CN109541114B - 一种果蔬中复硝酚钠残留量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种果蔬中复硝酚钠残留量的检测方法。它包括以下具体步骤：(1)、标准曲线绘制；(2)、样品提取；(3)、净化；(4)、回收率测定；(5)、样品复硝酚钠含量测定；该果蔬中复硝酚钠残留量的检测方法，利用乙腈提取，提取液经氨基固相萃取柱净化后上机测定，操作简便。采用液相色谱串联质谱多反应监测模式，具有较高的选择性和灵敏度，可有效减少杂质干扰，具有较高的准确度和精密度，为下一步完善和补充居民的复硝酚钠膳食摄入量及风险数据，制定最大残留限量提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及痕量分析技术领域，具体涉及一种果蔬中复硝酚钠残留量的检测方法。
背景技术
复硝酚钠是一种植物生长调节剂，具有显著增产效果，在农业上应用广泛。目前国内无复硝酚钠残留量的标准检测方法，国标GB 2763-2016食品安全国家标准中也只规定了复硝酚钠在5种作物上的临时限量。近些年国家农产品质量安全风险评估显示：复硝酚钠在果蔬上使用频繁以及对眼睛有损害，已成为影响果蔬质量安全高敏风险因子，将列入重点监测和评估对象。目前，张书文等已报道水果中复硝酚钠残留量测定方法，该方法中采用甲醇做提取溶剂，提取3次后，无水硫酸钠除水，旋转蒸发仪除溶剂，操作繁琐，方法中邻硝基苯酚钠检出限为0.5mg/kg，5-硝基邻甲氧基苯酚钠和对硝基苯酚钠的检出限为0.01mg/kg，方法灵敏度和检出限达不到GB 2763食品安全国家标准要求的复硝酚钠最大残留临时限量0.1mg/kg的要求。
为跟踪评估复硝酚钠在国内居民中的膳食摄入水平及风险，制定复硝酚钠在农产品中的正式限量值，需以建立果蔬中复硝酚钠简便、快速、灵敏度高的残留分析方法为前提。而本发明则提供了这样的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于解决现有农业领域中复硝酚钠残留量标准检测方法空白，居民的复硝酚钠膳食摄入量及风险数据不完整，复硝酚钠在农产品品上的最大残留限量值无正式规定的不足，提供一种快速、简便、准确的果蔬中复硝酚钠残留量的检测方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种果蔬中复硝酚钠残留量的检测方法，特殊之处在于，包括以下具体步骤：
(1)、标准曲线绘制
称取复硝酚钠三种有效成分标准品邻硝基苯酚钠、对硝基苯酚钠和5-硝基邻甲氧基苯酚钠，并用乙腈稀释，得到10mg/L复硝酚钠溶液，用乙腈稀释10mg/L复硝酚钠溶液，得到0.001mg/L—1.0mg/L一系列复硝酚钠标准溶液，进行液相色谱串联质谱分析检测，线性相关性良好；
以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归，得到邻硝基苯酚钠、对硝基苯酚钠、5-硝基邻甲氧基苯酚钠3种复硝酚钠有效成分标准曲线；
(2)、样品提取
称取经破壁机匀浆后的待测样品，加入乙腈，涡旋操作，后用滤纸过滤，滤液收集到装有氯化钠的塞量筒中，盖上塞子，剧烈震荡1min，室温静置，使乙腈相和水相分层；
(3)、净化
从具塞量筒中吸取10.0mL乙腈溶液，放入烧杯中，将烧杯放在80℃水浴锅上加热，并缓慢通入氮气流，蒸发近干，加入2.0mL的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂，待净化。
将氨基柱用4.0mL的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂预洗，当溶剂液面到达柱吸附层表面时，加入上述待净化液，用3mL的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂洗脱，并重复一次，用离心管收集洗脱液。将离心管放在氮吹仪上，以不超过50℃的温度氮吹蒸发至近干，加入1.0mL甲醇混匀，过0.2μm滤膜，待测。
