为超纯水。
实施例1流动相的选择
样品溶液制备:取小儿宣肺止咳糖浆,摇匀,精密量取5ml,置100ml量瓶中,用75%(体积)甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
仪器:Agilent1100型高效液相色谱仪系列(美国安捷伦科技公司,包括四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、Chemstation色谱工作站);
流动相1:乙腈为流动相A,水为流动相B;
流动相2:乙腈为流动相A,0.2%(体积)磷酸水溶液为流动相B;
流动相3:含0.1%(体积)溴乙烷的乙腈为流动相A,0.2%磷酸水溶液为流动相B。
梯度洗脱条件:见表1。
柱温:30℃;检测波长:280nm;流速:1.0ml/min;进样量:10ul
色谱柱:C18色谱柱
结果:由图2~4可看出,图2(流动相1)、图3(流动相2)中2号色谱峰(柚皮苷峰)存在明显得肩峰,说明该流动相分离效果不好,并且图2、图3的3号色谱峰(新橙皮苷峰)峰形也较差;而图4(流动相3)中2号和3号色谱峰的分离度和峰形较图1、图2有明显改善,因此最终选择流动相3。表2是三种流动相测得的各成分峰分离度。
表2三种流动相得到的四种成分色谱峰分离度
实施例2色谱柱的选择
样品溶液制备:取本品摇匀,精密量取5ml,置100ml量瓶中,用75%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
仪器:Agilent1100型高效液相色谱仪系列(美国安捷伦科技公司,包括四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、Chemstation色谱工作站);
流动相:含0.1%溴乙烷的乙腈为流动相A,0.2%磷酸水溶液为流动相B。
梯度洗脱条件:见表1。
柱温:30℃;检测波长:280nm;流速:1.0ml/min;进样量:10ul
色谱柱1:Agilent XDB-C18色谱柱(250×4.6mm,5um)
色谱柱2:XB-NH2(250×4.6mm,5um)
色谱柱3:Dikma Inspire Phenyl-hexyl(250×4.6mm,5um)
结果:如图4、5、6所示,图4(色谱柱1)中的2号峰分离度不高;图5(色谱柱2)中杂质峰较多且四种成分的峰面积较小,且未达到分离度的要求;图6(色谱柱3)中四种成分的峰面积大,分离度好,出峰速度更快。故最终选择Dikma Inspire Phenyl-hexyl色谱柱。表3是三种色谱柱测得的各成分峰分离度。
表3三种色谱柱得到的四种成分色谱峰分离度
实施例3波长的选择
参考《中国药典》2015片一部牛蒡子、枳壳、小儿惊风散和附子理中丸下规定,牛蒡子中牛蒡苷检测波长为280nm,枳壳中柚皮苷和新橙皮苷的检测波长为283nm,小儿惊风散和附子理中丸中甘草苷的检测波长为276nm,综合以上文献,最终选择280nm为本方法的检测波长。
实施例4方法验证
1.四种物质的定位
对照品溶液的配制:精密称取甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷和牛蒡苷标准品适量,加75%甲醇分别制成每1ml含甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷、牛蒡苷各10ug、130ug、100ug、300ug的混合溶液。
仪器:Agilent1100型高效液相色谱仪系列(美国安捷伦科技公司,包括四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、Chemstation色谱工作站);
流动相:含0.1%溴乙烷的乙腈为流动相A,0.2%磷酸水溶液为流动相B;
梯度洗脱条件:见表1。
色谱柱:Dikma Inspire Phenyl-hexyl
柱温:30℃
检测波长:280nm
进样量:10ul
流速:1ml·min-1
测定结果见表4,混合对照品的HPLC图谱见图1。
表4四种物质的定位
物质名称 | 对应的峰 | 保留时间 | 相对保留时间 | 分离度 |
甘草苷 | 1峰 | 6.085 | 0.409 | 2.18 |
柚皮苷 | 2峰 | 10.217 | 0.687 | 2.59 |
新橙皮苷 | 3峰 | 13.126 | 0.883 | 2.86 |
牛蒡苷 | 4峰 | 14.872 | 1 | 2.44 |
2.线性
精密称定4种对照品(0.52mg甘草苷、6.93mg柚皮苷、4.99mg新橙皮苷、16.1mg牛蒡苷),用75%甲醇溶解于50ml容量瓶中,配制成质量浓度分别为甘草苷0.00968mg·ml-1、柚皮苷0.13125mg·ml-1、新橙皮苷0.09940mg·ml-1、牛蒡苷0.30880mg·ml-1的混合对照品溶液,再用75%甲醇分别稀释成含母液80%、60%、40%、20%、10%的系列混合对照品溶液,各精密吸取10μl,按上述色谱条件测定,以峰积分面积对进样量进行线性回归。在定量限浓度至不高于150%指标浓度的范围内取6个浓度点进行研究。线性关系以测得的响应信号(峰面积)对被分析物浓度的函数作图,用最小二乘法进行线性回归,由相关系数R证实良好的线性关系,要求该线性回归系数R的数值应不小于0.999,结果见表5。
表5四种物质的标准曲线、相关系数及校正因子
有关物质 | 标准曲线 | 相关系数 | 校正因子 |
