CN102279234B - 一种中药苦黄注射剂的质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中药苦黄注射剂的质量检测方法，该方法采用高效液相色谱法同时在线检测8个黄酮类和蒽醌类活性化合物或同时在线检测4个生物碱类活性化合物。本发明通过大量实验优选出最佳的流动相组成，梯度洗脱程序、流速，检测波长和色谱柱等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的中药苦黄注射剂的质量检测方法，稳定性和重复性好、分析效率高、且对各分析成分的分离度好，可以灵敏准确的定性、定量检测各化合物，从而可以客观、全面、准确的评价苦黄注射剂的质量，对控制苦黄注射剂的质量和保证临床疗效具有重要意义。

Description

一种中药苦黄注射剂的质量检测方法

技术领域

本发明涉及一种中药制剂的质量检测方法，具体涉及一种中药苦黄注射剂的质量检测方法。

背景技术

苦黄注射剂是经典中药注射剂，具有稳定和良好的临床疗效。处方源于《伤寒论》中的“茵陈蒿汤”(茵陈、大黄、山桅)。此方历来被公认为治疗湿热黄疸的名方。苦黄注射液在此方基础上，由茵陈45～120重量份、春柴胡45～120重量份、苦参15～40重量份、大黄20～50重量份、大青叶35～100重量份制成的静脉注射液。该注射剂最早于96年批准上市销售，执行标准为国家药品标准(新药转正标准第30册)，为常熟雷允上制药有限公司(前身国营常熟制药厂)开发的一种有效治疗黄疸型病毒性肝炎的中药注射剂(药品批准文号为国药准字Z10960004)，苦黄注射剂销售近20多年来，临床效果明显，为肝病患者带来了康复的机会，苦黄注射剂活性成分主要是黄酮类、蒽醌类及生物碱类化合物，但是目前苦黄注射剂活性成分的质量标准检测方法只能一个一个对活性成分进行单独检测，检测工作繁琐，检测效率低，且检测的活性成分数量有限，不能很好的反应制剂的质量，且目前市场上同类产品的竞争日益剧烈，因此为了维护患者的利益，很有必要在现有技术的基础之上研究设计出能同时检测苦黄注射剂中黄酮类、蒽醌类及总生物碱类化合物的检测方法。

发明内容

发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种能同时检测苦黄注射剂中黄酮类、蒽醌类及总生物碱类化合物的新检测方法，该检测方法可以客观、全面、准确的评价苦黄注射剂的质量，对控制苦黄注射剂的质量和保证疗效具有重要意义。

技术方案：为了实现以上目的，本发明所提供的中药苦黄注射剂的质量检测方法，包括以下步骤：

(1)高效液相色谱法测定黄酮类和蒽醌类化合物，精密吸取中药苦黄注射剂10μl，注入高效液相色谱仪分析120分钟，色谱条件为：色谱柱：反相C₁₈柱，流动相：A相为浓度1％乙酸的水溶液，B相为体积比1∶80∶19的乙酸-乙腈-水，线性梯度洗脱，流速为0.5mL/min；紫外检测器，检测波长为262nm，柱温为30℃。

(2)高效液相色谱法测定生物碱类化合物，精密吸取中药苦黄注射剂10μl，注入高效液相色谱仪分析70分钟，色谱条件为：色谱柱：反相C₁₈柱，流动相：A相为体积比为100∶0.1∶0.1水-四氢呋喃-氨水，B相为甲醇，线性梯度洗脱，流速0.8ml/min，紫外检测器，检测波长为220nm，柱温为30℃。

作为优选方案，本发明提供的中药苦黄注射剂的质量检测方法，以上步骤(1)所述的黄酮类和蒽醌类化合物的检测方法，其中线性梯度洗脱程序为：0分钟时流动相A∶B的比例为98∶2，20分钟时流动相A∶B的比例为84∶16，30分钟时流动相A∶B的比例为80∶20，90分钟时流动相A∶B的比例为40∶60，100分钟时流动相A∶B的比例为0∶100，120分钟时流动相A∶B的比例为0∶10。

