CN110702832B - 高含量4-羟基喹啉作为枣花蜂蜜特征标志物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及食品检测领域，具体涉及高含量4‑羟基喹啉作为枣花蜂蜜特征标志物的应用，同时，本发明提出了一种检测枣花蜂蜜的溯源识别方法，以4‑羟基喹啉为特征化合物，其在蜂蜜中含量介于3.5‑5.5 mg/kg时，可将其判断为枣花蜂蜜；否之，则将其判定为其它蜂蜜或掺假枣花蜂蜜。本发明提供的方法具有简单、高效等优点，便于操作和推广，对保护蜂蜜消费者的合法权益和维护蜂蜜消费行业健的康发展具有重要现实意义。

Description

高含量4-羟基喹啉作为枣花蜂蜜特征标志物的应用
技术领域
本发明涉及食品检测领域，具体涉及高含量4-羟基喹啉作为枣花蜂蜜特征标志物的应用。
背景技术
蜂蜜是由蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，经充分酿造而成的天然甜物质。由于蜂蜜具有丰富的营养价值，深受消费者青睐，其销售量也呈逐年上升趋势。我国疆域辽阔，地形复杂，气候多样，资源丰富，蜜源植物丰富多彩。我国的主要蜜源有：油菜、洋槐、枣花、荆条、椴树、紫云英、荔枝、枇杷等。其中枣花蜂蜜源植物在全国大部分省市均有栽培，尤其是在华北平原种植面积较大。2018年全国范围内枣花种植面积高达325万公顷，其中以山东、河北、山西、陕西和新疆最为集中。主产区的枣树开花为5月下旬或6月上旬，花期长25~30天，为高温型泌蜜植物。
当前，蜂蜜的供需存在巨大的缺口使不法分子在利益的诱使下生产掺假蜂蜜。虽然我过蜂蜜行业标准规定，不得在蜂蜜中添加任何当前明确或不明确的添加物。而事实上，蜂蜜掺假现象长期存在，每年都会有质量抽查曝光相关问题产品，这严重损害了消费者和正规蜂蜜生产企业的利益，影响了蜂蜜产品的市场秩序。
蜂蜜掺假有多种形式，在蜂蜜中掺入高纯度的果葡糖浆是蜂蜜掺假的主要形式之一，如大米糖浆、玉米糖浆、淀粉糖浆等。另一种蜂蜜掺假方式是向价值较高的单花蜜中掺入廉价的单花蜜或杂花蜜。当前现行的蜂蜜国家标准中仅仅对蜂蜜的理化性质和安全性指标做了严格限定，并未指出蜂蜜真实性评价的指标和方法。而且蜂蜜真实性评价指标的缺失为当前蜂蜜市场掺假售假的乱象提供了可能。枣花蜂蜜作为我国主要的单花蜜品种，因具有独特的养生美容保健等功效，深受人们喜爱。由于枣花蜂蜜产量有限，生产成本较高，导致枣花蜂蜜售价显著高于常见的其它单花蜜。不良企业为了追逐高额利润，往往会采用其它廉价蜂蜜冒充枣花蜂蜜，或者在枣花蜂蜜中勾兑其它廉价蜂蜜，更有甚者，在枣花蜂蜜中勾兑果葡糖浆。当前我国尚未制定有关枣花蜂蜜的标准，如何有效的评价和鉴定枣花蜂蜜成为当前蜂产品行业的亟需解决的问题之一。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明首先提出高含量4-羟基喹啉作为枣花蜂蜜特征标志物的应用，所述高含量为3.5-5.5 mg/kg。
本发明发现4-羟基喹啉在枣花蜂蜜中含量高且相对稳定，显著高于常见的二十余种单花蜜，因此可以将高含量的4-羟基喹啉作为枣花蜂蜜的特征标志物，用于评价枣花蜂蜜中是否掺入果葡糖浆，或者混入其它廉价蜂蜜。
本发明进一步提出一种枣花蜂蜜的溯源识别方法，以4-羟基喹啉为特征标志物；若蜂蜜样本中4-羟基喹啉的含量介于3.5-5.5 mg/kg时，判断所述蜂蜜样本为枣花蜂蜜；反之，则判定所述蜂蜜样本为其它蜂蜜或者掺假枣花蜂蜜。
作为优选，通过加入4-羟基喹啉的空白蜂蜜确认4-羟基喹啉的含量与峰面积间的线性关系，根据蜂蜜样本中4-羟基喹啉的峰面积推算其含量。
作为优选，采用UHPLC-Q-Orbitrap（超高液相色谱-高分辨质谱）或 LC-MS/MS检测蜂蜜样本。
作为优选，4-羟基喹啉在UHPLC-Q-Orbitrap的精确提取离子流色谱图中含有m/z 146.06004（[M+H]+）准分子离子峰，其精确质量数的误差应当小于5 ppm；优选4-羟基喹啉色谱峰的保留时间为4.71min，保留时间允许的偏差应小于0.3 min。