(4)、回收率测定
称取经破壁机匀浆后的空白样品，分别按0.005mg/kg、0.05mg/kg和0.1mg/kg添加量向空白样品中加入复硝酚钠标准溶液，重复步骤(2)和步骤(3)，进行液相色谱串联质谱分析，与步骤(1)复硝酚钠标准曲线比较，计算，得出复硝酚钠测定值，并计算回收率。
(5)、样品复硝酚钠含量测定
将步骤(3)中检测所得复硝酚钠含量与步骤(1)中复硝酚钠标准曲线比较、计算，得到待测样品中实际的复硝酚钠含量。
优选的，所述步骤(1)中，线性相关性良好具体浓度范围是：邻硝基苯酚钠在0.05mg/L-1.0mg/L之间线性良好，对硝基苯酚钠在0.001mg/L-0.5mg/L之间线性良好，5-硝基邻甲氧基苯酚钠在0.001mg/L-0.5mg/L之间线性良好；
进一步的，所述步骤(1)中，复硝酚钠3种有效成分标准曲线分别为：邻硝基苯酚钠y＝215174X+267.2，相关系数r2＝0.9999；对硝基苯酚钠y＝25365200X+121364，相关系数r2＝0.9999；5-硝基邻甲氧基苯酚钠y＝15015900X-45463.6，相关系数r2＝0.9998；
优选的，所述步骤(2)中，称取待测样品质量为20.0g，加入乙腈为40mL，氯化钠的加入量为5-7g。
优选的，所述步骤(3)中，二氯甲烷和甲醇的混合溶剂的体积比为二氯甲醇：甲醇＝95:5。
较好的，所述步骤(1)、(4)中，液相色谱条件为色谱柱：shim-pack XR-ODS 2.0×75mm×1.6μm；柱温40℃；流动相A：2mmol/L甲酸铵或乙酸铵或碳酸铵或氨水，流动相B：甲醇；流动性梯度为1.0min 10％B，6.0min 50％B，9.0min70％B，10.0min95％B，13.0min95％B，13.5min10％B；流速为0.4mL/min；进样量1μL；
质谱条件为负离子点喷雾电离模式；DL管温度250℃；加热模块温度400℃；干燥气流速15L/min，碰撞气压力230kPa；扫描方式为多反应监测；
邻硝基苯酚钠定量离子对：138.2/156.1；定性离子对：138.2/46.0；对硝基苯酚钠定量离子对：138.2/156.1定性离子对：138.2/46.0；5-硝基邻甲氧基苯酚钠定量离子对：168.2/153.0；定性离子对：168.2/123.0。
本发明的果蔬中复硝酚钠残留量的检测方法，采用乙腈一次提取操作，盐析后，乙腈和水分层，操作简便快速，方法中邻硝基苯酚钠检出限为0.01mg/kg，5-硝基邻甲氧基苯酚钠和对硝基苯酚钠的检出限为0.001mg/kg，灵敏度远高于张书文等已报道的方法，完全能满足GB 2763食品安全国家标准和风险评估要求。
附图说明
图1：本发明实施例中样品添加0.1mg/kg复硝酚钠标准溶液的高效液相色谱串联质谱MRM色谱图。
具体实施方式
以下参照附图，给出本发明的具体实施方式，用来对本发明的检测方法进行进一步说明。
实施例1
1、主要仪器设备和材料
岛津LC/MS 8040；德国IKA T25高速匀浆机；国华SK-1快速混匀器；HX-PB965奥克斯破壁营养料理机；赛多利斯BL610电子分析天平；默克Milli-Q超纯水系统。
甲醇、丙酮、乙酸铵、甲酸均为色谱纯。
2、测定方法
(1)、标准曲线绘制
称取复硝酚钠三种有效成分标准品(邻硝基苯酚钠、对硝基苯酚钠、5-硝基邻甲氧基苯酚钠)并用乙腈稀释，得到10mg/L复硝酚钠溶液，用乙腈稀释10mg/L复硝酚钠溶液，得到0.001mg/L—1.0mg/L一系列复硝酚钠标准溶液，进行液相色谱串联质谱分析检测。邻硝基苯酚钠浓度点为：0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L；对硝基苯酚钠浓度点为：0.001mg/L、0.005mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L；5-硝基邻甲氧基苯酚钠浓度点为：0.001mg/L、0.005mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L；