中药苦黄注射剂含有大黄、春柴胡、大青叶、茵陈中药成分，以上4味中药含有大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素甲醚、大黄酚等蒽醌类活性成分，并含有泽兰黄酮、蓟黄素、芦丁等黄酮类活性成分。为了能高效的同时检测以上不同结构的化合物，减少检测工作量，本发明经过大量实验对流动相组成、流动相的洗脱程序、流速、检测波长及色谱柱进行筛选。

1、本发明针对以上两类活性成分，通过全波长扫描和3D等高线观察，确定蒽醌和黄酮两类化合物在262nm处均有较大的吸收，因此本发明采用262nm作为检测波长，可以准确灵敏的检测到蒽醌和黄酮两类化合物。

2、由于以上蒽醌类化合物和黄酮类化合物的极性存在较大的相似，因此在色谱柱上同时分离比较困难，本发明首先对流动相的组成进行了大量筛选，确定采用A、B两相分别为浓度1％乙酸的水溶液，体积比1∶80∶19的乙酸-乙腈-水作为流动相组成，由于部分蒽醌类化合物如大黄酸、大黄素等，含有羧基或多个酚羟基，具有一定的酸性，容易电离成离子状态，导致分离和洗脱效果差，因此本发明在流动相中添加一定量的乙酸调节pH值，但是流动相的酸性太强，又会导致酸性蒽醌或黄酮类化合物溶解性差，甚至会沉淀堵塞色谱柱，因此调整流动相到合适的pH值非常重要，本发明通过不同乙酸加入量的筛选，确定A、B两相中最佳的乙酸浓度，可以有效防止如大黄酸、大黄酚等酸性成分的分离，从而可以保证在色谱柱上达到很好的分离效果，不会出现峰重叠或拖尾现象。本发明在确定流动相后，经色谱柱分析表明对于极性很类似的化合物，如大黄酚、大黄素甲醚等不能很好的分离，因此为了提高各成分的分离度，本发明对流动相的洗脱程序进行了大量筛选实验，通过不同时间段筛选A相和B相流动相的必例，最终确定出分离蒽醌类化合物和黄酮类化合物的最佳流动相洗脱程序，多次实验结果表明，采用本发明的流动相洗脱程序能将蒽醌类化合物和黄酮类化合物进行有效分离。

3、同时由于中药苦黄注射剂中蒽醌类和黄酮类化合物的数量较多，如流速过快，分离度不够理想，因此本发明对流动相的流速进行了考察，分别考察了1mL/min、0.8mL/min、0.6mL/min、0.5mL/min、0.4mL/min不同流速，实验结果表明，当流动相的流速为0.5mL/min时，蒽醌类和黄酮类化合物的峰形最好、分离度最好，理论塔板数最高，因此本发明采用流动相的流速为0.5mL/min。

4、同时本发明对色谱柱的柱温进行了筛选，考察了色谱柱在20℃、25℃、28℃、30℃和35℃条件下，蒽醌类和黄酮类化合物的分离效果，实验结果表明，色谱柱在30℃条件下分离效果最好，分离重复性和稳定性最好。因此本发明采用色谱柱的柱温为30℃。

5、同时本发明对色谱柱也进行了筛选，分别考察了安捷伦(Agilent)反相C18、C18柱，Waters C18、C8柱和国产C18进行了考察，实验结果表明，以安捷伦(Agilent)反相C18柱的分离效果最好。因此，本发明以安捷伦(Agilent)反相C18柱作为分析柱。

作为优选方案，本发明提供的的中药苦黄注射剂的质量检测方法，以上步骤(2)所述的生物碱类化合物的检测方法，其中线性梯度洗脱程序为：0分钟时流动相A∶B的比例为100∶0，25分钟时流动相A∶B的比例为82∶18，70分钟时流动相A∶B的比例为28∶72。

中药苦黄注射剂中苦参含有苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、槐定碱等生物碱的活性成分，部分生物碱的极性比较相似，因此在色谱柱上同时分离比较困难，本发明对流动相的组成进行了大量筛选，最后确定采用A、B两相，A相为体积比为100∶0.1∶0.1水-四氢呋喃-氨水，B相为甲醇，因为生物碱类化合物均具有一定的碱性，在溶液中会有一定程度的电离成离子状态，导致分离和洗脱效果差，因此本发明在流动相中添加一定量的碱氨水调节pH值，但是流动相的碱性太强，又会导致生物碱化合物溶解性差，甚至会沉淀堵塞色谱柱，因此调整流动相到合适的pH值非常重要，本发明通过不同氨水加入量的筛选实验，确定A、B两相中最佳的氨水浓度。本发明在确定分离个生物碱的最佳流动相后，为了进一步提高分离效果，对流动相的线性梯度洗脱程序进行了筛选实验，最终确定生物碱线性梯度洗脱程序为：0分钟时流动相A∶B的比例为100∶0，25分钟时流动相A∶B的比例为82∶18，70分钟时流动相A∶B的比例为28∶72，梯度洗脱可以在色谱柱上达到最佳的分离度。