此外，为了提高对枣花蜂蜜的鉴别能力，4-羟基喹啉的精确质量数和保留时间除了满足上述条件之外，该物质的MS/MS图谱（子离子图谱）中应该含有m/z 77.03859、m/z91.05423 （C7H7 +）、m/z 94.06513、95.04914 （C6H7O+）、m/z 104.04948（C7H6N+）、m/z117.05730、m/z 118.06513（C8H8N+）和m/z 128.04948 （C9H6N+）中的一个或多个碎片离子。上述碎片离子m/z值的偏差应小于10 ppm。基于上述MS/MS图谱中提供的主要碎片离子，即便是在无4-羟基喹啉对照品的情况，依然可以通过判定蜂蜜样本中含有枣花蜂蜜，并可积分母离子峰面积用于枣花蜂蜜含量的计算。
作为优选，4-羟基喹啉在LC-MS/MS检测中提取离子流色谱图中含有m/z 146.10（[M+H]+）准分子离子峰；
和/或，MS/MS 谱图含有m/z 51.00、m/z 65.10、m/z 77.00、m/z 91.00、m/z94.20、m/z 104.10、m/z 117.10 和m/z 118.10中的一个或多个碎片离子。
作为优选，采用UHPLC-Q-Orbitrap对蜂蜜样本进行检测时，液相条件如下：
采用C18色谱柱，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为流动相B，采用梯度洗脱程序分离：0-2.0 min，5%的流动相B； 2.0-7.0 min，5-30%的流动相B； 7.0-14min，30-95%的流动相B； 14-18 min，95%的流动相B； 18.0-18.1 min，95-5%的流动相B；18.1-20.0 min，5%的流动相B。
优选液相的流速为0.30 mL/min。
优选进样量为5.0 µL。
作为优选，采用UHPLC-HRMS对蜂蜜样本进行检测时，质谱条件如下：
离子源参数：鞘气的流速45；辅助气的流速10；挡锥气的流速0；电喷雾电压3.5kV；离子导管的温度320 ℃；S-lens RF level设为 60；离子源的温度350℃；
优选采集的模式为正离子模式下的Full MS-ddMS2：其中Full MS的具体参数设置如下：分辨率：70000；AGC Target：3e6；Maximum IT：100 ms；Scan range：100-800 Da；Spectrum data：Centroid；其中dd-MS2的具体参数设置如下：分辨率：17500；AGC Target：1.6e5；Maximum IT：50 ms；Loop count：1； Isolation window：2.0 Da； NCE：90；Spectrumdata：Centroid；而dd settings中，Minimum AGC： 8.0e3；Apex trigger：2-6 s；Excludeisotope：on；Dynamic exclusion：8.0 s。
采用LC-MS/MS对蜂蜜样本进行检测时，由于检测仪器的不同，LC-MS/MS的液相和质谱设置条件与UHPLC-Q-Orbitrap差异较大，
优选液相条件如下：采用C18色谱柱（优选采用较短的C18色谱柱），柱温为25℃，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为流动相B；采用较短的梯度洗脱程序分离：0-0.5 min，5 %的流动相B； 0.5-1.2 min，5-20 %的流动相B； 1.2-1.5 min，20-50 %的流动相B； 1.5-1.7 min，50-95 %的流动相B；1.7-2.3 min，95 %的流动相B； 2.3-2.5 min，95-5%的流动相B； 2.5-3.0 min，5 %的流动相B。
优选液相的流速为0.30 mL/min。
优选进样量为3.0 µL。
为了准确定量蜂蜜中的4-羟基喹啉，采用LC-MS/MS对蜂蜜样本进行检测时，选择多反应监测的监测方式，MRM关键参数的设置如下：4-羟基喹啉Fragementor：98 V，146.0>77.0，34 eV，146.0>91.0，31 eV；