以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归，得到复硝酚钠3种有效成分标准曲线分别为：邻硝基苯酚钠y＝215174X+267.2，相关系数r2＝0.9999；对硝基苯酚钠y＝25365200X+121364，相关系数r2＝0.9999；5-硝基邻甲氧基苯酚钠y＝15015900X-45463.6，相关系数r2＝0.9998；
(2)、样品提取
称取20.0g经破壁机匀浆后的大樱桃样品，加入20ml乙腈，涡旋匀浆1min，后用滤纸过滤，滤液收集到装有6g氯化钠的100mL具塞量筒中，盖上塞子，剧烈震荡1min，室温下静置30min，使乙腈相和水相分层；
(3)、净化
从具塞量筒中吸取10.0mL乙腈溶液，放入100mL烧杯中，将烧杯放在80℃水浴锅上加热，并缓慢通入氮气流，蒸发近干，加入2.0mL的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(二氯甲烷：甲醇＝95:5)，待净化。
将氨基柱用4.0mL的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(二氯甲烷：甲醇＝95:5)预洗，当溶剂液面到达柱吸附层表面时，加入上述待净化液，用3mL的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(二氯甲烷：甲醇＝95:5)洗脱，并重复一次，用20mL离心管收集洗脱液。将离心管在氮吹仪上，在低于50℃的温度条件下，氮吹蒸发至近干，加入1.0mL甲醇。在混合器上混匀后，过0.2μm滤膜，待测。
(4)、回收率测定
称取15份20.0g经破壁机匀浆后的大樱桃空白样品，分别按0.005mg/kg、0.05mg/kg和0.1mg/kg三个复硝酚钠添加浓度，重复步骤(2)和步骤(3)，每个添加浓度重复5次，进行液相色谱串联质谱分析，得到复硝酚钠测定值，并计算回收率，数据见表1。
(5)、样品复硝酚钠含量测定
将步骤(3)中检测所得复硝酚钠含量与步骤(1)复硝酚钠标准曲线比较、计算，得到待测样品中实际残留的复硝酚钠含量。
其中，液相色谱串联质谱仪器条件设定如下：
液相色谱条件：色谱柱：shim-pack XR-ODS 2.0×75mm×1.6μm；柱温40℃；流动相A：2mmol/L乙酸铵，流动相B：甲醇；流动性梯度为1.0min 10％B，6.0min 50％B，9.0min70％B，10.0min95％B，13.0min 95％B，13.5min10％B；流速为0.4mL/min；进样量1μL；
质谱条件为负离子点喷雾电离模式；DL管温度250℃；加热模块温度400℃；干燥气流速15L/min，碰撞气压力230kPa；扫描方式为多反应监测；
邻硝基苯酚钠定量离子对：138.2/156.1；定性离子对：138.2/46.0；对硝基苯酚钠定量离子对：138.2/156.1；定性离子对：138.2/46.0；5-硝基邻甲氧基苯酚钠定量离子对：168.2/153.0；定性离子对：168.2/123.0。
表1复硝酚钠的回收率和精密度
按照以上检测步骤对潍坊市的随机20个樱桃样品(设施栽培)进行复硝酚钠残留量检测分析，有20个样品检出复硝酚钠残留，残留量为0.01mg/kg-0.2mg/kg。
实施例2
1、主要仪器设备和材料
岛津LC/MS 8040；德国IKA T25高速匀浆机；国华SK-1快速混匀器；HX-PB965奥克斯破壁营养料理机；赛多利斯BL610电子分析天平；默克Milli-Q超纯水系统。
甲醇、丙酮、甲酸铵、甲酸均为色谱纯。
2、测定方法
(1)标准曲线绘制(同实施例1)
(2)样品提取
