CN104792889A - 一种银黄清肺制剂的指纹图谱建立方法及其标准指纹图谱和应用 - Google Patents
一种银黄清肺制剂的指纹图谱建立方法及其标准指纹图谱和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种银黄清肺制剂的指纹图谱建立方法及其标准指纹图谱和应用。该方法对各供试品的前处理方法简单,特征性成分保留完整,能较全面的反映出产品的质量信息,具有较强的专属性和稳定性,精密度高,所得指纹图谱中各特征峰分离效果较好;可用于快速判断银黄清肺制剂是否合格,从而保证银黄清肺制剂的质量稳定和临床疗效。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药制剂的指纹图谱建立方法及其标准指纹图谱,本发明还涉及该指纹图谱在该制剂质量控制中的应用。
背景技术
银黄清肺制剂主要用于清肺化痰,止咳平喘,其现有质量标准及其它现有技术中尚无较好的质量控制方法来全面准确的控制产品质量,不能较好地保证其临床疗效。因此为了更全面有效的控制该产品的质量,非常有必要建立其指纹图谱进行质量控制。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种基于高效液相色谱法的银黄清肺制剂的指纹图谱建立方法及根据该方法建立得到的标准指纹图谱。
本发明技术方案如下:
一种银黄清肺制剂的标准指纹图谱的建立方法:将银黄清肺制剂的供试品溶液经高效液相色谱法检测,记录色谱图,采用色谱指纹图谱相似度软件计算生成银黄清肺制剂指纹图谱,其色谱条件为:色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱,柱温25~35℃,检测器为DAD检测器,检测波长200~230nm,进样量为5~25μl,流速0.8~1mL·min-1,流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B),梯度洗脱程序见表1:
表1 梯度洗脱程序表
所述银黄清肺制剂的标准指纹图谱的建立方法中银黄清肺制剂的供试品溶液按如下方法制备:
银黄清肺制剂为胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、滴丸:取溶有银黄清肺制剂的内容物的甲醇溶液经回流提取或超声处理,冷却,微孔滤膜过滤,取续滤液,即得;
银黄清肺制剂为口服液、合剂:取溶有银黄清肺制剂的内容物的甲醇溶液经回流提取或超声处理,微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。
进一步的,所述的银黄清肺制剂的供试品溶液按如下方法制备:
银黄清肺制剂为胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、滴丸:取银黄清肺制剂的内容物1-1.5g,精密加入甲醇30-50mL,精密称重后,回流提取或超声提取30-60min,冷却后用甲醇补足减失的重量,微孔滤膜滤过,取续滤液,即得;
银黄清肺制剂为口服液、合剂:取溶有银黄清肺制剂内容物5-10ml,精密加入甲醇30-50mL,精密称重后,回流提取或超声提取30-60min,冷却后用甲醇补足减失的重量,微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
所述银黄清肺制剂的标准指纹图谱的建立方法中,以盐酸麻黄碱、五味子醇甲、苦杏仁苷、橙皮苷、橙皮素、靛玉红、槲皮素、齐墩果酸、贝母素甲、贝母素乙、五味子甲素、甘草苷、柚皮苷、芦丁为对照品,对照品溶液按如下方法制备:
取盐酸麻黄碱对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取五味子醇甲对照品适量,加甲醇制成每1mL含6mg的溶液,即得;
取苦杏仁苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取橙皮苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.4mg的溶液,即得;
取橙皮素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取靛玉红对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.1mg的溶液,即得;
取槲皮素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.01mg的溶液,即得;
取齐墩果酸对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.08mg的溶液,即得;
取贝母素甲对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.35mg的溶液,即得;
取贝母素乙对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.27mg的溶液,即得;
取五味子甲素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.18mg的溶液,即得;
取甘草苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取柚皮苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.25mg的溶液,即得;
取芦丁对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得。
上述方法中,所述色谱柱优选为Inertil C18色谱柱(4.6*250mm,5μm)。
上述方法中,所述流速优选为1.0ml/min。
上述方法中,所述柱温优选为30℃。
上述方法中,所述检测波长优选为210nm。
作为上述方法的优选,所述色谱柱为Inertil C18色谱柱(4.6*250mm,5μm),流速为1.0ml/min,柱温为30℃,检测波长为210nm,进样量为10μl。
本发明所述一种银黄清肺制剂的标准指纹图谱的建立方法,其优选方法包括如下步骤:
(1)供试品溶液的制备:
银黄清肺制剂为胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、滴丸:取银黄清肺制剂的内容物1-1.5g,精密加入甲醇30-50mL,精密称重后,回流提取或超声提取30-60min,冷却后用甲醇补足减失的重量,微孔滤膜滤过,取续滤液,即得;
银黄清肺制剂为口服液、合剂:取溶有银黄清肺制剂内容物5-10ml,精密加入甲醇30-50mL,精密称重后,回流提取或超声提取30-60min,冷却后用甲醇补足减失的重量,微孔滤膜滤过,取续滤液,即得;
(2)对照品溶液的制备:
取盐酸麻黄碱对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取五味子醇甲对照品适量,加甲醇制成每1mL含6mg的溶液,即得;
取苦杏仁苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取橙皮苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.4mg的溶液,即得;
取橙皮素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取靛玉红对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.1mg的溶液,即得;
取槲皮素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.01mg的溶液,即得;
取齐墩果酸对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.08mg的溶液,即得;
取贝母素甲对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.35mg的溶液,即得;
取贝母素乙对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.27mg的溶液,即得;
取五味子甲素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.18mg的溶液,即得;
取甘草苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取柚皮苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.25mg的溶液,即得;
