CN117147738A - 一种醒脑再造丸中马兜铃酸ⅰ的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药领域，具体涉及一种醒脑再造丸中马兜铃酸Ⅰ的检测方法，包括以下步骤：采用高效液相色谱仪检测马兜铃酸Ⅰ的含量，色谱条件采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相A采用乙腈，流动相B采用0.01～1.0%的磷酸，采用梯度洗脱，流速为0.8～1.2ml/min，检测波长为310～330nm，分别吸取对照品溶液与供试品溶液各5～50μl，注入液相色谱仪，测定，本发明测定结果的准确性较高，稳定性较好。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种醒脑再造丸中马兜铃酸Ⅰ的检测方法。
背景技术
目前市面上生产的醒脑再造丸，在生产检验过程中发现，“马兜铃酸Ⅰ限量”供试品溶液的色谱图中杂质峰干扰较大，导致测定结果的准确性较差，进行流动相比例调整，仍然干扰测定，研究发现供试品溶液基线背景噪音过大，严重干扰测定，故对其测定方法进行优化改进，寻找出精度更高的马兜铃酸Ⅰ的检测方法，对醒脑再造丸中的马兜铃酸Ⅰ进行质量控制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种醒脑再造丸中马兜铃酸Ⅰ的检测方法，以解决以上的问题。
为达到以上目的，提供以下技术方案：
一种醒脑再造丸中马兜铃酸Ⅰ的检测方法，包括以下步骤：采用高效液相色谱仪检测马兜铃酸Ⅰ的含量，色谱条件采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相A采用乙腈，流动相B采用0.01～1.0%的磷酸，采用梯度洗脱，流速为0.8～1.2ml/min，检测波长为310～330nm，分别吸取对照品溶液与供试品溶液各5～50μl，注入液相色谱仪，测定。
优选地，所述供试品溶液经以下步骤制成：取醒脑再造丸适量，研碎，混匀，取1～10g称定，置索氏提取器中，加甲醇50～100ml提取2～8小时至近无色，提取液浓缩至2～20ml，加在中性氧化铝柱中，收集流出液，重新上柱，用甲醇25～100ml洗脱，弃去洗脱液，再用含0.5～5%甲酸的甲醇溶液25～150ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至1～10ml，转移至2～20ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。
优选地，所述中性氧化铝柱为100-300目，1～5g，内径为0.5～2cm，用甲醇湿法装柱。
优选地，所述梯度洗脱采用以下规定进行：
| 时间（分钟） | 流动相A（%） | 流动相B（%） |
| 0～10 | 30→34 | 70→66 |
| 10～18 | 34→35 | 66→65 |
| 18～25 | 35→42 | 65→58 |
| 25～55 | 42 | 58 |
| 55～56 | 42→95 | 58→5 |
| 56～65 | 95 | 5 |
| 65～66 | 95→30 | 5→70 |
| 66～75 | 30 | 70 |
。
优选地，所述对照品溶液为每毫升含马兜铃酸Ⅰ0.1～20μg的溶液，所述供试品为每毫升含醒脑再造丸0.05～5g的溶液，所述采用高效液相色谱仪检测马兜铃酸Ⅰ的含量时，分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。
优选地，所述供试品溶液经以下步骤制成：取醒脑再造丸适量，研碎，混匀，取2g称定，置索氏提取器中，加甲醇100ml提取4小时至近无色，提取液浓缩至10ml，加在200-300目、2g、内径为1cm、用甲醇湿法装柱的中性氧化铝柱中，收集流出液，重新上柱，用甲醇50ml洗脱，弃去洗脱液，再用含5%甲酸的甲醇溶液100ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至10ml，转移至20ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。
本发明的有益效果为：
1.本发明由于样品中马兜铃酸I的含量较低或不含有，为保证取样均匀，故取样量从原来的1g增加到2g，为减少样品杂质干扰，采用甲醇索氏回流提取，中性氧化铝柱进行样品的进一步纯化除杂质；原标准检测波长为260nm；在试验过程中发现马兜铃酸I在260nm下阴性样品溶液中对照品色谱附近杂质干扰较多，背景噪声较高；320nm下阴性样品溶液中对照品色谱附近杂质干扰较少，背景噪声较低，结合实验中马兜铃酸I的波长扫描结果，最终选择波峰320nm处进行检测,本发明测定结果的准确性较高，稳定性较好。
