CN113655135A - 一种马兜铃酸i的定量检测方法与限量方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体公开了一种马兜铃酸I的定量检测方法与限量方法，可用于含有或疑似含有马兜铃酸I的物质或产品的质量控制与马兜铃酸的限量。本发明采用液相色谱串联质谱检测的方法明确了适用的色谱条件与质谱条件，并特别针对清肺排毒颗粒中马兜铃酸I的定量检测方法与限量方法进行了细致的方法学探究与优化，为清肺排毒颗粒的质量控制提供了良好的科学依据和解决方案。

Description

一种马兜铃酸I的定量检测方法与限量方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种马兜铃酸I的定量检测方法与限量方法。
背景技术
清肺排毒汤由麻杏石甘汤、小柴胡汤、五苓散、射干麻黄汤4个经典方组成，均源自汉代张仲景所著的《伤寒杂病论》，组方合理，性味平和，可宣肺平喘、解毒化湿，用于外感寒湿，内有郁热，脾胃失调所致寒湿闭肺扰脾证，可减轻寒湿疫患者主要症状，对普通型、轻型和重型均有明显疗效。
清肺排毒颗粒是一种基于“清肺排毒汤”复方研制而成的颗粒剂，该颗粒剂既保持了汤剂吸收快、作用迅速的优点，又克服了汤剂临用时煎煮不方便、服用量大、易霉变等缺点。
然而，以上中药复方中含有细辛，根据文献报道，细辛中含有马兜铃酸类化合物，而马兜铃酸类化合物是马兜铃科马兜铃属植物特有的一类硝基菲类化合物。近几十年以来，临床上由于长期服用含有马兜铃酸类化合物的药物，不断出现含马兜铃酸类成分的药品引起肝肾损伤的病例，自2000年5月起，FDA禁止了含有马兜铃酸类成分的中成药，包括马兜铃、广防己、天仙藤等相关草药的进口和销售。在马兜铃酸类化合物中，马兜铃酸I(aristolochic acid I，AAI)为其主要毒性成分。《中国药典》2020年版中规定，细辛每日的用量范围为1～3g，且每克细辛中马兜铃酸I(aristolochic acid I，AAI)的含量不得超过0.001％。
因此，在加强“清肺排毒汤”复方应用推广的同时，也需对不同剂型药物中的马兜铃酸I含量进行严格的检测与控制。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是建立一种适用于清肺排毒颗粒中马兜铃酸I的定量检测方法与限量方法。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种马兜铃酸I的定量检测方法，采用液相色谱-质谱联用仪对待测样品中的马兜铃酸I进行检测；
色谱条件包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以乙腈为流动相A，0.1％甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱过程为：0-7min内，流动相A和流动相B的体积比从40:60匀速渐变至 60:40；7-8.5min内，流动相A和流动相B的体积比从60:40匀速渐变至 95:5；8.5-10min内，流动相A和流动相B的体积比为95:5；10-10.1min 内，流动相A和流动相B的体积比从95:5匀速渐变至40:60；10.1-13min 内，流动相A和流动相B的体积比为40:60；
质谱条件包括：采用MRM模式,在正离子下进行扫描，对质荷比 (m/z)359.0→298.0和359.0→296.0离子对进行检测。
进一步地，色谱条件还包括：进样体积为2μL，柱温为35℃，流速为0.3mL/min。
进一步地，质谱条件还包括：电喷雾离子源，正离子毛细管电压4 kV，负离子毛细管电压3.5kV干燥气温度300℃，干燥气流速5L/min，鞘气温度250℃，鞘气流速11L/min，雾化器压力45psi。
第二方面，本发明提供一种马兜铃酸I的限量方法，包括如下步骤：
(1)以马兜铃酸I作为对照品，配制浓度为目标限量浓度的对照品溶液；
(2)利用待测样品配制供试品溶液；
所述待测样品为含有或疑似含有马兜铃酸I的任意物质或产品；