质谱条件如下：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；离子喷雾电压：3500 V；雾化气压力：45 psi；干燥气温度：300℃；干燥气流速：11 L /min；鞘气温度：250℃；鞘气流速：11 L /min。
其中，4-羟基喹啉详细MRM参数设置参见表1。
表1 LC-MS/MS在定量分析检测蜂蜜中4-羟基喹啉的MRM关键参数设置
Figure 858502DEST_PATH_IMAGE001
为验证建立的LC-MS/MS方法科学合理性，本发明考察了该方法的准确度和精密度，变异系数均小于10%，完全符合残留检测分析的要求。
基于本方法采用的仪器和公布的参数，不同分析实验室和检测机构可以依据液相串联高分辨质谱或者液相串联三重四极杆质谱技术的相关知识，对其中的参数进行一定调整。
作为优选，在检测前，还包括利用甲醇水对所述蜂蜜样本进行提取的步骤；
在所述甲醇水中，优选甲醇与水的体积比为2：8。
作为优选，采用UHPLC-Q-Orbitrap对蜂蜜样本进行检测前，将蜂蜜按1：10的质量体积比充分溶于甲醇水中，进行提取。
作为一种优选方案，所述提取具体包括如下步骤：按0.8g蜂蜜样品:7.2mL甲醇水的比例将其混合，并使蜂蜜充分化开后，20194 xg高速离心20 min，取上清过0.22 µm滤膜，再按照100µL提取液：900µL甲醇水的比例稀释一次。
本发明涉及到的试剂和标准品在市场上均可获得，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
本发明首次公布了高含量的4-羟基喹啉可作为枣花蜂蜜的特征标志物，并提出了采用液相串联质谱（UHPLC-Q-Orbitrap或LC-MS/MS）仪器检测蜂蜜中4-羟基喹啉的检测方法。基于高分辨质谱提供的精确质量数，该方法具有较高的特异性和灵敏度，检出限可以达到1 µg/kg 。
此外，为了准确定量枣花蜂蜜中4-羟基喹啉含量，本发明还对该物质的LC-MS/MS检测方法和关键的检测参数进行了优化。
同时，本发明中的方法还具有简单、高效等优点，便于操作和推广，对保护蜂蜜消费者的合法权益和维护蜂蜜消费行业的健康发展具有重要的现实意义。
附图说明
图1为枣花蜂蜜中生物标志物（4-羟基喹啉）的化学结构。
图2为4-羟基喹啉精确质量数的Full Mass和MS/MS质谱图。
图3为UHPLC-Q-Orbitrap检测4-羟基喹啉分别在空白蜂蜜、枣花花蜜和枣花蜂蜜样本中的精确提取离子流色谱图，其中提取的质量窗口偏差小于5 ppm。
图4为LC-MS/MS的MRM模式下4-羟基喹啉的定量、定性离子提取图。
图5为LC-MS/MS的MRM模式检测21种蜜源蜂蜜样品中4-羟基喹啉的含量。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
仪器与试剂：
1. 质谱仪（Q-Exactive Plus），美国Thermo Fisher Scientific公司
2. 1200 series液相色谱-6460三重四级杆质谱，美国Agilent Technologies公司
3.台式低温离心机（Microfuge 22R Centrifuge），美国 BeckMAN Coul TER公司
4.电子分析天平（PL203），德国METTLERTOLEDO公司
5.超纯水机（Milli-Q Gradient），美国Millipore公司
6.涡动仪（G560E），美国Scientific Industries公司
标准品4-羟基喹啉（化学结构见图1）购买于北京百灵威科技有限公司；甲酸(FA)购买于上海安谱实验科技股份有限(CNW)公司；乙腈(ACN)和甲醇(MeOH)购买于Fisher公司。
实施例1
1.样品来源