取芦丁对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
(3)HPLC测定:分别吸取步骤(1)所得的供试品溶液、步骤(2)所得的对照品溶液,分别注入高效液相色谱仪中,记录色谱图,其色谱条件为:色谱柱为Inertsil ODS-2(4.6×250mm,5μm);柱温30℃;检测波长210nm;进样量10μL;流速1mL·min-1,流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B);梯度洗脱程序见表2:
表2 梯度洗脱程序表
(4)标准指纹图谱制定:测定10~20批的供试品指纹图谱,采用色谱指纹图谱相似度软件计算获得银黄清肺制剂指纹图谱。
依据该优选方案,当供试品为银黄清肺胶囊时,建立的标准指纹图谱具有28个特征峰,其中3号峰为麻黄碱,8号峰为苦杏仁苷,13号峰为橙皮苷,14号峰为橙皮素,15号峰为柚皮苷,17号峰为芦丁,18号峰为靛玉红,19号峰为槲皮素,20号峰为齐墩果酸,21号峰为五味子醇甲;22号峰为甘草苷,24号峰为五味子甲素,26号峰为贝母素甲,27号峰为贝母素乙,各峰的相对保留时间分别为:0.0490~0.0515、0.0635~0.0675、0.1800~0.1898、0.1900~0.1995、0.2315~0.2401、0.2404~0.2535、0.3250~0.3378、0.3300~0.3452、0.3460~0.3675、0.3805~0.4091、0.4112~0.4385、0.4911~0.5185、0.5606~0.5892、0.5697~0.5996、0.5955~0.6255、0.6099~0.6485、0.6300~0.6598、0.6670~0.6998、0.7900~0.8325、0.9601~0.9992、1.0000、1.0100~1.0498、1.0201~1.0700、1.0452~1.1050、1.1603~1.2247、1.2009~1.2671、1.2115~1.2798、1.3126~1.4050。
上述建立起来的标准指纹图谱可用于质量控制中的应用,如对银黄清肺制剂的质量或真伪鉴定,本发明的另一目的是提供使用该标准指纹图谱来检测银黄清肺制剂的检测方法,技术方案如下:
一种用高效液相色谱指纹图谱检测银黄清肺制剂的检测方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)供试品溶液的制备:
银黄清肺制剂为胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、滴丸:取银黄清肺制剂的内容物1-1.5g,精密加入甲醇30-50mL,精密称重后,回流提取或超声提取30-60min,冷却后用甲醇补足减失的重量,微孔滤膜滤过,取续滤液,即得;
银黄清肺制剂为口服液、合剂:取溶有银黄清肺制剂内容物5-10ml,精密加入甲醇30-50mL,精密称重后,回流提取或超声提取30-60min,冷却后用甲醇补足减失的重量,微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
(2)对照品溶液的制备:
取盐酸麻黄碱对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取五味子醇甲对照品适量,加甲醇制成每1mL含6mg的溶液,即得;
取苦杏仁苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取橙皮苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.4mg的溶液,即得;
取橙皮素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取靛玉红对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.1mg的溶液,即得;
取槲皮素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.01mg的溶液,即得;
取齐墩果酸对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.08mg的溶液,即得;
取贝母素甲对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.35mg的溶液,即得;
取贝母素乙对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.27mg的溶液,即得;
取五味子甲素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.18mg的溶液,即得;
取甘草苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取柚皮苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.25mg的溶液,即得。
取芦丁对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得。
(3)HPLC测定:分别吸取步骤(1)所得的供试品溶液、步骤(2)所得的对照品溶液,分别注入高效液相色谱仪中,记录色谱图,其色谱条件为:色谱柱为Inertsil ODS-2(4.6×250mm,5μm);柱温30℃;检测波长210nm;进样量10μL;流速1mL·min-1,流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B);梯度洗脱程序见表3:
表3 梯度洗脱程序表
(4)标准指纹图谱制定:测定10~20批的供试品指纹图谱,采用色谱指纹图谱相似度软件计算获得银黄清肺制剂指纹图谱;
(5)待测品溶液制备及待测品色谱图:取待测品,按步骤(1)方法制成待测品溶液,注入高效液相色谱仪,同步骤(3)HPLC测定,得到待测品色谱图;
(6)将待测品指纹图谱与步骤(4)制定的标准指纹图谱进行比较,计算相似度,识别所具有的共同吸收峰的数量,确定相似度。
发明人对指纹图谱的建立方法进行了色谱条件选择,精密度、稳定性,重复性等考察研究,以银黄清肺胶囊为例详述如下:
一、色谱条件选择
1、梯度洗脱条件的选择:
1.1 根据银黄清肺制剂各药味的主要有效成分性质,参考有关文献设定梯度洗脱表进行检测,梯度洗脱表见表4,其HPLC图谱见附图1。
表4 梯度洗脱表
由附图1可知,10~40min之间色谱峰多而密集,且基线漂移严重,故考虑调整梯度洗脱表。
1.2 根据1.1所用梯度洗脱条件所得的HPLC图谱显示结果,将梯度洗脱表进行调整,调整后的梯度洗脱表见表5,HPLC图谱见附图2。
表5 梯度洗脱表
由附图2可知,色谱峰分布良好,但个别峰分离度还是不够,还需再做调整。
1.3 根据1.2所用梯度洗脱条件所得HPLC图谱显示结果,将梯度洗脱表进行调整,见表6,HPLC图谱见附图3。
表6 梯度洗脱表
由附图3可知,其色谱峰分部情况良好,且100min以后无色谱峰出现,说明成分洗脱基本完全,故以该梯度洗脱条件为好。
2、供试品提取溶剂的选择
取银黄清肺胶囊成品内容物约1.2克,分别精密加入乙醇、50%甲醇、甲醇30ml,称重,超声处理30min,以相应溶剂补重,摇匀,滤过,取续滤液以微孔滤膜滤过,即得,对应为供试品1、2、3号。精密吸取供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,检测,结果见附图4、附图5、附图6。
由附图4、附图5、附图6可知,以供试品3的提取溶剂为好。故供试品溶液制备方法为:取银黄清肺胶囊内容物约1.2克,精密加入甲醇30ml,称重,超声处理30min,以甲醇补重,摇匀,滤过,取续滤液以微孔滤膜滤过,即得。
3、色谱柱的选择:
采用供试品3号的供试品溶液制备方法,分别使用Putulips bp C18色谱柱、依利特Hypersil BDS C18色谱柱、Inertsil ODS-2C18(4.6×250mm,5μm)色谱柱对样品进行测定,结果如附图7~9所示。由附图7-9可知,Inertsil ODS-2C18(4.6×250mm,5μm)色谱柱对成分的保留分离效果较好,因此选用Inertsil OSD-2C18(4.6×250mm,5μm)色谱柱。
4、检测波长的选择
通过DAD检测器对样品进行全波长检测,根据制剂主要成分吸收波长以及全波长检测结果,发现在210nm波长下图谱化学信息最为丰富,全波长检测3D效果图见附图10。
5、流动相的选择
采用上述梯度与供试品制备方法,分别使用甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%磷酸流动相体系对样品进行检测,结果如附图11-13.由附图11-13可知,乙腈-0.1%磷酸流动相体系基线平稳、各峰分布均匀、分离效果较好,因此选择乙腈-0.1%磷酸作为流动相。