(3)将对照品溶液与供试品溶液分别注入液相色谱-质谱联用仪，根据权利要求1～3任一项所述的定量检测方法进行测定，供试品的质荷比(m/z)359.0→298.0和359.0→296.0离子对提取色谱图中，应不得同时出现与对照品相应色谱图中保留时间一致的色谱峰，若同时出现，则供试品中质荷比(m/z)359.0→298.0的色谱峰应小于对照品中质荷比(m/z)359.0→298.0的色谱峰。
进一步地，所述待测样品为含有或疑似含有马兜铃酸I的任意物质或产品。
更进一步地，所述待测样品为清肺排毒颗粒。
作为优选，所述供试品溶液的配制方法为：取清肺排毒颗粒适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
作为优选，所述对照品溶液的配制方法为：取马兜铃酸I对照品，加70％甲醇配制浓度为目标限量浓度的对照品溶液。
作为优选，配制所述对照品溶液的浓度为5ng/mL。
根据中国药典4部0431和0512中的定量检测方法的要求：“定量检测时，信噪比应不小于10；定性检测时，信噪比应不小于3；”因此工作曲线为马兜铃酸I的浓度在10.22ng/mL-102.2ng/mL范围。马兜铃酸I 有肾毒性的危害，为保障用药安全，我们将检测浓度设定在5ng/mL。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种针对马兜铃酸I的定量检测方法，可用于含有或疑似含有马兜铃酸I的物质或产品的质量控制与马兜铃酸I的限量。本发明采用液相色谱串联质谱检测的方法，特别针对清肺排毒颗粒中马兜铃酸I的定量检测方法与限量方法进行了细致的方法学探究与优化，为清肺排毒颗粒的质量控制提供了良好的科学依据和解决方案。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为马兜铃酸I对照品的TIC图，359.0→298.0提取离子流图和 359.0→296.0提取离子流图。
图2为清肺排毒颗粒样品中马兜铃酸I的TIC图，359.0→298.0提取离子流图和359.0→296.0提取离子流图。
图3为加标后清肺排毒颗粒样品的TIC图，359.0→298.0提取离子流图和359.0→296.0提取离子流图。
图4为马兜铃酸I工作曲线。
图5为对比例1中采用药典方法对清肺排毒颗粒中马兜铃酸I的检测结果。
图6为对比例2中采用现有文献记载的方法对清肺排毒颗粒中马兜铃酸I的检测结果。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用仪器、材料、试剂等，均可从商业途径得到。
部分仪器与试药如下：Agilent 1290/6470液相色谱-质谱联用仪(配有在线脱气系统、超高压四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD紫外检测器、三重四级杆质谱检测器及LC/MS化学工作站)；分析天平： METTLER TOLEDO XA105梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司、JA5003(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；KQ-250B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；甲醇、乙腈：色谱纯Fisher；水：娃哈哈纯净水、屈臣氏蒸馏水；马兜铃酸I对照品：批号110746-201912，纯度99.1％，含量测定用，中国药品生物制品检定研究院。
实施例1
本实施例用于说明以清肺排毒颗粒作为待测样品时，马兜铃酸I的定量检测方法与限量方法。
1、马兜铃酸I定量离子对和定性离子对的选择
参照《中国药典》2020版一部细辛与九味羌活丸检查项下马兜铃酸I的离子对及条件摸索，确定质荷比(m/z)359.0→298.0和359.0→296.0 离子对分别为定量离子对和定性离子对。
2、色谱条件的选择
色谱条件：Agilent 1290/6470液相-串联质谱联用仪，三重四级杆质谱检测器；色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1×100mm)， No.02053807415120；乙腈为流动相A，0.1％甲酸溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱；柱温：35℃；流速为每分钟0.3mL。采用三重四级杆质谱检测器，电喷雾离子化(ESI)正离子模式，进行多反应监测 (MRM)。