称取20.0g经破壁机匀浆后的葡萄样品，加入20ml乙腈，涡旋匀浆1min，后用滤纸过滤，滤液收集到装有6g氯化钠的100mL具塞量筒中，盖上塞子，剧烈震荡1min，室温下静置30min，使乙腈相和水相分层；
(3)、净化
从具塞量筒中吸取10.0mL乙腈溶液，放入100mL烧杯中，将烧杯放在80℃水浴锅上加热，并缓慢通入氮气流，蒸发近干，加入2.0mL的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(二氯甲烷：甲醇＝95:5)，待净化。
将氨基柱用4.0mL的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(二氯甲烷：甲醇＝95:5)预洗，当溶剂液面到达柱吸附层表面时，加入上述待净化液，用3mL的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(二氯甲烷：甲醇＝95:5)洗脱，并重复一次，用20mL离心管收集洗脱液。将离心管在氮吹仪上，45℃氮吹蒸发至近干，加入1.0mL甲醇。在混合器上混匀后，过0.2μm滤膜，待测。
(4)、回收率测定
称取15份20.0g经破壁机匀浆后的葡萄空白样品，分别按0.005mg/kg、0.05mg/kg和0.1mg/kg三个复硝酚钠添加浓度，重复步骤(2)和步骤(3)，每个添加浓度重复5次，进行液相色谱串联质谱分析，得到复硝酚钠测定值，并计算回收率，数据见表2。
(5)、样品复硝酚钠含量测定
将步骤(3)中检测所得复硝酚钠含量与步骤(1)复硝酚钠标准曲线比较、计算，得到待测样品中实际残留的复硝酚钠含量。
其中，液相色谱串联质谱仪器条件设定如下：
液相色谱条件：色谱柱：shim-pack XR-ODS 2.0×75mm×1.6μm；柱温40℃；流动相A：2mmol/L甲酸铵，流动相B：甲醇；流动性梯度为1.0min 10％B，6.0min 50％B，9.0min70％B，10.0min95％B，13.0min 95％B，13.5min10％B；流速为0.4mL/min；进样量1μL；
质谱条件为负离子点喷雾电离模式；DL管温度250℃；加热模块温度400℃；干燥气流速15L/min，碰撞气压力230kPa；扫描方式为多反应监测；
邻硝基苯酚钠定量离子对：138.2/156.1；定性离子对：138.2/46.0；对硝基苯酚钠定量离子对：138.2/156.1；定性离子对：138.2/46.0；5-硝基邻甲氧基苯酚钠定量离子对：168.2/153.0；定性离子对：168.2/123.0。
表2复硝酚钠的回收率和精密度
按照以上检测步骤对烟台20个随机葡萄样品进行复硝酚钠残留量检测分析，有10个样品检出复硝酚钠残留，残留量为0.01mg/kg-0.15mg/kg。
实施例3
1、主要仪器设备和材料
岛津LC/MS 8040；德国IKA T25高速匀浆机；国华SK-1快速混匀器；HX-PB965奥克斯破壁营养料理机；赛多利斯BL610电子分析天平；默克Milli-Q超纯水系统。
甲醇、丙酮、碳酸铵、甲酸均为色谱纯。
2、测定方法
(1)标准曲线绘制(同实施例1)
(2)样品提取
称取25.0g经破壁机匀浆后的蓝莓样品，加入25ml乙腈，涡旋匀浆1min，后用滤纸过滤，滤液收集到装有5g氯化钠的100mL具塞量筒中，盖上塞子，剧烈震荡1min，室温下静置30min，使乙腈相和水相分层；
(3)、净化
从具塞量筒中吸取10.0mL乙腈溶液，放入100mL烧杯中，将烧杯放在80℃水浴锅上加热，并缓慢通入氮气流，蒸发近干，加入2.0mL的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(二氯甲烷：甲醇＝95:5)，待净化。