6、柱温的选择
采用上述方法,分别使用柱温25℃、30℃、35℃对样品进行测定,结果如附图14-16.由附图14-16可知,柱温30℃时,各峰分布均匀,分离度较好,因此选择柱温为30℃。
7、方法学考察:
方法学考察中色谱条件为色谱柱为Inertil C18色谱柱(4.6*250mm,5μm),所述流速为1.0ml/min,所述柱温为30℃,所述检测波长为210nm,进样量为10μl,流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B),梯度洗脱程序见表7:
表7 梯度洗脱程序表
供试品的制备方法为:取银黄清肺胶囊内容物约1.2克,精密加入甲醇30ml,称重,超声处理30min,以甲醇补重,摇匀,滤过,取续滤液以微孔滤膜滤过,即得。
7.1 精密度试验:分别吸取同一供试品溶液10μl,按上述色谱条件连续进样6次,结果见表8~9。
表8 精密度相对保留时间考察结果
表9 精密度相对峰面积考察结果
结果表明,各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%,说明仪器精密度良好。
7.2 稳定性试验:取同一供试品溶液,分别在0、4、8、12、18、24h进样6次,每次10μl,结果见表10~11。
表10 稳定性相对保留时间考察结果
表11 稳定性相对峰面积考察结果
结果表明,各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD均小于3%,说明24h内供试品溶液稳定性较好。
7.3 重复性试验:取同一批样品(130102批)6份,同前法操作,吸取供试品溶液10μl,按优选的色谱条件进样分析,结果见表12~13。
表12 重复性相对保留时间考察结果
表13 重复性相对峰面积考察结果
银黄清肺制剂是由银杏叶、麻黄等为主要原料制成的制剂,临床上用于治疗清肺化痰、止咳平喘,现有主要质控指标是性状、薄层鉴别、盐酸麻黄碱的含量测定。作为一个中药复方制剂,如果仅用盐酸麻黄碱的含量和北葶苈子等几个药材的薄层鉴别来控制制剂的内在质量,具有很大的片面性,须对其物质群整体予以控制,但其现有质量标准及其它现有技术中尚无较好的质量控制方法来全面准确的控制产品质量,不能较好地保证其临床疗效。因此为了更全面有效的控制该产品的质量,非常有必要建立其指纹图谱进行质量控制。本发明是在大量实验基础上所得到的切实可行的方法,精密度高、稳定性和重复性好。本发明建立的银黄清肺制剂指纹图谱作为制剂的标准指纹图谱,将该图谱作为整体看待,注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系,注重整体面貌特征,既避免了因只测定少量化学成分而判定银黄清肺制剂整体质量的片面性,又减少了为质量达标而人为处理的可能性。本发明提供的测定方法可以作为银黄清肺制剂的质控方法,能够客观的反映产品内在成分的组成,较全面准确地控制了银黄清肺制剂的质量。
本发明的有益效果是:
(1)本发明指纹图谱建立方法对各供试品的前处理方法简单;
(2)本发明指纹图谱中特征性成分保留完整,具有28个共有峰,且指认了其中的14个特征峰,并进行了峰的归属分析,各特征峰分离效果较好,能较全面的反映出产品的质量信息;
(3)本发明方法可用于银黄清肺制剂同方不同剂型产品的指纹图谱建立和检测。
附图说明
附图1:1.1所用梯度洗脱条件所得HPLC色谱图
附图2:1.2所用梯度洗脱条件所得HPLC色谱图
附图3:1.3所用梯度洗脱条件所得HPLC色谱图
附图4:供试品1色谱图
附图5:供试品2色谱图
附图6:供试品3色谱图
附图7:Putulips bp C18色谱柱所得色谱图
附图8:依利特Hypersil BDS C18色谱柱所得色谱图
附图9:Inertsil ODS2C18色谱柱所得色谱图
附图10:DAD全波长检测3D效果图
附图11:甲醇-0.1%甲酸流动相色谱图
附图12:乙腈-0.1%甲酸流动相色谱图
附图13:乙腈-0.1%磷酸色谱图
附图14:25℃色谱图
附图15:30℃色谱图
附图16:35℃色谱图
附图17:实施例1中银黄清肺胶囊的HPLC标准指纹图谱
附图18:实施例1中10批银黄清肺胶囊的色谱图
附图19:实施例2中银黄清肺胶囊的HPLC标准指纹图谱
附图20:实施例2中10批银黄清肺胶囊的色谱图
附图21:实施例3中银黄清肺胶囊的HPLC标准指纹图谱
附图22:实施例3中10批银黄清肺胶囊的色谱图
附图23:实施例4中银黄清肺片的HPLC标准指纹图谱
附图24:实施例4中10批银黄清肺片的色谱图
具体实施方式
实施例1 银黄清肺胶囊指纹图谱的建立
(1)仪器与试药
岛津LC-10ATVP高效液相色谱仪,CLASS-VP 5.0色谱工作站;Inertil C18色谱柱。
(2)供试品溶液的制备
取130201批次银黄清肺胶囊内容物约1.2克,精密加入甲醇30ml,称重,超声处理30min,冷却后用甲醇补足减失的重量,微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
(3)对照品溶液的制备
取盐酸麻黄碱对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取五味子醇甲对照品适量,加甲醇制成每1mL含6mg的溶液,即得;
取苦杏仁苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取橙皮苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.4mg的溶液,即得;
取橙皮素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取靛玉红对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.1mg的溶液,即得;
取槲皮素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.01mg的溶液,即得。
取齐墩果酸对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.08mg的溶液,即得;
取贝母素甲对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.35mg的溶液,即得;
取贝母素乙对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.27mg的溶液,即得;
取五味子甲素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.18mg的溶液,即得;
取甘草苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取柚皮苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.25mg的溶液,即得;
取芦丁对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得。
(4)HPLC检测
色谱柱为Inertil C18色谱柱(4.6*250mm,5μm);柱温为30℃;检测波长为210nm;流动相A为乙腈,流动相B为0.1%磷酸溶液,进样量10μl,总流速为1.0ml/min;分析时间120分钟;
梯度运行表14如下:
表14
(5)方法学考察
①稳定性试验
取同一供试品溶液,在上述液相色谱条件下,分别在0、4、8、12、18、24小时进行检测,每次进样10μl,考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD<3%,表明供试品溶液24小时内较稳定。
②精密度试验
取同一份供试品溶液,在上述液相色谱条件下,重复进样6次,每次进样10μl,考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD<3%,表明仪器精密度良好。
③重复性试验
取同一批样品,按供试品制备方法制备6份供试品溶液,在上述液相色谱条件下,进样分析,考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD<3%,表明该方法重复性好。
(6)银黄清肺胶囊标准指纹图谱的制定。
分别取130202、130203、130204、130205、130301、130302、130303、130304、130305、130306共10批次的银黄清肺胶囊样品,同实施例1中(1)、(2)、(3)、(4)步骤方法,精密吸取对照品溶液和银黄清肺胶囊供试品溶液各10μl,分别注入高效液相色谱仪中,照高效液相色谱法测定,记录色谱图;依据所得的10批银黄清肺胶囊的指纹图谱,制定标准指纹图谱。见图17、18。