图1为马兜铃酸I对照品的TIC图，359.0→298.0提取离子流图和 359.0→296.0提取离子流图。
图2为清肺排毒颗粒样品中马兜铃酸I的TIC图，359.0→298.0提取离子流图和359.0→296.0提取离子流图。
图3为加标后清肺排毒颗粒样品的TIC图，359.0→298.0提取离子流图和359.0→296.0提取离子流图。
表1
时间(分钟) 流动相A％ 流动相B％
0～7 40→60 60→40
7～8.5 60→95 40→5
8.5～10 95 5
10～10.1 95→40 5→60
10.1～13 40 60
3、最低定量限、检测限的确定
逐级稀释对照品，计算信噪比，以信噪比(S/N)等于10为最低定量限，以信噪比(S/N)等于3为最低检测限。由标准品直接稀释到相应浓度进行验证。经验证确定10.22ng/mL为最低定量限，5.89ng/mL 为最低检测限。
4、提取条件的选择
根据前期摸索的基础，选定使用50％甲醇、70％甲醇、100％甲醇做为溶媒进行提取溶剂的选择。样品称取约1g，平行2份实验，分别加入不同溶剂5mL，称定重量，超声提取40分钟，取下，放冷，补充失去的重量，过0.22μm膜滤过，取滤液，进行HPLC-MS测定。结果显示70％甲醇提取量高于其他溶剂，故选择用70％甲醇作为提取的溶媒。结果见表2。
表2.提取溶媒选择结果
Figure BDA0003154275420000061
Figure BDA0003154275420000071
5、提取溶剂体积的选择
分别选用10mL、25mL、50mL，70％甲醇作为溶媒进行提取溶剂体积的选择。样品称取约0.5g，称样量相同，平行2份实验，分别加入 70％甲醇各10mL、25mL、50mL，称定重量，超声提取30分钟，取下，放冷，补充失去的重量，过0.22μm膜滤过，取滤液，HPLC-MS测定。结果显示以25mL，70％甲醇提取量最优，故选择用25mL，70％甲醇进行提取。结果见表3。
表3.提取溶媒选择结果
提取溶剂体积 折合峰面积
10mL 977.075
25mL 1164.545
50mL 1091.887
6、提取时间的选择
样品粉末称取约0.5g，用70％甲醇25mL作为提取溶媒，各样平行 2份试验，称定重量，使用超声提取20分钟、30分钟、40分钟、60分钟4种不同提取时间的优选，取下，放冷，补足失去的重量，过0.22μm 膜滤过，取续滤液测定。结果显示，以超声提取20分钟、30分钟提取量近似，考虑到充分提取，故选择提取30分钟作为提取时间。结果见表4。
表4.不同提取时间选择结果
Figure BDA0003154275420000072
Figure BDA0003154275420000081
7、样品浓度与峰面积之间的线性关系考察
精密称取马兜铃酸I对照品5.11mg，置50mL量瓶中，加70％甲醇制成每1mL含0.1022mg的溶液。加70％甲醇配成成浓度为102.2，51.1， 25.55，20.44，12.264，10.22ng/mL的一系列对照品溶液，摇匀。吸取 2μL注入液相色谱-质谱仪，每个浓度连续进样3次，测定峰面积，以对照品浓度(ng/mL)为横坐标，对照品峰面积为纵坐标进行回归处理，绘制标准曲线，结果表明，马兜铃酸I在10.22ng/mL-102.2ng/mL范围内线性良好。其回归方程分别为：y＝8264x+16.414，R2＝0.9998。结果见表5、图4。
表5.马兜铃酸I工作曲线实验数据
序号 进样浓度μg/mL 平均峰面积
1 0.01022 95
2 0.01226 118
3 0.02044 190.56
4 0.02555 229.67
5 0.05110 437.33
6 0.10220 860.67
8、精密度试验
取含有马兜铃酸I(浓度：20.44ng/mL)的对照品溶液，连续测定 6次，连续三天进样，进行精密度试验。结果见表6。
表6.精密度试验数据
Figure BDA0003154275420000082
Figure BDA0003154275420000091