同时本发明在分析总生物碱时，对流动相的流速进行了考察，因为如流速过快，分离度不够理想，因此本发明对流动相的流速进行了考察，分别考察了1mL/min、0.8mL/min、0.6mL/min、0.5mL/min、0.4mL/min不同流速，实验结果表明，当流动相的流速为0.8mL/min时，生物碱类化合物的峰形最好、分离度最好，理论塔板数最高能达10000以上，因此本发明采用流动相的流速为0.8mL/min。

同时本发明对生物碱类化合物的检测波长进行了考察，通过全波长扫描和3D等高线观察，确定各生物碱类化合物在220nm处均有较大的吸收，因此本发明采用220nm作为检测波长，可以准确灵敏的检测到各生物碱类化合物。

同时本发明对分析生物碱的色谱柱也进行了筛选，作为优选方案，本发明提供的中药苦黄注射剂的质量检测方法，步骤(2)所述的反相C₁₈柱为安捷伦ZorbaxExtend反相C₁₈柱。Zorbax Extend反相C₁₈柱(5μm，4.6×250mm)键合了双配位硅烷，结合双封端处理使硅胶在高pH(高达pH 11.5)条件下也不会溶解，因此作为分析本发明所述的中药苦黄注射剂中生物碱活性成分具有很好的峰形，且理论塔板数高，分离度好。

作为优选方案，本发明提供的中药苦黄注射剂的质量检测方法，步骤(1)和(2)所述的高效液相色谱仪为安捷伦110型分析仪。

有益效果：本发明提供的中药苦黄注射剂的质量检测方法和现有技术相比具有以下优点：

本发明根据中药苦黄注射剂中所含的活性成分，包括蒽醌类、黄酮类和生物碱类化合物的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，梯度洗脱程序、流速，检测波长、色谱柱等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的中药苦黄注射剂的质量检测方法可以在线同时检测所含的蒽醌类和黄酮类化合物或总生物碱类化合物，因此具有很高的分析效率，可以克服现有技术需要多次检测的缺点，且本发明提供的质量检测方法稳定性好、对各分析成分的分离度好，可以灵敏准确的定性、定量检测分析各化合物。因此，本发明提供的中药苦黄注射剂的质量检测方法可以可以客观、全面、准确的评价苦黄注射剂的质量，对控制苦黄注射剂的质量和保证临床疗效具有重要意义。

具体实施方式：

下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施列中药苦黄注射剂的质量检测

1、实验材料：(1)供试液的制备：取苦黄注射液5批(0910191、0910151、0909072、0909211、0907311)(药品批准文号为国药准字Z10960004)作为供试液稀释10倍后，0.45μm微孔滤膜过滤后进行分析；(2)标准对照液的制备：精密秤取大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素甲醚、大黄酚、泽兰黄酮、蓟黄素、芦丁各10毫克，配成1毫克/毫升的混合标准对照液。(3)精密秤取苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、槐定碱各10毫克，配成1毫克/毫升的混合标准对照液。

2、标准曲线的制备

2.1黄酮类和蒽醌类化合物标准曲线的制备，精密吸取大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素甲醚、大黄酚、泽兰黄酮、蓟黄素、芦丁混合标准对照液2μl、4μl、6μl、8μl和10μl，分别注入安捷伦110高效液相色谱仪分析120分钟，色谱条件为：色谱柱：安捷伦反相C₁₈柱，流动相：A相为浓度1％乙酸的水溶液，B相为体积比1∶80∶19的乙酸-乙腈-水，线性梯度洗脱(条件为：0分钟时流动相A∶B的比例为98∶2，20分钟时流动相A∶B的比例为84∶16，30分钟时流动相A∶B的比例为80∶20，90分钟时流动相A∶B的比例为40∶60，100分钟时流动相A∶B的比例为0∶100，120分钟时流动相A∶B的比例为0∶10。)，流速为0.5mL/min；紫外检测器，检测波长为262nm，柱温为30℃。