比较银黄清肺胶囊色谱图,确定28个峰为共有峰,其中3号峰为麻黄碱,8号峰为苦杏仁苷,13号峰为橙皮苷,14号峰为橙皮素,15号峰为柚皮苷,17号峰为芦丁,18号峰为靛玉红,19号峰为槲皮素,20号峰为齐墩果酸,21号峰为五味子醇甲;22号峰为甘草苷,24号峰为五味子甲素,26号峰为贝母素甲,27号峰为贝母素乙,依据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》,制定银黄清肺胶囊的标准指纹图谱。以21号峰为参照峰,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。
各峰的相对保留时间:0.0503、0.0650、0.1842、0.1928、0.2380、0.2427、0.3351、0.3372、0.3561、0.3899、0.4217、0.5015、0.5712、0.5812、0.6071、0.6233、0.6435、0.6822、0.8077、0.9859、1.0000、1.0289、1.0379、1.0723、1.2012、1.2323、1.2421、1.3579.
各峰的相对峰面积:2.9151、1.2122、1.0281、0.7636、0.3271、0.4625、0.7407、0.9859、0.3365、0.2752、0.3643、0.2281、0.3477、0.7326、3.8865、0.4213、2.7026、0.3013、0.3267、0.1611、1.0000、0.2013、0.2322、0.1819、1.7682、0.1338、0.4563、0.5152.
(7)共有峰的归属分析
表15 复方指纹图谱色谱峰的药物归属
NO | tR/min | 药材峰归属 | 对照品峰归属 |
1 | 3.425 | ||
2 | 4.427 | ||
3 | 12.546 | 麻黄 | 麻黄碱 |
4 | 13.132 | 麻黄 | |
5 | 16.210 | 北葶苈子 | |
6 | 16.532 | 北葶苈子 | |
7 | 22.824 | 枇杷叶 | |
8 | 22.967 | 苦杏仁 | 苦杏仁苷 |
9 | 24.254 | 甘草 | |
10 | 26.556 | 麻黄 | |
11 | 28.722 | 甘草 | |
12 | 34.157 | 枇杷叶 | |
13 | 38.904 | 枳实 | 橙皮苷 |
14 | 39.586 | 枳实 | 橙皮素 |
15 | 41.350 | 枳实 | 柚皮苷 |
16 | 42.453 | 甘草 | |
17 | 43.829 | 银杏叶 | 芦丁 |
18 | 46.465 | 大青叶 | 靛玉红 |
19 | 55.012 | 银杏叶 | 槲皮素 |
20 | 67.153 | 枇杷叶 | 齐墩果酸 |
21(S) | 68.110 | 五味子 | 五味子醇甲 |
22 | 70.078 | 甘草 | 甘草苷 |
23 | 70.691 | 银杏叶 | |
24 | 73.034 | 五味子 | 五味子甲素 |
25 | 81.813 | 五味子 | |
26 | 83.932 | 浙贝母 | 贝母素甲 |
27 | 84.599 | 浙贝母 | 贝母素乙 |
28 | 92.487 | 穿山龙 |
(8)相似度评价。
表16 10批银黄清肺胶囊HPLC指纹图谱相似度评价结果表
实施例2 银黄清肺胶囊指纹图谱的建立
(1)仪器与试药
岛津LC-10ATVP高效液相色谱仪,CLASS-VP 5.0色谱工作站;Inertil C18色谱柱。
(2)供试品溶液的制备
取130104批次银黄清肺胶囊内容物约1.5克,精密加入甲醇40ml,精密称重,回流提取30min,冷却后用甲醇补足减失的重量,微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
(3)对照品溶液的制备
取盐酸麻黄碱对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取五味子醇甲对照品适量,加甲醇制成每1mL含6mg的溶液,即得;
取苦杏仁苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取橙皮苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.4mg的溶液,即得;
取橙皮素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取靛玉红对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.1mg的溶液,即得;
取槲皮素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.01mg的溶液,即得。
取齐墩果酸对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.08mg的溶液,即得;
取贝母素甲对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.35mg的溶液,即得;
取贝母素乙对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.27mg的溶液,即得;
取五味子甲素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.18mg的溶液,即得;
取甘草苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取柚皮苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.25mg的溶液,即得;
取芦丁对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得。
(4)HPLC检测
色谱柱为Inertil C18色谱柱(4.6*250mm,5μm);柱温为25℃;检测波长为200nm;流动相A为乙腈,流动相B为0.1%磷酸溶液,进样量5μl,总流速为0.9ml/min;分析时间120分钟;
梯度运行表17如下
(5)方法学考察
①稳定性试验
取同一供试品溶液,在上述液相色谱条件下,分别在0、4、8、12、18、24小时进行检测,每次进样10μl,考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD<3%,表明供试品溶液24小时内较稳定。
②精密度试验
取同一份供试品溶液,在上述液相色谱条件下,重复进样6次,每次进样10μl,考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD<3%,表明仪器精密度良好。
③重复性试验
取同一批样品,按供试品制备方法制备6份供试品溶液,在上述液相色谱条件下,进样分析,考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD<3%,表明该方法重复性好。
(6)银黄清肺胶囊标准指纹图谱的制定。
分别取130207、130208、130209、130210、130212、130214、130405、130406、130408、130409共10批次的银黄清肺胶囊样品,同实施例2中(1)、(2)、(3)、(4)步骤方法,精密吸取对照品溶液和银黄清肺胶囊供试品溶液各10μl,分别注入高效液相色谱仪中,照高效液相色谱法测定,记录色谱图;依据所得的10批银黄清肺胶囊的指纹图谱,制定标准指纹图谱。见图19、20。
比较银黄清肺胶囊色谱图,确定28个峰为共有峰,其中3号峰为麻黄碱,8号峰为苦杏仁苷,13号峰为橙皮苷,14号峰为橙皮素,15号峰为柚皮苷,17号峰为芦丁,18号峰为靛玉红,19号峰为槲皮素,20号峰为齐墩果酸,21号峰为五味子醇甲;22号峰为甘草苷,24号峰为五味子甲素,26号峰为贝母素甲,27号峰为贝母素乙,依据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》,制定银黄清肺胶囊的标准指纹图谱。以21号峰为参照峰,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。
各峰的相对保留时间:0.0503、0.0651、0.1831、0.1927、0.2366、0.2417、0.3317、0.3335、0.3557、0.3897、0.4217、0.5016、0.5711、0.5798、0.6058、0.6217、0.6436、0.6813、0.8058、0.9870、1.0000、1.0298、1.0326、1.0732、1.2012、1.2337、1.2455、1.3532.