将氨基柱用4.0mL的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(二氯甲烷：甲醇＝95:5)预洗，当溶剂液面到达柱吸附层表面时，加入上述待净化液，用3mL的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(二氯甲烷：甲醇＝95:5)洗脱，并重复一次，用20mL离心管收集洗脱液。将离心管在氮吹仪上，50℃氮吹蒸发至近干，加入1.0mL甲醇。在混合器上混匀后，过0.2μm滤膜，待测。
(4)、回收率测定
称取15份25.0g经破壁机匀浆后的蓝莓空白样品，分别按0.005mg/kg、0.05mg/kg和0.1mg/kg三个复硝酚钠添加浓度，重复步骤(2)和步骤(3)，每个添加浓度重复5次，进行液相色谱串联质谱分析，得到复硝酚钠测定值，并计算回收率，数据见表3。
(5)、样品复硝酚钠含量测定
将步骤(3)中检测所得复硝酚钠含量与步骤(1)复硝酚钠标准曲线比较、计算，得到待测样品中实际残留的复硝酚钠含量。
其中，液相色谱串联质谱仪器条件设定如下：
液相色谱条件：色谱柱：shim-pack XR-ODS 2.0×75mm×1.6μm；柱温40℃；流动相A：2mmol/L碳酸铵，流动相B：甲醇；流动性梯度为1.0min 10％B，6.0min 50％B，9.0min70％B，10.0min95％B，13.0min 95％B，13.5min10％B；流速为0.4mL/min；进样量1μL；
质谱条件为负离子点喷雾电离模式；DL管温度250℃；加热模块温度400℃；干燥气流速15L/min，碰撞气压力230kPa；扫描方式为多反应监测；
邻硝基苯酚钠定量离子对：138.2/156.1；定性离子对：138.2/46.0；对硝基苯酚钠定量离子对：138.2/156.1；定性离子对：138.2/46.0；5-硝基邻甲氧基苯酚钠定量离子对：168.2/153.0；定性离子对：168.2/123.0。
表3复硝酚钠的回收率和精密度
按照以上检测步骤对威海的20个随机蓝莓样品进行复硝酚钠残留量检测分析，有4样品检出复硝酚钠残留，残留量为0.02mg/kg-0.05mg/kg。
实施例4
1、主要仪器设备和材料
岛津LC/MS 8040；德国IKA T25高速匀浆机；国华SK-1快速混匀器；HX-PB965奥克斯破壁营养料理机；赛多利斯BL610电子分析天平；默克Milli-Q超纯水系统。
甲醇、丙酮、氨水、甲酸均为色谱纯。
2、测定方法
(1)、标准曲线绘制(同实施例1)
(2)、样品提取
称取30.0g经破壁机匀浆后的番茄样品，加入30ml乙腈，涡旋匀浆1min，后用滤纸过滤，滤液收集到装有7g氯化钠的100mL具塞量筒中，盖上塞子，剧烈震荡1min，室温下静置30min，使乙腈相和水相分层；
(3)、净化
从具塞量筒中吸取10.0mL乙腈溶液，放入100mL烧杯中，将烧杯放在80℃水浴锅上加热，并缓慢通入氮气流，蒸发近干，加入2.0mL的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(二氯甲烷：甲醇＝95:5)，待净化。
将氨基柱用4.0mL的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(二氯甲烷：甲醇＝95:5)预洗，当溶剂液面到达柱吸附层表面时，加入上述待净化液，用3mL的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(二氯甲烷：甲醇＝95:5)洗脱，并重复一次，用20mL离心管收集洗脱液。将离心管在氮吹仪上，50℃，氮吹蒸发至近干，加入1.0mL甲醇。在混合器上混匀后，过0.2μm滤膜，待测。
(4)、回收率测定
称取15份30.0g经破壁机匀浆后的番茄空白样品，分别按0.005mg/kg、0.05mg/kg和0.1mg/kg三个复硝酚钠添加浓度，重复步骤(2)和步骤(3)，每个添加浓度重复5次，进行液相色谱串联质谱分析，得到复硝酚钠测定值，并计算回收率，数据见表3。
(5)、样品复硝酚钠含量测定