附图说明
图1为原方法对照品溶液色谱图；
图2为原方法供试品溶液色谱图；
图3为马兜铃酸I对照品紫外吸收图；
图4为优化后方法对照品溶液色谱图；
图5为优化后方法供试品溶液色谱图；
图6为优化后方法阴性样品溶液色谱图；
图7为马兜铃酸I对照品标准曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中结构示意图的技术方案进行清楚，完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1-7所示：
以我公司生产的醒脑再造丸为例测定，我公司生产的醒脑再造丸批准文号：国药准字Z20053469，规格：每100丸重5g（每1g相当于饮片0.69g），执行标准：《国家药品监督管理局标准：YBZ05122018》，【检查】马兜铃酸Ⅰ限量查方法如下：
按照高效液相色谱法（中国药典2020年版通则0512）测定：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：以乙腈为流动相A，以0.05%磷酸溶液为流动相B，按下表1中的规定进行梯度洗脱，检测波长为260mm；
表1：流动相梯度
| 时间（分钟） | 流动相A（%） | 流动相B（%） |
| 0～10 | 30→34 | 70→66 |
| 10～18 | 34→35 | 66→65 |
| 18～20 | 35→42 | 65→58 |
| 20～30 | 42 | 58 |
| 30～31 | 42→95 | 58→5 |
| 31～35 | 95 | 5 |
| 35～40 | 95→30 | 5→70 |
| 40～50 | 30 | 70 |
。
对照品溶液的制备：取马兜铃酸Ⅰ对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.15μg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取我公司生产的醒脑再造丸适量，研细，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理（功率500W，频率40Hz）40分种，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得；
本品供试品溶液色谱图中，不得检出马兜铃酸I（C17H11NO7）；
采用色谱柱：Agilent TC C18（5×4.6mm，5µm），结果见图1-图2；结论：原方法供试品溶液杂质太多，且基线噪声太高，需要进行方法的进一步优化；
由于样品中马兜铃酸I的含量较低或不含有，为保证取样均匀，故取样量从原来的1g增加到2g，为减少样品杂质干扰，采用甲醇索氏回流提取，中性氧化铝柱进行样品的进一步纯化除杂质，原标准检测波长为260nm，在试验过程中发现马兜铃酸I在260nm下阴性样品溶液中对照品色谱附近杂质干扰较多，背景噪声较高；320nm下阴性样品溶液中对照品色谱附近杂质干扰较少，背景噪声较低（见图3），结合实验中马兜铃酸I的波长扫描结果，最终选择波峰320nm处进行检测；
优化后的方法如下：
供试品溶液制备：取我公司生产的醒脑再造丸适量，研碎，混匀，取2.0g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇100ml提取至近无色（4小时），提取液浓缩至10ml，加在中性氧化铝柱中（200-300目，2g，内径为1cm，用甲醇湿法装柱），收集流出液，重新上柱，用甲醇50ml洗脱，弃去洗脱液，再用含5%甲酸的甲醇溶液100ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至10ml，转移至20ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；
阴性样品的制备：按处方药材比例，制备不含细辛的药材混合粉末加入相应比例的炼蜜混合均匀，烘干后粉碎，过100目筛；取2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，其他操作同供试品溶液制备方法相同，得阴性样品溶液；
对照品溶液的制备：取马兜铃酸I对照品，精密称定10.12mg，置100ml量瓶中，加甲醇70ml，振摇使其溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，再精密量取10ml，置100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度摇匀，即得；