9、重复性试验
取同一批号清肺排毒颗粒样品6份，每份0.5g,分别加入含有马兜铃酸Ⅰ浓度为20.44ng/mL的溶液25mL，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，经0.22μm膜滤过，取续滤液进行重复性试验，每个样品进样2次。试验结果表明，该方法重复性良好。结果见表7。
表7.重复性试验数据
Figure BDA0003154275420000092
10、样品稳定性试验
取同一批号清肺排毒颗粒样品0.5g，加入20.44ng/mL马兜铃酸I对照品25mL，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，过滤后，进行稳定性试验，于室温放置，每间隔一定时间测定一次含量，测至48小时，结果见表8。可见样品溶液中被测成分的含量至少在48小时内稳定性良好。
表8.样品稳定性试验数据
Figure BDA0003154275420000101
11、回收率试验
取同一批号清肺排毒颗粒样品9份，每份0.5g,每3份分别加入12.2 ng/mL，25.7ng/mL，52.4ng/mL马兜铃酸I对照品25mL，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，过滤后，进行回收率试验。试验结果表明，该方法重复性良好，并按照该项下色谱条件，测定，按下式计算回收率，经测定马兜铃酸I的平均回收率为104.85％，RSD为5.45％。
实验结果表明，回收率符合含量测定的要求，结果见表9。
Figure BDA0003154275420000102
表9.马兜铃酸I回收率试验结果
Figure BDA0003154275420000103
Figure BDA0003154275420000111
12、15批次清肺排毒颗粒中马兜铃酸I的测定
按本发明所述方法测定15批清肺排毒颗粒中马兜铃酸I。比较清肺排毒颗粒中马兜铃酸I中峰面积与5ng/mL马兜铃酸I对照品峰面积。结果见表10。
表10. 15批清肺排毒颗粒中马兜铃酸I测定结果
Figure BDA0003154275420000112
根据上述实验结果，拟规定以质荷比(m/z)359.0→298.0和 359.0→296.0离子对提取的供试品离子流色谱中，应不得同时出现与对照品色谱保留时间一致的色谱峰，若同时出现，则供试品中m/z 359.0→298.0的色谱峰应小于对照品浓度的色谱峰。
结果表明，本实验方法适用清肺排毒颗粒样品中马兜铃酸I的限量检测。该方法前处理简便,专属性强，灵敏度高,重复性好，检测结果可靠。
对比例1
清肺排毒颗粒由21味中药材组成，由于清肺排毒颗粒中也含有细辛药材，因此，本对比例参考药典中对九味羌活丸(组成：羌活、防风、苍术、细辛、川芎、白芷、黄芩、甘草9种中药材)中马兜铃酸I 限量检查的方法对清肺排毒颗粒中马兜铃酸I定量检测的适用性进行了比对实验。
药典中，对九味羌活丸中马兜铃酸I限量检查的梯度条件为：0-10 min，乙腈比例由35％变为38％。药典方法的提取试剂和流动相溶剂的种类虽然与本发明相同，但是流动相的条件比例与本发明相差甚远，且针对样品不同，药典中主要针对九味羌活丸进行马兜铃酸I的限量检测。
经过实验后发现，采用药典方法的对照品出峰时间靠后且峰形差 (如图5中马兜铃酸I对照品的359.0→298.0提取离子流图所示)，样品中各成分的分离度不好(如图5中清肺排毒颗粒样品、加标样品的359.0 →298.0提取离子流图所示)，因此药典所记载的方法并不适用于清肺排毒颗粒中马兜铃酸I的限量检测。
对比例2
本对比例参考现有文献(陈奕君,王伟,肖红斌.基于液相色谱- 质谱联用的清肺排毒汤中痕量马兜铃酸I的监测及定量分析[J].药学学报,2020,55(8):1903-1907)，对其所记载的方法对清肺排毒颗粒中马兜铃酸I定量检测的适用性进行了比对实验。
文献中采用的定量分析条件为：流动相由0.2％乙酸-5mmol·L-1乙酸铵水(A):0.2％乙酸-乙腈(B)组成,梯度洗脱(v/v):0min,95％A； 1min，20％A；3min,50％A；5min，95％A；7min，95％A，进样体积为2μL,流速为0.4mL·min-1。然而，文献在使用反相柱的情况下，流动相体系中有机相比例越来越小，不利于实际样品的分离。