将步骤(3)中检测所得复硝酚钠含量与步骤(1)复硝酚钠标准曲线比较、计算，得到待测样品中实际残留的复硝酚钠含量。
其中，液相色谱串联质谱仪器条件设定如下：
液相色谱条件：色谱柱：shim-pack XR-ODS 2.0×75mm×1.6μm；柱温40℃；流动相A：2mmol/L氨水，流动相B：甲醇；流动性梯度为1.0min 10％B，6.0min 50％B，9.0min70％B，10.0min95％B，13.0min 95％B，13.5min10％B；流速为0.4mL/min；进样量1μL；
质谱条件为负离子点喷雾电离模式；DL管温度250℃；加热模块温度400℃；干燥气流速15L/min，碰撞气压力230kPa；扫描方式为多反应监测；
邻硝基苯酚钠定量离子对：138.2/156.1；定性离子对：138.2/46.0；对硝基苯酚钠定量离子对：138.2/156.1；定性离子对：138.2/46.0；5-硝基邻甲氧基苯酚钠定量离子对：168.2/153.0；定性离子对：168.2/123.0。
表3复硝酚钠的回收率和精密度
按照以上检测步骤对威海的20个随机番茄样品进行复硝酚钠残留量检测分析，有5样品检出复硝酚钠残留，残留量为0.01mg/kg-0.03mg/kg。
实施例5
1、主要仪器设备(同实施例1)
2、测定方法
(1)、标准曲线绘制(同实施例1)
(2)、样品提取
称取20.0g经破壁机匀浆后的黄瓜样品，加入20ml乙腈，涡旋匀浆1min，后用滤纸过滤，滤液收集到装有7g氯化钠的100mL具塞量筒中，盖上塞子，剧烈震荡1min，室温下静置30min，使乙腈相和水相分层；
(3)、净化
从具塞量筒中吸取10.0mL乙腈溶液，放入100mL烧杯中，将烧杯放在80℃水浴锅上加热，并缓慢通入氮气流，蒸发近干，加入2.0mL的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(二氯甲烷：甲醇＝95:5)，待净化。
将氨基柱用4.0mL的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(二氯甲烷：甲醇＝95:5)预洗，当溶剂液面到达柱吸附层表面时，加入上述待净化液，用3mL的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(二氯甲烷：甲醇＝95:5)洗脱，并重复一次，用20mL离心管收集洗脱液。将离心管在氮吹仪上，40℃氮吹蒸发至近干，加入1.0mL甲醇。在混合器上混匀后，过0.2μm滤膜，待测。
(4)、回收率测定
称取15份30.0g经破壁机匀浆后的黄瓜空白样品，分别按0.005mg/kg、0.05mg/kg和0.1mg/kg三个复硝酚钠添加浓度，重复步骤(2)和步骤(3)，每个添加浓度重复5次，进行液相色谱串联质谱分析，得到复硝酚钠测定值，并计算回收率，数据见表3。
(5)、样品复硝酚钠含量测定
将步骤(3)中检测所得复硝酚钠含量与步骤(1)复硝酚钠标准曲线比较、计算，得到待测样品中实际残留的复硝酚钠含量。
其中，液相色谱串联质谱仪器条件同实施例1。
表3复硝酚钠的回收率和精密度
按照以上检测步骤对烟台的20个随机黄瓜样品进行复硝酚钠残留量检测分析，未检出复硝酚钠残留。
实施例6
1、主要仪器设备(同实施例2)
2、测定方法
(1)、标准曲线绘制(同实施例1)
(2)、样品提取
称取30.0g经破壁机匀浆后的芹菜样品，加入30ml乙腈，涡旋匀浆1min，后用滤纸过滤，滤液收集到装有7g氯化钠的100mL具塞量筒中，盖上塞子，剧烈震荡1min，室温下静置30min，使乙腈相和水相分层；
(3)、净化
从具塞量筒中吸取10.0mL乙腈溶液，放入100mL烧杯中，将烧杯放在80℃水浴锅上加热，并缓慢通入氮气流，蒸发近干，加入2.0mL的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(二氯甲烷：甲醇＝95:5)，待净化。