色谱柱：Agilent TC C18（5×4.6mm，5µm），以乙腈为流动相A，0.05%磷酸为流动相B，按下表2中的规定进行梯度洗脱；检测波长为320nm；
表2：流动相梯度
| 时间（分钟） | 流动相A（%） | 流动相B（%） |
| 0～10 | 30→34 | 70→66 |
| 10～18 | 34→35 | 66→65 |
| 18～25 | 35→42 | 65→58 |
| 25～55 | 42 | 58 |
| 55～56 | 42→95 | 58→5 |
| 56～65 | 95 | 5 |
| 65～66 | 95→30 | 5→70 |
| 66～75 | 30 | 70 |
。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得，检测结果阴性无干扰，专属性良好，见图4-图6；
1、线性范围考察：
取马兜铃酸I对照品，精密称定10.12mg，置100ml量瓶中，加甲醇70ml，振摇使溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，再精密量取0.1ml、0.1ml、0.2ml、0.5ml、2.0ml、5.0ml、10.0ml，分别置50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度摇匀，即得系列浓度的对照品溶液；分别精密吸取10μl注入液相色谱仪，依法测定，结果见下表3，以对照品溶液浓度x（μg/ml）为横坐标，色谱峰面积y为纵坐标，绘制标准曲线，得图7；马兜铃酸I回归方程为：y=26.273x-0.240，r=0.9998，结果表明，马兜铃酸I浓度在0.10～20.06μg/ml范围内线性关系良好；
结论：线性关系满足要求；
表3线性关系考察结果
| 序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 浓度x（μg/ml） | 0.10 | 0.20 | 0.40 | 1.00 | 4.01 | 10.03 | 20.06 |
| 峰面积y | 1.872 | 4.542 | 9.197 | 21.432 | 113.817 | 262.445 | 525.674 |
。
2、回收率考察：
精密称定样品9份，每份2g，其中3份（添加浓度：0.0002%）分别精密加入马兜铃酸I对照品溶液100ml（浓度0.04μg/ml，配制方法：精密称定对照品10.12mg置100ml量瓶中，用甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀，再精密量取0.2ml置500ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀得），3份（添加浓度：0.0004%）分别精密加入马兜铃酸I对照品溶液100ml（浓度0.08μg/ml，配制方法：精密称定对照品10.12mg置100ml量瓶中，用甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀，再精密量取0.4ml置500ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀得），3份（添加浓度：0.001%）分别精密加入马兜铃酸I对照品溶液100ml（浓度0.2μg/ml，配制方法：精密称定对照品10.12mg置100ml量瓶中，用甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml置500ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀得），9份供试品均按标准的方法提取、纯化、测定，计算回收率；
根据《中国药典》2020年四部通则9101药品质量标准分析方法验证指导原则，样品中待测成分含量为0.001%，其回收率限度为80%～115%，样品中待测成分含量为0.0001%，其回收率限度为75%～120%，方法的回收率均符合标准要求，具体见下表4；
结论：本法测定马兜铃酸I的回收率良好；
表4：回收率试验结果
3、稳定性考察：
采用对照品溶液和回收率考察供试品溶液9，按正文拟定的色谱条件，每隔一定时间测定一次，共考察24小时，测定了6次，结果6次测定马兜铃酸I对照品溶液平均峰面积为239.33，RSD＝0.56％（n＝6）；供试品溶液马兜铃酸I平均峰面积为20.37，RSD＝1.79％（n＝6），详见下表5-6；
表5：马兜铃酸I对照品溶液稳定性试验结果
表6：供试品溶液马兜铃酸I稳定性试验结果
结果表明：对照品溶液和供试品溶液在24小时内均稳定；
4、重复性考察：
由于样品中未检出马兜铃酸I，故采用回收率6份样品的回收率结果进行方法的重复性评估（添加浓度：0.001%）：