各峰的相对峰面积:2.9622、1.2215、1.0267、0.7678、0.3325、0.4633、0.7425、0.9829、0.3356、0.2736、0.3621、0.2283、0.3466、0.7335、3.8962、0.4217、2.7038、0.3033、0.3235、0.1615、1.0000、0.2015、0.2367、0.1815、1.7626、0.1326、0.4523、0.5152.
(7)共有峰的归属分析
表18 复方指纹图谱色谱峰的药物归属
NO | tR/min | 药材峰归属 | 对照品峰归属 |
1 | 3.430 | ||
2 | 4.439 | ||
3 | 12.487 | 麻黄 | 麻黄碱 |
4 | 13.142 | 麻黄 | |
5 | 16.136 | 北葶苈子 | |
6 | 16.483 | 北葶苈子 | |
7 | 22.621 | 枇杷叶 | |
8 | 22.744 | 苦杏仁 | 苦杏仁苷 |
9 | 24.258 | 甘草 | |
10 | 26.577 | 麻黄 | |
11 | 28.759 | 甘草 |
12 | 34.208 | 枇杷叶 | |
13 | 38.950 | 枳实 | 橙皮苷 |
14 | 39.538 | 枳实 | 橙皮素 |
15 | 41.314 | 枳实 | 柚皮苷 |
16 | 42.398 | 甘草 | |
17 | 43.892 | 银杏叶 | 芦丁 |
18 | 46.463 | 大青叶 | 靛玉红 |
19 | 54.954 | 银杏叶 | 槲皮素 |
20 | 67.312 | 枇杷叶 | 齐墩果酸 |
21(S) | 68.198 | 五味子 | 五味子醇甲 |
22 | 70.230 | 甘草 | 甘草苷 |
23 | 70.421 | 银杏叶 | |
24 | 73.190 | 五味子 | 五味子甲素 |
25 | 81.919 | 五味子 | |
26 | 84.136 | 浙贝母 | 贝母素甲 |
27 | 84.941 | 浙贝母 | 贝母素乙 |
28 | 92.286 | 穿山龙 |
(8)相似度评价。
表19 10批银黄清肺胶囊HPLC指纹图谱相似度评价结果表
实施例3 银黄清肺胶囊指纹图谱的建立
(1)仪器与试药
岛津LC-10ATVP高效液相色谱仪,CLASS-VP 5.0色谱工作站;Inertil C18色谱柱。
(2)供试品溶液的制备
取130216批次银黄清肺胶囊内容物约1克,精密加入甲醇50ml,称重,超声处理60min,冷却后用甲醇补足减失的重量,微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
(3)对照品溶液的制备
取盐酸麻黄碱对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取五味子醇甲对照品适量,加甲醇制成每1mL含6mg的溶液,即得;
取苦杏仁苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取橙皮苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.4mg的溶液,即得;
取橙皮素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取靛玉红对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.1mg的溶液,即得;
取槲皮素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.01mg的溶液,即得。
取齐墩果酸对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.08mg的溶液,即得;
取贝母素甲对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.35mg的溶液,即得;
取贝母素乙对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.27mg的溶液,即得;
取五味子甲素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.18mg的溶液,即得;
取甘草苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取柚皮苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.25mg的溶液,即得;
取芦丁对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得。
(4)HPLC检测
色谱柱为Inertil C18色谱柱(4.6*250mm,5μm);柱温为35℃;检测波长为230nm;流动相A为乙腈,流动相B为0.1%磷酸溶液,进样量15μl,总流速为0.8ml/min;分析时间120分钟;
梯度运行表20如下:
(5)方法学考察
①稳定性试验
取同一供试品溶液,在上述液相色谱条件下,分别在0、4、8、12、18、24小时进行检测,每次进样10μl,考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD<3%,表明供试品溶液24小时内较稳定。
②精密度试验
取同一份供试品溶液,在上述液相色谱条件下,重复进样6次,每次进样10μl,考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD<3%,表明仪器精密度良好。
③重复性试验
取同一批样品,按供试品制备方法制备6份供试品溶液,在上述液相色谱条件下,进样分析,考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD<3%,表明该方法重复性好。
(6)银黄清肺胶囊标准指纹图谱的制定。
分别取130308、130309、130310、130311、130315、130412、130413、130414、130502、130509共10批次的银黄清肺胶囊样品,同实施例3中(1)、(2)、(3)、(4)步骤方法,精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl,分别注入高效液相色谱仪中,照高效液相色谱法测定,记录色谱图;依据所得的10批银黄清肺胶囊的指纹图谱,制定标准指纹图谱。见图21、22。
比较银黄清肺胶囊色谱图,确定28个峰为共有峰,其中3号峰为麻黄碱,8号峰为苦杏仁苷,13号峰为橙皮苷,14号峰为橙皮素,15号峰为柚皮苷,17号峰为芦丁,18号峰为靛玉红,19号峰为槲皮素,20号峰为齐墩果酸,21号峰为五味子醇甲;22号峰为甘草苷,24号峰为五味子甲素,26号峰为贝母素甲,27号峰为贝母素乙,依据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》,制定银黄清肺胶囊的标准指纹图谱。以21号峰为参照峰,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。
各峰的相对保留时间:0.0506、0.0652、0.1837、0.1941、0.2371、0.2422、0.3325、0.3337、0.3592、0.3916、0.4219、0.5053、0.5732、0.5821、0.6081、0.6262、0.6429、0.6852、0.8096、0.9858、1.0000、1.0316、1.0425、1.0751、1.2039、1.2351、1.2442、1.3721.