将氨基柱用4.0mL的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(二氯甲烷：甲醇＝95:5)预洗，当溶剂液面到达柱吸附层表面时，加入上述待净化液，用3mL的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(二氯甲烷：甲醇＝95:5)洗脱，并重复一次，用20mL离心管收集洗脱液。将离心管在氮吹仪上，50℃，氮吹蒸发至近干，加入1.0mL甲醇。在混合器上混匀后，过0.2μm滤膜，待测。
(4)、回收率测定
称取15份30.0g经破壁机匀浆后的芹菜空白样品，分别按0.005mg/kg、0.05mg/kg和0.1mg/kg三个复硝酚钠添加浓度，重复步骤(2)和步骤(3)，每个添加浓度重复5次，进行液相色谱串联质谱分析，得到复硝酚钠测定值，并计算回收率，数据见表3。
(5)、样品复硝酚钠含量测定
将步骤(3)中检测所得复硝酚钠含量与步骤(1)复硝酚钠标准曲线比较、计算，得到待测样品中实际残留的复硝酚钠含量。
其中，液相色谱串联质谱仪器条件同实施例2。
表3复硝酚钠的回收率和精密度
按照以上检测步骤对烟台的20个随机芹菜样品进行复硝酚钠残留量检测分析，有4样品检出复硝酚钠残留，残留量为0.02mg/kg-0.05mg/kg。
本发明利用乙腈提取，氨基固相萃取柱净化，试验操作简便。采用液相色谱串联质谱多反应监测模式，具有较高的选择性和灵敏度，可有效减少杂质干扰，具有较高的准确度和精密度，为下一步完善和补充居民的复硝酚钠膳食摄入量及风险数据，制定最大残留限量提供技术支撑。
以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变形，这些简单变形均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (5)
1.一种果蔬中复硝酚钠残留量的检测方法，其特征在于包括以下具体步骤：
（1）、标准曲线绘制
称取复硝酚钠三种有效成分标准品邻硝基苯酚钠、对硝基苯酚钠、5-硝基邻甲氧基苯酚钠并用乙腈稀释，得到10 mg/L复硝酚钠溶液，用乙腈稀释10 mg/L 复硝酚钠溶液，得到0.001mg/L—1.0mg/L一系列复硝酚钠标准溶液，进行液相色谱串联质谱分析检测，线性相关性良好；
以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归，得到邻硝基苯酚钠、对硝基苯酚钠、5-硝基邻甲氧基苯酚钠3种复硝酚钠有效成分标准曲线；
（2）、样品提取
称取经破壁机匀浆后的待测样品，加入乙腈，涡旋操作，后用滤纸过滤，滤液收集到装有氯化钠的具塞量筒中，盖上塞子，剧烈震荡后室温静置使乙腈相和水相分层；
（3）、净化
从具塞量筒中吸取10.0 mL乙腈溶液，放入烧杯中，将烧杯放在80℃水浴锅上加热，并缓慢通入氮气流，蒸发近干，加入2.0 mL的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂，待净化；
将氨基柱用4.0 mL的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂预洗，当溶剂液面到达柱吸附层表面时，加入待净化液，用3 mL的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂洗脱，并重复一次，离心管收集洗脱液；将离心管在氮吹仪上，40-50℃氮吹蒸发至近干，加入 1.0 mL甲醇；在混合器上混匀后，过0.2 μm滤膜，待测；
（4）、回收率测定
称取经破壁机匀浆后的空白样品，分别按0.005 mg/kg、0.05mg/kg和0.1 mg/kg添加量加入复硝酚钠标准溶液，重复步骤（2）和步骤（3），进行液相色谱串联质谱分析，与步骤（1）复硝酚钠标准曲线比较，计算，得出复硝酚钠测定值，并计算回收率；
（5）、样品复硝酚钠含量测定