文献中的前处理方法为：精确量取清肺排毒煎煮液30mL,并转移至50mL离心管中,12 000r·min-1离心10min；取上清液，氮气吹干，随后用70％甲醇1mL复溶，过0.22μm微孔滤膜，至进样小瓶中,即得。然而，水提液用氮气吹干，此方法费事费力。
经实验后发现采用文献方法的马兜铃酸I标品的对称性不好，拖尾 (如图6中马兜铃酸I对照品的359.0→298.0提取离子流图所示)。采用MRM方法后发现色谱峰主要集中在1.5-3min内，分离度不好(如图6中清肺排毒颗粒样品的359.0→298.0提取离子流图所示)。且前处理方法繁琐，不利于实际清肺排毒颗粒中马兜铃酸I的限量检测。
本发明采用的流动相的类型和比例与该文献均不同，前处理简便，专属性强，灵敏度高，重复性好，检测结果可靠。适用清肺排毒颗粒样品中马兜铃酸I的限量检测并通过了方法学的研究。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种马兜铃酸I的定量检测方法，其特征在于，采用液相色谱-质谱联用仪对待测样品中的马兜铃酸I进行检测；
色谱条件包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以乙腈为流动相A，0.1％甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱过程为：0-7min内，流动相A和流动相B的体积比从40:60匀速渐变至60:40；7-8.5min内，流动相A和流动相B的体积比从60:40匀速渐变至95:5；8.5-10min内，流动相A和流动相B的体积比为95:5；10-10.1min内，流动相A和流动相B的体积比从95:5匀速渐变至40:60；10.1-13min内，流动相A和流动相B的体积比为40:60；
质谱条件包括：采用MRM模式,在正离子条件下进行扫描，对质荷比(m/z)359.0→298.0和359.0→296.0离子对进行检测。
2.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，色谱条件包括：进样体积为2μL，柱温为35℃，流速为0.3mL/min。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，质谱条件包括：电喷雾离子源，正离子毛细管电压4kV，负离子毛细管电压3.5kV干燥气温度300℃，干燥气流速5L/min，鞘气温度250℃，鞘气流速11L/min，雾化器压力45psi。
4.一种马兜铃酸I的限量方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以马兜铃酸I作为对照品，配制浓度为目标限量浓度的对照品溶液；
(2)利用待测样品配制供试品溶液；
所述待测样品为含有或疑似含有马兜铃酸I的任意物质或产品；
(3)将对照品溶液与供试品溶液分别注入液相色谱-质谱联用仪，根据权利要求1～3任一项所述的定量检测方法进行测定，供试品的质荷比(m/z)359.0→298.0和359.0→296.0离子对提取色谱图中，应不得同时出现与对照品相应色谱图中保留时间一致的色谱峰，若同时出现，则供试品中质荷比(m/z)359.0→298.0的色谱峰应小于对照品中质荷比(m/z)359.0→298.0的色谱峰。
5.根据权利要求4所述的限量方法，其特征在于，所述待测样品为含有或疑似含有马兜铃酸I的任意物质或产品。
6.根据权利要求5所述的限量方法，其特征在于，所述待测样品为清肺排毒颗粒。
7.根据权利要求6所述的限量方法，其特征在于，所述供试品溶液的配制方法为：取清肺排毒颗粒适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
8.根据权利要求7所述的限量检测方法，其特征在于，所述对照品溶液的配制方法为：取马兜铃酸I对照品，加70％甲醇配制浓度为目标限量浓度的对照品溶液。
9.根据权利要求8所述的限量检测方法，其特征在于，所述对照品溶液的浓度为5ng/mL。
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