各峰的相对峰面积:2.9431、1.2262、1.0215、0.7635、0.3281、0.4637、0.7382、0.9816、0.3325、0.2764、0.3556、0.2239、0.3482、0.7323、3.8827、0.4211、2.7153、0.3012、0.3203、0.1627、1.0000、0.2029、0.2322、0.1823、1.7737、0.1333、0.4581、0.5135.
(7)共有峰的归属分析
表21 复方指纹图谱色谱峰的药物归属
NO | tR/min | 药材峰归属 | 对照品峰归属 |
1 | 3.447 | ||
2 | 4.442 | ||
3 | 12.516 | 麻黄 | 麻黄碱 |
4 | 13.225 | 麻黄 | |
5 | 16.155 | 北葶苈子 | |
6 | 16.502 | 北葶苈子 | |
7 | 22.655 | 枇杷叶 | |
8 | 22.737 | 苦杏仁 | 苦杏仁苷 |
9 | 24.474 | 甘草 | |
10 | 26.682 | 麻黄 | |
11 | 28.746 | 甘草 | |
12 | 34.429 | 枇杷叶 | |
13 | 39.055 | 枳实 | 橙皮苷 |
14 | 39.661 | 枳实 | 橙皮素 |
15 | 41.433 | 枳实 | 柚皮苷 |
16 | 42.666 | 甘草 | |
17 | 43.804 | 银杏叶 | 芦丁 |
18 | 46.686 | 大青叶 | 靛玉红 |
19 | 55.162 | 银杏叶 | 槲皮素 |
20 | 67.167 | 枇杷叶 | 齐墩果酸 |
21(S) | 68.135 | 五味子 | 五味子醇甲 |
22 | 70.288 | 甘草 | 甘草苷 |
23 | 71.031 | 银杏叶 | |
24 | 73.252 | 五味子 | 五味子甲素 |
25 | 82.028 | 五味子 | |
26 | 84.154 | 浙贝母 | 贝母素甲 |
27 | 84.773 | 浙贝母 | 贝母素乙 |
28 | 93.487 | 穿山龙 |
(8)相似度评价。
表22 10批银黄清肺胶囊HPLC指纹图谱相似度评价结果表
实施例4 银黄清肺片指纹图谱的建立
(1)仪器与试药
岛津LC-10ATVP高效液相色谱仪,CLASS-VP 5.0色谱工作站;Inertil C18色谱柱。
(2)供试品溶液的制备
取130601批次银黄清肺片内容物约1.2克,精密加入甲醇40ml,称重,超声处理45min,冷却后用甲醇补足减失的重量,微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
(3)对照品溶液的制备
取盐酸麻黄碱对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取五味子醇甲对照品适量,加甲醇制成每1mL含6mg的溶液,即得;
取苦杏仁苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取橙皮苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.4mg的溶液,即得;
取橙皮素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取靛玉红对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.1mg的溶液,即得;
取槲皮素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.01mg的溶液,即得。
取齐墩果酸对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.08mg的溶液,即得;
取贝母素甲对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.35mg的溶液,即得;
取贝母素乙对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.27mg的溶液,即得;
取五味子甲素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.18mg的溶液,即得;
取甘草苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取柚皮苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.25mg的溶液,即得;
取芦丁对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得。
(4)HPLC检测
色谱柱为Inertil C18色谱柱(4.6*250mm,5μm);柱温为30℃;检测波长为210nm;流动相A为乙腈,流动相B为0.1%磷酸溶液,进样量25μl,总流速为1.0ml/min;分析时间120分钟;
梯度运行表23如下
(5)方法学考察
①稳定性试验
取同一供试品溶液,在上述液相色谱条件下,分别在0、4、8、12、18、24小时进行检测,每次进样10μl,考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD<3%,表明供试品溶液24小时内较稳定。
②精密度试验
取同一份供试品溶液,在上述液相色谱条件下,重复进样6次,每次进样10μl,考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD<3%,表明仪器精密度良好。
③重复性试验
取同一批样品,按供试品制备方法制备6份供试品溶液,在上述液相色谱条件下,进样分析,考察主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD<3%,表明该方法重复性好。
(6)银黄清肺片标准指纹图谱的制定。
分别取130504、130505、130506、130602、130603、130604、130605、130705、130706、130708共10批次的银黄清肺片样品,同实施例4中(1)、(2)、(3)、(4)步骤方法,精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各10μl,分别注入高效液相色谱仪中,照高效液相色谱法测定,记录色谱图;依据所得的10批银黄清肺片的指纹图谱,制定标准指纹图谱。见图23、24。
比较银黄清肺片色谱图,确定28个峰为共有峰,其中3号峰为麻黄碱,8号峰为苦杏仁苷,13号峰为橙皮苷,14号峰为橙皮素,15号峰为柚皮苷,17号峰为芦丁,18号峰为靛玉红,19号峰为槲皮素,20号峰为齐墩果酸,21号峰为五味子醇甲;22号峰为甘草苷,24号峰为五味子甲素,26号峰为贝母素甲,27号峰为贝母素乙,依据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》,制定银黄清肺片的标准指纹图谱。以21号峰为参照峰,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。
各峰的相对保留时间:0.0505、0.0653、0.1861、0.1939、0.2385、0.2431、0.3331、0.3342、0.3588、0.3958、0.4271、0.5025、0.5725、0.5836、0.6125、0.6301、0.6475、0.6821、0.8118、0.9861、1.0000、1.0318、1.0476、1.0739、1.2021、1.2368、1.2417、1.3735.