从市场或者蜂农处购买常见的真实有机蜂蜜样本共80份用于检测各种蜂蜜中4-羟基喹啉的含量，具体的包括枣花、油菜、洋槐、荔枝、龙眼、荆条、椴树、雪脂莲、向日葵、乌桕、石榴、野桂花、野坝子、柠条、麦卢卡、老瓜头、枸杞、党参、桉树蜂蜜各4个样品（每种蜂蜜的4个样品来源于不同的产地，加工程度有差异），以及五倍子和柑橘蜂蜜2个样品（每种蜂蜜的2个样品来源于不同的产地，加工程度有差异）。
2. 溶液配制
提取溶液：移取甲醇20 mL，超纯水定容到100 mL。4 ℃保存。
4-羟基喹啉标准溶液：称取10 mg的4-羟基喹啉标准品，甲醇定容至10 mL。4 ℃保存，有效期2个月。
3. Q Exactive plus测试条件如下：
（1）样品处理：
称取0.8 g蜂蜜加入7.2 mL 提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194 xg，4 ℃下离心20 min。收集上清液过0.22 µm滤膜，进样瓶加入900 µL提取液（甲醇水），再取过膜后的液体100 µL转移至进样品中涡旋混匀，等待上机分析。
（2）空白蜂蜜加标：
称取0.8 g空白蜂蜜（不含4-羟基喹啉）加入7.2 mL 提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194 xg，4 ℃下离心20 min。收集上清液过0.22 µm滤膜转移至进样品中，取900 µL过滤后的液体加入进样瓶，再移取100 µL浓度为1 mg/kg的4-羟基喹啉标准溶液。涡旋混匀，等待上机分析。
（3）Q Exactive plus仪器设置
色谱条件为：分析柱是为C18色谱柱。以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为B，采用梯度洗脱程序分离：0-2.0 min，5%的B；2.0-7.0 min，5-30%的B；7.0-14min，30-95%的B；14-18 min，95%的B；18.0-18.1 min，95-5%的B；18.1-20.0 min，5%的B；流速：0.30mL/min；进样量：5.0 µL。
离子源参数：鞘气的流速45； 辅助气的流速10； 挡锥气的流速0； 电喷雾电压3.5kV； 离子导管的温度320 ℃；S-lens RF level设为 60； 离子源的温度350℃。
采集的模式为正离子模式下的Full MS-ddMS2。
其中Full MS的具体参数设置如下：分辨率：70000；AGC Target：3e6；Maximum IT：100 ms；Scan range：200-800 Da； Spectrum data：Centroid。其中dd-MS2的具体参数设置如下：分辨率：17500；AGC Target：1.6e5；Maximum IT：50 ms；Loop count：1； Isolationwindow：2.0 Da； NCE：90；Spectrum data：Centroid。而dd settings中，Minimum AGC：8.0e3；Apex trigger：2-6 s；Exclude isotope：on；Dynamic exclusion：8.0 s。
质谱生成的数据通过Xcalibur软件收集并存储，将质谱采集的raw数据通过Xcalibur的Qualitative browser分析，比较样品与空白加标样品中4-羟基喹啉的Full MS及MS/MS图谱（见图2），确定样品中含有4-羟基喹啉。检测4-羟基喹啉分别在空白蜂蜜、枣花花蜜和枣花蜂蜜样本中的精确提取离子流色谱图，其中提取的质量窗口偏差小于5 ppm，得到图3。
（4）标准曲线的绘制：在空白蜂蜜样品提取后过滤膜的溶液中制备一系列4-羟基喹啉溶液（1，2，5，10，20，50ng/mL）。数据通过Trace Finder软件处理，定量蜂蜜样品中4-羟基喹啉的含量。
4.Agilent1200液相色谱-6460三重四级杆质谱分析条件如下：
（1）样品处理：