然后以峰面积为纵坐标、各标准品的浓度为横坐标绘制标准曲线：

大黄素标准曲线：Y＝5733X-71.53，r＝0.9992

芦荟大黄素标准曲线：Y＝6538X-42.52，r＝0.9992

大黄酸标准曲线：Y＝6379X-42.03，r＝0.9993

大黄素甲醚标准曲线：Y＝3771X-34.49，r＝0.9991

大黄酚标准曲线：Y＝7072X-118.3，r＝0.9993

芦丁标准曲线：Y＝3607X-28.98，r＝0.9998

泽兰黄酮标准曲线：Y＝8739X-125.2，r＝0.9999

蓟黄素标准曲线：Y＝4376X-68.46，r＝0.9994

通过以上分析，大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素甲醚和大黄酚的蒽醌类化合物，泽兰黄酮、蓟黄素和芦丁的黄酮类化合物在本发明提供的分析条件下，能够很好的达到分离，分离度均达到1.5以上，各化合物的标准曲线的线性关系良好，r值均达到0.999以上。因此本发明提供的分析方法可以用于同时检测中药苦黄注射中的蒽醌类和黄酮类化合物。

2.2生物碱类化合物标准曲线的制备，精密吸取苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、槐定碱混合标准液2μl、4μl、6μl、8μl和10μl，分别注入安捷伦110高效液相色谱仪分析70分钟，色谱条件为：色谱柱：安捷伦Zorbax Extend反相C₁₈柱，流动相：A相为体积比为100∶0.1∶0.1水-四氢呋喃-氨水，B相为甲醇，线性梯度洗脱(条件为：0分钟时流动相A∶B的比例为100∶0，25分钟时流动相A∶B的比例为82∶18，70分钟时流动相A∶B的比例为28∶72。)，流速0.8ml/min，紫外检测器，检测波长为220nm，柱温为30℃。

然后以峰面积为纵坐标、各标准品的浓度为横坐标绘制标准曲线：

苦参碱标准曲线：Y＝1276X-9.591，r＝0.9999

氧化苦参碱标准曲线：Y＝2354X-4.517，r＝0.9999

槐果碱标准曲线：Y＝1284X+6.512，r＝0.9998

槐定碱标准曲线：Y＝1723X-5.533，r＝0.9998

通过以上分析，苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、槐定碱四种生物碱类化合物在本发明提供的分析条件下，能够很好的达到分离，分离度均达到1.5以上，各化合物的标准曲线的线性关系良好，r值均达到0.999以上。因此本发明提供的分析方法可以用于同时检测中药苦黄注射中苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱和槐定碱活性成分。

3、中药苦黄注射剂分析

(1)高效液相色谱法测定黄酮类和蒽醌类化合物，分别精密吸取以上5批苦黄注射液(药品批准文号为国药准字Z10960004)的供试液各10μl，注入安捷伦110高效液相色谱仪分析120分钟，色谱条件为：色谱柱：反相C₁₈柱，流动相：A相为浓度1％乙酸的水溶液，B相为体积比1∶80∶19的乙酸-乙腈-水，线性梯度洗脱(条件为：0分钟时流动相A∶B的比例为98∶2，20分钟时流动相A∶B的比例为84∶16，30分钟时流动相A∶B的比例为80∶20，90分钟时流动相A∶B的比例为40∶60，100分钟时流动相A∶B的比例为0∶100，120分钟时流动相A∶B的比例为0∶10。)，流速为0.5mL/min；紫外检测器，检测波长为262nm，柱温为30℃。然后按2.1所述蒽醌类和黄酮类化合物的标准曲线鉴定和检测各化合物的含量。具体实验结果如表1和表2所示。