各峰的相对峰面积:2.9232、1.2165、1.0281、0.7637、0.3277、0.4626、0.7423、0.9835、0.3273、0.2758、0.3614、0.2286、0.3481、0.7336、3.8926、0.4216、2.7082、0.3023、0.3259、0.1621、1.0000、0.2011、0.2313、0.1815、1.7711、0.1355、0.4531、0.5156.
(7)共有峰的归属分析
表24 复方指纹图谱色谱峰的药物归属
NO | tR/min | 药材峰归属 | 对照品峰归属 |
1 | 3.446 | ||
2 | 4.456 | ||
3 | 12.699 | 麻黄 | 麻黄碱 |
4 | 13.231 | 麻黄 | |
5 | 16.274 | 北葶苈子 | |
6 | 16.588 | 北葶苈子 | |
7 | 22.729 | 枇杷叶 | |
8 | 22.804 | 苦杏仁 | 苦杏仁苷 |
9 | 24.483 | 甘草 | |
10 | 27.008 | 麻黄 | |
11 | 29.144 | 甘草 | |
12 | 34.289 | 枇杷叶 | |
13 | 39.065 | 枳实 | 橙皮苷 |
14 | 39.823 | 枳实 | 橙皮素 |
15 | 41.795 | 枳实 | 柚皮苷 |
16 | 42.996 | 甘草 | |
17 | 44.183 | 银杏叶 | 芦丁 |
18 | 46.543 | 大青叶 | 靛玉红 |
19 | 55.393 | 银杏叶 | 槲皮素 |
20 | 67.288 | 枇杷叶 | 齐墩果酸 |
21(S) | 68.236 | 五味子 | 五味子醇甲 |
22 | 70.406 | 甘草 | 甘草苷 |
23 | 71.484 | 银杏叶 |
24 | 73.278 | 五味子 | 五味子甲素 |
25 | 82.026 | 五味子 | |
26 | 84.394 | 浙贝母 | 贝母素甲 |
27 | 84.722 | 浙贝母 | 贝母素乙 |
28 | 93.918 | 穿山龙 |
(8)相似度评价。
表25 10批银黄清肺片HPLC指纹图谱相似度评价结果表
实施例5 银黄清肺胶囊指纹图谱的应用
以实施例1建立的标准指纹图谱来检测银黄清肺胶囊:
(1)待测品溶液制备及待测品色谱图:取130901、130907、130908、130805、130807共5个批次的银黄清肺胶囊待测品,同实施例1中(1)、(2)、(3)、(4)步骤方法,精密吸取对照品溶液和银黄清肺胶囊待测品溶液各10μl,分别注入高效液相色谱仪中,照高效液相色谱法测定,记录待测品色谱图;
(2)将待测品指纹图谱与实施例1步骤(6)制定的标准指纹图谱进行比较,计算相似度,识别所具有的共同吸收峰的数量,确定相似度。
检测结果:130901、130907、130908、130805、130807共5个批次的待测品色谱图中各色谱峰与实施例1所建立的标准指纹图谱各特征峰一致,相似度高于0.92,详见表26。
表26 相似度评价表
Claims (12)
1.一种银黄清肺制剂的标准指纹图谱的建立方法,其特征在于将银黄清肺制剂的供试品溶液经高效液相色谱法检测,记录色谱图,采用色谱指纹图谱相似度软件计算生成银黄清肺制剂指纹图谱,其色谱条件为:
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱,柱温25~35℃,检测器为DAD检测器,检测波长200~230nm,进样量为5~25μl,流速0.8~1mL·min-1,流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B),梯度洗脱程序见表1:
表1 梯度洗脱程序表
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的银黄清肺制剂的供试品溶液按如下方法制备:
银黄清肺制剂为胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、滴丸:取溶有银黄清肺制剂的内容物的甲醇溶液经回流提取或超声处理,冷却,微孔滤膜过滤,取续滤液,即得;
银黄清肺制剂为口服液、合剂:取溶有银黄清肺制剂的内容物的甲醇溶液经回流提取或超声处理,微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述的银黄清肺制剂的供试品溶液按如下方法制备:
银黄清肺制剂为胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、滴丸:取银黄清肺制剂的内容物1-1.5g,精密加入甲醇30-50mL,精密称重后,回流提取或超声提取30-60min,冷却后用甲醇补足减失的重量,微孔滤膜滤过,取续滤液,即得;
银黄清肺制剂为口服液、合剂:取溶有银黄清肺制剂内容物5-10ml,精密加入甲醇30-50mL,精密称重后,回流提取或超声提取30-60min,冷却后用甲醇补足减失的重量,微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,以盐酸麻黄碱、五味子醇甲、苦杏仁苷、橙皮苷、橙皮素、靛玉红、槲皮素、齐墩果酸、贝母素甲、贝母素乙、五味子甲素、甘草苷、柚皮苷、芦丁为对照品,对照品溶液按如下方法制备:
取盐酸麻黄碱对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取五味子醇甲对照品适量,加甲醇制成每1mL含6mg的溶液,即得;
取苦杏仁苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取橙皮苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.4mg的溶液,即得;
取橙皮素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取靛玉红对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.1mg的溶液,即得;
取槲皮素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.01mg的溶液,即得;
取齐墩果酸对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.08mg的溶液,即得;
取贝母素甲对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.35mg的溶液,即得;
取贝母素乙对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.27mg的溶液,即得;
取五味子甲素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.18mg的溶液,即得;
取甘草苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取柚皮苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.25mg的溶液,即得;
取芦丁对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法,其特征在于,所述色谱柱为Inertil C18色谱柱(4.6*250mm,5μm)。
6.根据权利要求1-4任一所述的方法,其特征在于,所述流速为1.0ml/min。
7.根据权利要求1-4任一所述的方法,其特征在于,所述柱温为30℃。
8.根据权利要求1-4任一所述的方法,其特征在于,所述检测波长为210nm。
9.根据权利要求1-4任一所述的方法,其特征在于,所述色谱柱为Inertil C18色谱柱(4.6*250mm,5μm),所述流速为1.0ml/min,所述柱温为30℃,所述检测波长为210nm,所述进样量为10μl。
10.根据权利要求1-4任一所述的方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)供试品溶液的制备:
银黄清肺制剂为胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、滴丸:取银黄清肺制剂的内容物1-1.5g,精密加入甲醇30-50mL,精密称重后,回流提取或超声提取30-60min,冷却后用甲醇补足减失的重量,微孔滤膜滤过,取续滤液,即得;
银黄清肺制剂为口服液、合剂:取溶有银黄清肺制剂内容物5-10ml,精密加入甲醇30-50mL,精密称重后,回流提取或超声提取30-60min,冷却后用甲醇补足减失的重量,微孔滤膜滤过,取续滤液,即得;
(2)对照品溶液的制备:
取盐酸麻黄碱对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取五味子醇甲对照品适量,加甲醇制成每1mL含6mg的溶液,即得;