甘草苷 | Y=1598.6X+0.4088 | 0.9992 | 0.85 |
柚皮苷 | Y=1574.8X-6.3959 | 0.9993 | 0.91 |
新橙皮苷 | Y=1663.1X-5.4988 | 0.9992 | 0.87 |
牛蒡苷 | Y=526.11X-0.9685 | 0.9995 | 0.99 |
3.精密度
①重复性配制6个相同浓度的样品溶液并进行测试,每个溶液进样2针,要求6次含量测定结果的相对标准差应不大于2.0%,结果见表6。
表6四种物质含量测定的重复性试验结果
样品 | 甘草苷 | 柚皮苷 | 新橙皮苷 | 牛蒡苷 |
RSD | 1.57% | 1.61% | 1.78% | 1.37% |
结果表明:各成分的RSD值在要求范围内,表明检测方法的重复性结果良好。
②中间精密度在同一实验室,由不同检验人员于不同日期选择不同仪器对三批样品进行含量测定方法操作,要求两者含量测定结果的相对标准差应不大于2.0%,结果见表7。
表7中间精密度考察结果
结果表明:各成分的RSD值在要求范围内,方法中间精密度良好。
4.准确度
通过加入已知量的各组分,再测定加样样品中已知组分的测定结果和理论值的比值,从而计算出回收率,以百分率%表达,要求回收率在95.0%-105.0%之间,结果见表8。
表8四种物质的回收率测定结果
样品 | 甘草苷 | 柚皮苷 | 新橙皮苷 | 牛蒡苷 |
平均回收率 | 98.74% | 99.38% | 99.05% | 99.63% |
结果表明:该方法测定各有关物质的准确度良好。
5.稳定性
将小儿宣肺止咳糖浆(批号:190701)供试品溶液室温保存,每隔4小时或更长时间测定一次峰面积,要求间隔时间内含量测定结果的相对标准差应不大于2.0%,见表9。
表9稳定性测定结果
结果表明:供试品溶液在24小时内保持稳定。
实施例5样品测定
(1)供试品溶液的制备:取本品摇匀,精密量取5ml,置100ml量瓶中,用75%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
(2)对照品溶液的制备:精密称取甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷和牛蒡苷标准品适量,加75%甲醇分别制成每1ml含甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷、牛蒡苷各10ug、130ug、100ug、300ug的混合溶液。
(3)色谱条件与系统适应性:仪器:Agilent1100型高效液相色谱仪系列(美国安捷伦科技公司,包括四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、Chemstation色谱工作站)
流动相:乙腈(含0.1%溴乙烷)为流动相A,0.2%磷酸水溶液为流动相B;
梯度洗脱条件:
固定相:Dikma Inspire Phenyl-hexyl
柱温:30℃
检测波长:280nm
进样量:10ul
流速:1ml·min-1
(4)测定:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl注入液相色谱仪,测定。
(5)计算公式:
Ci对为各特定有关物质对照品溶液的浓度(mg/ml)
Ai对为各特定有关物质对照品溶液的峰面积
Ai样为各特定有关物质峰面积
W样为样品取样量(ml)
(6)结果:所测得的各有关物质的含量见表10。
表10 6批样品中有关物质的含量(mg/ml)
Claims (5)
1.一种同时检测治疗儿童咳嗽的中药四种成分含量的方法,所述治疗儿童咳嗽的中药由牛蒡子、桑叶、川贝母、薄荷、板蓝根、荆芥穗、枳壳、前胡、紫苑、甘草十味药材制成,其特征在于:所述四种成分为甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷和牛蒡苷,所述检测方法包括将待测样品用75%甲醇提取后上高效液相色谱仪进行检测的步骤,所述高效液相色谱仪含有紫外检测器,所述紫外检测器的设定检测波长为260-300nm,所述高效液相色谱仪的色谱柱 为Dikma Inspire Phenyl-hexyl色谱柱,流动相A为含0.1~1%溴乙烷的乙腈溶液,流动相B为0.1~0.5%磷酸水溶液,采用梯度洗脱,流速为0.5~2ml/min,柱温为25~35℃,
所述梯度洗脱的时间为40min,分为4个时间段,各时间段流动相B的体积变化为:0~20min,流动相B 80%;20~30min,流动相B 80~50%;30~35min,流动相B 50~80%;35~40min,流动相B 80%。
2.如权利要求1所述同时检测治疗儿童咳嗽的中药四种成分含量的方法,其特征在于:所述紫外检测器的设定检测波长为280nm。
3.如权利要求1所述同时检测治疗儿童咳嗽的中药四种成分含量的方法,其特征在于:所述流动相A为含0.1%溴乙烷的乙腈溶液,所述流动相B为0.2%磷酸水溶液。
4.如权利要求1所述同时检测治疗儿童咳嗽的中药四种成分含量的方法,其特征在于:所述流速为1.0ml/min。
5.如权利要求1所述同时检测治疗儿童咳嗽的中药四种成分含量的方法,其特征在于:所述柱温为30℃。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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