称取0.8 g蜂蜜加入7.2 mL 提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194 xg，4 ℃下离心20 min。收集上清液过0.22 µm滤膜，进样瓶加入900 µL提取液（甲醇水），再取过膜后的液体100 µL转移至进样品中涡旋混匀，等待上机分析。
（2）空白蜂蜜加标：
称取0.8 g空白蜂蜜（不含4-羟基喹啉）加入7.2 mL 提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194 xg，4 ℃下离心20 min。收集上清液过0.22 µm滤膜，进样瓶加入800 µL提取液（甲醇水），再取过膜后的液体100 µL转移至进样品中涡旋混匀，再移取100 µL浓度为200 ng/mL的4-羟基喹啉标准溶液。涡旋混匀，等待上机分析。
（3）Agilent 1200-6460仪器参数设置如下：液相条件中采用较短的C18色谱柱分离，是以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为B，采用较短的梯度洗脱程序分离：0-0.5 min，5 %的B； 0.5-1.2 min，5-20 %的B； 1.2-1.5 min，20-50 %的B； 1.5-1.7 min，50-95 %的B；1.7-2.3 min，95 %的B； 2.3-2.5 min，95-5 %的B； 2.5-3.0 min，5 %的B。液相的流速为0.30 mL/min；后运行3分钟，进样量为3.0 µL。
LC-MS/MS的质谱条件如下：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；监测方式：多反应监测（MRM）；离子喷雾电压：3500 V；雾化气压力：45 psi；干燥气温度：300℃；干燥气流速：11 L /min；鞘气温度：250℃；鞘气流速：11 L /min。
采集的模式为正离子模式下的MRM模式。MRM参数：146.1>77.0，33 eV （定量离子），146.1>91.0，31 eV （定性离子）。
（4）在空白蜂蜜样品提取后过滤膜的稀释10倍的溶液中制备一系列4-羟基喹啉溶液（1，2，5，10，20，50 ng/mL），并指定20 ng/mL的空白添加为质控样本。
LC-MS/MS的MRM模式下4-羟基喹啉的定量、定性离子提取图见图4。
通过Agilent 的MassHunter定量软件分析样品及空白加标样品。外标法定量，得到标准曲线公式为Y=4641.2388*X-1090.77448，R2=0.9957 （X为浓度Y定量离子响应积分值）
通过定量软件即可分析蜂蜜样品中的4-羟基喹啉含量，通过浓度稀释计算，得到蜂蜜中4-羟基喹啉的含量，见图5。当样品中4-羟基喹啉的含量介于3.5-5.5 mg/kg，可被判别为样品蜜源为枣花，该样品为枣花蜂蜜。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.高含量4-羟基喹啉作为枣花蜂蜜特征标志物的应用，所述高含量为3.5-5.5 mg/kg。
2.一种枣花蜂蜜的溯源识别方法，其特征在于，以4-羟基喹啉为特征标志物；若蜂蜜样本中4-羟基喹啉的含量介于3.5-5.5 mg/kg时，判断所述蜂蜜样本为枣花蜂蜜；反之，则判定所述蜂蜜样本为其它蜂蜜或者掺假枣花蜂蜜。
3.根据权利要求2所述的溯源识别方法，其特征在于，采用UHPLC-Q-Orbitrap或 LC-MS/MS检测蜂蜜样本。
4.根据权利要求3所述的溯源识别方法，其特征在于，4-羟基喹啉在UHPLC-Q-Orbitrap的精确提取离子流色谱图中含有m/z 146.06004（[M+H]+）准分子离子峰，其精确质量数的误差应当小于5 ppm；4-羟基喹啉色谱峰的保留时间为4.71min，保留时间允许的偏差应小于0.3 min；
和/或，4-羟基喹啉的MS/MS图谱中应含有m/z 77.03859、m/z 91.05423、m/z94.06513、m/z 95.04914、m/z 104.04948、m/z 117.05730、m/z 118.06513和m/z128.04948中的一个或多个碎片离子，其精确质量数的误差应当小于10 ppm。