精密称定样品6份，每份2g，分别精密加入马兜铃酸I对照品溶液100ml（浓度0.2μg/ml，配制方法：精密称定对照品10.12mg置100ml量瓶中，用甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml置500ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀得），6份供试品均按标准的方法提取、纯化、测定，计算回收率；6份样品回收率结果的相对标准偏差RSD为3.9%，小于《中国药典》四部通则9101分析方法验证指导原则规定6%，结果见下表7；
表7：重复性考察试验结果：
结果表明：方法重复性良好；
5、耐用性试验：
采用加样回收进行三个不同厂家色谱柱和不同柱温考察（添加浓度：0.001%），具体如下：
精密称定样品2g，精密加入马兜铃酸I对照品溶液100ml（浓度0.2μg/ml，配制方法同上），按标准的方法提取、净化、测定，以理论塔板数、分离度、回收率作为指标，结果见下表8；
表8：不同厂家色谱柱、不同柱温测定结果
结果表明：不同厂家色谱柱、不同柱温下，方法耐用性良好；
6、方法检出限和定量限：
精密称定样品2g，精密加入马兜铃酸I对照品溶液100ml（浓度0.02μg/ml），按标准的方法提取、净化、测定，以信噪比3为仪器检测限，精密称定样品2g，精密加入马兜铃酸I对照品溶液100ml（浓度0.04μg/ml），按标准的方法提取、净化、测定，以信噪比10为仪器检测限；结果见下表9；
表9：方法检出限和定量限
| 分析物在样品中的浓度单位 | 方法检出限 | 方法定量限 | 信噪比（S/N） |
| μg/kg | 0.001（μg/kg） | 0.002（μg/kg） | 4.5 |
| % | 0.0001（%） | 0.0002（%） | 9.6 |
。
Claims (6)
1.一种醒脑再造丸中马兜铃酸Ⅰ的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：采用高效液相色谱仪检测马兜铃酸Ⅰ的含量，色谱条件采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相A采用乙腈，流动相B采用0.01～1.0%的磷酸，采用梯度洗脱，流速为0.8～1.2ml/min，检测波长为310～330nm，分别吸取对照品溶液与供试品溶液各5～50μl，注入液相色谱仪，测定。
2.根据权利要求1所述的醒脑再造丸中马兜铃酸Ⅰ的检测方法，其特征在于：所述供试品溶液经以下步骤制成：取醒脑再造丸适量，研碎，混匀，取1～10g称定，置索氏提取器中，加甲醇50～100ml提取2～8小时至近无色，提取液浓缩至2～20ml，加在中性氧化铝柱中，收集流出液，重新上柱，用甲醇25～100ml洗脱，弃去洗脱液，再用含0.5～5%甲酸的甲醇溶液25～150ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至1～10ml，转移至2～20ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。
3.根据权利要求2所述的醒脑再造丸中马兜铃酸Ⅰ的检测方法，其特征在于：所述中性氧化铝柱为100-300目，1～5g，内径为0.5～2cm，用甲醇湿法装柱。
4.根据权利要求3所述的醒脑再造丸中马兜铃酸Ⅰ的检测方法，其特征在于：所述梯度洗脱采用以下规定进行：
。
5.根据权利要求4所述的醒脑再造丸中马兜铃酸Ⅰ的检测方法，其特征在于：所述对照品溶液为每毫升含马兜铃酸Ⅰ0.1～20μg的溶液，所述供试品为每毫升含醒脑再造丸0.05～5g的溶液，所述采用高效液相色谱仪检测马兜铃酸Ⅰ的含量时，分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。
6.根据权利要求5所述的醒脑再造丸中马兜铃酸Ⅰ的检测方法，其特征在于：所述供试品溶液经以下步骤制成：取醒脑再造丸适量，研碎，混匀，取2g称定，置索氏提取器中，加甲醇100ml提取4小时至近无色，提取液浓缩至10ml，加在200-300目、2g、内径为1cm、用甲醇湿法装柱的中性氧化铝柱中，收集流出液，重新上柱，用甲醇50ml洗脱，弃去洗脱液，再用含5%甲酸的甲醇溶液100ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至10ml，转移至20ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。
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