取苦杏仁苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取橙皮苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.4mg的溶液,即得;
取橙皮素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取靛玉红对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.1mg的溶液,即得;
取槲皮素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.01mg的溶液,即得;
取齐墩果酸对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.08mg的溶液,即得;
取贝母素甲对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.35mg的溶液,即得;
取贝母素乙对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.27mg的溶液,即得;
取五味子甲素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.18mg的溶液,即得;
取甘草苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取柚皮苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.25mg的溶液,即得;
取芦丁对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
(3)HPLC测定:分别吸取步骤(1)所得的供试品溶液、步骤(2)所得的对照品溶液,分别注入高效液相色谱仪中,记录色谱图,其色谱条件为:色谱柱为Inertsil ODS-2(4.6×250mm,5μm);柱温30℃;检测波长210nm;进样量10μL;流速1mL·min-1,流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B);梯度洗脱程序见表2:
表2 梯度洗脱程序表
(4)标准指纹图谱制定:测定10~20批的供试品指纹图谱,采用色谱指纹图谱相似度软件计算获得银黄清肺制剂指纹图谱。
11.如权利要求10所述的方法,其特征在于当供试品银黄清肺制剂为银黄清肺胶囊时,所建立的标准指纹图谱具有28个特征峰,其中3号峰为麻黄碱,8号峰为苦杏仁苷,13号峰为橙皮苷,14号峰为橙皮素,15号峰为柚皮苷,17号峰为芦丁,18号峰为靛玉红,19号峰为槲皮素,20号峰为齐墩果酸,21号峰为五味子醇甲;22号峰为甘草苷,24号峰为五味子甲素,26号峰为贝母素甲,27号峰为贝母素乙,各峰的相对保留时间分别为:0.0490~0.0515、0.0635~0.0675、0.1800~0.1898、0.1900~0.1995、0.2315~0.2401、0.2404~0.2535、0.3250~0.3378、0.3300~0.3452、0.3460~0.3675、0.3805~0.4091、0.4112~0.4385、0.4911~0.5185、0.5606~0.5892、0.5697~0.5996、0.5955~0.6255、0.6099~0.6485、0.6300~0.6598、0.6670~0.6998、0.7900~0.8325、0.9601~0.9992、1.0000、1.0100~1.0498、1.0201~1.0700、1.0452~1.1050、1.1603~1.2247、1.2009~1.2671、1.2115~1.2798、1.3126~1.4050。
12.一种用高效液相色谱指纹图谱检测银黄清肺制剂的检测方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)供试品溶液的制备:
银黄清肺制剂为胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、滴丸:取银黄清肺制剂的内容物1-1.5g,精密加入甲醇30-50mL,精密称重后,回流提取或超声提取30-60min,冷却后用甲醇补足减失的重量,微孔滤膜滤过,取续滤液,即得;
银黄清肺制剂为口服液、合剂:取溶有银黄清肺制剂内容物5-10ml,精密加入甲醇30-50mL,精密称重后,回流提取或超声提取30-60min,冷却后用甲醇补足减失的重量,微孔滤膜滤过,取续滤液,即得;
(2)对照品溶液的制备:
取盐酸麻黄碱对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取五味子醇甲对照品适量,加甲醇制成每1mL含6mg的溶液,即得;
取苦杏仁苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取橙皮苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.4mg的溶液,即得;
取橙皮素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取靛玉红对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.1mg的溶液,即得;
取槲皮素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.01mg的溶液,即得;
取齐墩果酸对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.08mg的溶液,即得;
取贝母素甲对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.35mg的溶液,即得;
取贝母素乙对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.27mg的溶液,即得;
取五味子甲素对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.18mg的溶液,即得;
取甘草苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
取柚皮苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.25mg的溶液,即得;
取芦丁对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液,即得;
(3)HPLC测定:分别吸取步骤(1)所得的供试品溶液、步骤(2)所得的对照品溶液,分别注入高效液相色谱仪中,记录色谱图,其色谱条件为:色谱柱为Inertsil ODS-2(4.6×250mm,5μm);柱温30℃;检测波长210nm;进样量10μL;流速1mL·min-1,流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B);梯度洗脱程序见表3:
表3 梯度洗脱程序表
(4)标准指纹图谱制定:测定10~20批的供试品指纹图谱,采用色谱指纹图谱相似度软件计算获得银黄清肺制剂指纹图谱;
(5)待测品溶液制备及待测品色谱图:取待测品,按步骤(1)方法制成待测品溶液,注入高效液相色谱仪,同步骤(3)HPLC测定,得到待测品色谱图;
(6)将待测品指纹图谱与步骤(4)制定的标准指纹图谱进行比较,计算相似度,识别所具有的共同吸收峰的数量,确定相似度。
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GR01 | Patent grant | ||
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CP03 | Change of name, title or address |
Address after: No.283 Kangning Road, Liuyang economic and Technological Development Zone, Changsha City, Hunan Province Patentee after: Hunan Anbang Pharmaceutical Co., Ltd Address before: 410008 Hunan province Changsha Kaifu District, Furong Road No. 194 Patentee before: HUNAN ANBANG PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. |