5.根据权利要求3所述的溯源识别方法，其特征在于，4-羟基喹啉在LC-MS/MS检测中提取离子流色谱图中含有m/z 146.10（[M+H]+）准分子离子峰；
和/或，MS/MS 谱图含有m/z 51.00、m/z 65.10、m/z 77.00、m/z 91.00、m/z 94.20、m/z104.10、m/z 117.10 和m/z 118.10中的一个或多个碎片离子。
6.根据权利要求3或4所述的溯源识别方法，其特征在于，采用UHPLC-Q-Orbitrap对蜂蜜样本进行检测时，液相条件如下：
采用C18色谱柱，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为流动相B，采用梯度洗脱程序分离：0-2.0 min，5%的流动相B； 2.0-7.0 min，5-30%的流动相B； 7.0-14min，30-95%的流动相B； 14-18 min，95%的流动相B； 18.0-18.1 min，95-5%的流动相B；18.1-20.0min，5%的流动相B。
7.根据权利要求3或4所述的溯源识别方法，其特征在于，采用UHPLC-HRMS对蜂蜜样本进行检测时，质谱条件如下：
离子源参数：鞘气的流速45；辅助气的流速10；挡锥气的流速0；电喷雾电压3.5 kV；离子导管的温度320℃；S-lens RF level设为 60；离子源的温度350℃；
采集的模式为正离子模式下的Full MS-ddMS2：其中Full MS的具体参数设置如下：分辨率：70000；AGC Target：3e6；Maximum IT：100 ms；Scan range：100-800 Da； Spectrumdata：Centroid；其中dd-MS2的具体参数设置如下：分辨率：17500；AGC Target：1.6e5；Maximum IT：50 ms；Loop count：1； Isolation window：2.0 Da； NCE：90；Spectrum data：Centroid；而dd settings中，Minimum AGC： 8.0e3；Apex trigger：2-6 s；Excludeisotope：on；Dynamic exclusion：8.0 s。
8.根据权利要求3或5所述的溯源识别方法，其特征在于，采用LC-MS/MS对蜂蜜样本进行检测时，液相条件如下：
采用C18色谱柱，柱温为25℃，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为流动相B；采用梯度洗脱程序分离：0-0.5 min，5 %的流动相B； 0.5-1.2 min，5-20 %的流动相B；1.2-1.5 min，20-50 %的流动相B； 1.5-1.7 min，50-95 %的流动相B；1.7-2.3 min，95 %的流动相B； 2.3-2.5 min，95-5 %的流动相B； 2.5-3.0 min，5 %的流动相B。
9.根据权利要求3或5所述的溯源识别方法，其特征在于，采用LC-MS/MS对蜂蜜样本进行检测时，选择多反应监测的监测方式，MRM关键参数的设置如下：4-羟基喹啉Fragementor：98 V，146.0>77.0，34 eV，146.0>91.0，31 eV；
质谱条件如下：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；离子喷雾电压：3500 V；雾化气压力：45 psi；干燥气温度：300℃；干燥气流速：11 L /min；鞘气温度：250℃；鞘气流速：11L /min。
10.根据权利要求3所述的溯源识别方法，其特征在于，在检测前，还包括利用甲醇水对所述蜂蜜样本进行提取的步骤；
所述蜂蜜样本与甲醇水的质量体积比1：10；
在所述甲醇水中，甲醇与水的体积比为2：8。
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