(2)高效液相色谱法测定生物碱类化合物，分别精密吸取以上5批苦黄注射液(药品批准文号为国药准字Z10960004)的供试液各10μl，注入安捷伦110高效液相色谱仪分析70分钟，色谱条件为：色谱柱：安捷伦Zorbax Extend反相C₁₈柱，流动相：A相为体积比为100∶0.1∶0.1水-四氢呋喃-氨水，B相为甲醇，线性梯度洗脱(条件为：0分钟时流动相A∶B的比例为100∶0，25分钟时流动相A∶B的比例为82∶18，70分钟时流动相A∶B的比例为28∶72。)，流速0.8ml/min，紫外检测器，检测波长为220nm，柱温为30℃。然后按2.2所述的总生物碱标准曲线鉴定和检测各化合物的含量。具体实验结果如表3和表4所示。

表1中药苦黄注射剂中蒽醌类和黄酮类化合物的检测结果

表2中药苦黄注射剂中蒽醌类和黄酮类化合物的检测结果

由表1和表2的实验结果表明，本发明提供的中药苦黄注射剂的检测方法，可以同时检测到5批中药苦黄注射剂中大黄素等5个蒽醌类化合物和芦丁等3个黄酮类化合物，这8个化合物在色谱柱上具有较好的分离度，从保留时间看出，各化合物和对照品具有很好的匹配度，因此采用本发明提供的检测方法只要进一针样品即可定性和定量检测到中药苦黄注射剂中的8个蒽醌类和黄酮类活性化合物，相比现有技术具有方便、快捷、工作效率高的优点，且对控制和全面评价中药苦黄注射剂质量具有很好的应用价值。

表3中药苦黄注射剂中生物碱类化合物的检测结果

表4中药苦黄注射剂中生物碱类化合物的检测结果

由表3和表4的实验结果表明，本发明提供的中药苦黄注射剂中生物碱类化合物的检测结果表明，可以同时检测到5批中药苦黄注射剂中苦参碱等4个生物碱类化合物，4个生物碱类化合物在色谱柱上能同时分开，具有很好的分离度，且各化合物的保留时间和对照品具有很好的匹配度，因此采用本发明提供的检测方法只要进一针样品即可定性和定量检测到中药苦黄注射剂中的4个生物碱活性化合物，相比现有技术具有方便、快捷、工作效率高的优点。

且以上实验结果表明，本发明提供的中药苦黄注射剂的质量检测方法稳定性和重复性好，对中药苦黄注射剂中蒽醌类、黄酮类好生物碱类化合物的分离度好，可以灵敏准确的定性、定量检测分析各化合物。因此，本发明提供的中药苦黄注射剂的质量检测方法可以可以客观、全面、准确的评价苦黄注射剂的质量，对控制苦黄注射剂的质量和保证临床疗效具有重要意义。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种中药苦黄注射剂的质量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)高效液相色谱法测定黄酮类和蒽醌类化合物，精密吸取中药苦黄注射剂10μl，注入高效液相色谱仪分析120分钟，色谱条件为：色谱柱：反相C₁₈柱，流动相：A相为浓度1％乙酸的水溶液，B相为体积比1:80:19的乙酸-乙腈-水，线性梯度洗脱，流速为0.5mL/min；紫外检测器，检测波长为262nm，柱温为30℃；

其中线性梯度洗脱程序为：0分钟时流动相A:B的比例为98:2，20分钟时流动相A:B的比例为84:16，30分钟时流动相A:B的比例为80:20，90分钟时流动相A:B的比例为40:60，100分钟时流动相A:B的比例为0:100，120分钟时流动相A:B的比例为0:10；

(2)高效液相色谱法测定生物碱类化合物，精密吸取中药苦黄注射剂10μl，注入高效液相色谱仪分析70分钟，色谱条件为：色谱柱：反相C₁₈柱，流动相：A相为体积比为100:0.1:0.1水-四氢呋喃-氨水，B相为甲醇，线性梯度洗脱，流速0.8ml/min，紫外检测器，检测波长为220nm，柱温为30℃；

线性梯度洗脱程序为：0分钟时流动相A:B的比例为100:0, 25分钟时流动相A:B的比例为82:18，70分钟时流动相A:B的比例为28:72。

2.根据权利要求1所述的中药苦黄注射剂的质量检测方法，其特征在于，步骤(2)所述的反相C₁₈柱为安捷伦Zorbax Extend 反相C₁₈柱。

3.根据权利要求1所述的中药苦黄注射剂的质量检测方法，其特征在于，步骤(1)和(2)所述的高效液相色谱仪为安捷伦110分析仪。