将步骤（3）中待测液检测所得复硝酚钠峰面积与步骤（1）中复硝酚钠标准曲线比较、计算，得到待测样品中实际的复硝酚钠含量；
所述步骤（1）、（4）中，液相色谱条件为色谱柱：shim-pack XR-ODS 2.0×75 mm×1.6 μm；柱温 40℃；流动相A：2 mmol/L碳酸铵或氨水，流动相B：甲醇；流动性梯度为1.0 min 10%B，6.0 min 50%B，9.0min70%B，10.0min95%B，13.0min 95%B，13.5min10%B；流速为0.4 mL/min；进样量 1μL；
质谱条件为负离子电喷雾电离模式；DL管温度250℃；加热模块温度400℃；干燥气流速15 L/min，碰撞气压力 230 kPa；扫描方式为多反应监测；
邻硝基苯酚钠定量离子对：138.2/156.1；定性离子对：138.2/46.0；
对硝基苯酚钠定量离子对：138.2/156.1；定性离子对：138.2/46.0；5-硝基邻甲氧基苯酚钠定量离子对：168.2/153.0；定性离子对：168.2/123.0。
2.如权利要求1所述的一种果蔬中复硝酚钠残留量的检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中，线性相关性良好的具体浓度范围是：邻硝基苯酚钠在0.05mg/L-1.0 mg/L之间线性良好，对硝基苯酚钠在0.001mg/L-0.5mg/L之间线性良好，5-硝基邻甲氧基苯酚钠在0.001mg/L-0.5mg/L之间线性良好。
3.如权利要求1所述的一种果蔬中复硝酚钠残留量的检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中，复硝酚钠3种有效成分标准曲线分别为：邻硝基苯酚钠y=215174X+267.2，相关系数r2=0.9999；对硝基苯酚钠y=25365200X+121364，相关系数r2=0.9999；5-硝基邻甲氧基苯酚钠y=15015900X-45463.6，相关系数r2=0.9998。
4.如权利要求1所述的一种果蔬中复硝酚钠残留量的检测方法，其特征在于：所述步骤（2）中，称取待测样品质量为20-30 g，加入乙腈为20-30 mL，氯化钠的加入量为5-7g。
5.如权利要求1所述的一种果蔬中复硝酚钠残留量的检测方法，其特征在于：所述步骤（3）中，二氯甲烷和甲醇的混合溶剂的体积比为二氯甲醇：甲醇=95:5。
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Denomination of invention: A detection method of sodium dinitrophenol residue in fruits and vegetables Effective date of registration: 20211123 Granted publication date: 20210122 Pledgee: Yantai Fushan huiran Private Capital Management Co.,Ltd. Pledgor: SHANDONG YANTAI AGRICULTURAL SCI & TECH INSTITUTE Registration number: Y2021980012999 |
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Date of cancellation: 20220505 Granted publication date: 20210122 Pledgee: Yantai Fushan huiran Private Capital Management Co.,Ltd. Pledgor: SHANDONG YANTAI AGRICULTURAL SCI & TECH INSTITUTE Registration number: Y2021980012999 |