CN117214327B - 一种蜂蜜中正己醇、正庚醇和雪松醇的检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蜂蜜中正己醇、正庚醇和雪松醇的检测方法及其应用，采用固相萃取富集净化和气相色谱‑串联质谱检测。样品采用乙酸乙酯提取，固相萃取柱富集，乙酸乙酯和正己烷洗脱，经氮吹浓缩后定容，采用气相色谱‑串联质谱仪检测，外标法定量。明确了薰衣草蜂蜜中三种物质的存在以及含量范围，将上述方法应用到薰衣草蜂蜜的鉴别中。即本发明建立了一种气相色谱‑串联质谱法测定蜂蜜中正己醇、正庚醇和雪松醇的方法，此方法实现了蜂蜜中正己醇、正庚醇和雪松醇的良好分离和准确检测，对于薰衣草蜂蜜的真实性鉴别与品质评价具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及食品检测及鉴别技术领域，更具体的说是涉及一种蜂蜜中正己醇、正庚醇和雪松醇的检测方法及其应用。
背景技术
蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质。薰衣草蜂蜜是蜜蜂采集薰衣草的花粉和花蜜酿造而成的蜂蜜，多产自于法国、西班牙、葡萄牙和中国新疆伊犁地区。新疆伊犁地区的气候及土壤条件适合于薰衣草的大批量种植，被誉为中国薰衣草之乡。薰衣草蜂蜜一般流蜜季节为6-8月份，薰衣草蜂蜜呈淡黄色，含有丰富的矿物质、有机酸、蛋白质、维生素等各种营养物质，具有丰富的香气成分，同时具有抗菌、抗氧化、镇静助眠功效，是一种极具研究和利用价值的单花种蜂蜜。
不同的单花种蜂蜜都有其特征成分，如枣花蜜中的4-羟基喹啉、洋槐蜜中的刺槐苷、荔枝蜜中的苹果酸等，这些特有化合物已经作为特征性化合物被应用于单花种蜂蜜的真实性鉴别。已有文献报道正庚醇、正己醇是薰衣草蜂蜜的特有挥发性成分。然而，目前尚未见蜂蜜中正己醇、正庚醇、雪松醇等醇类物质的同时定性定量检测方法。
因此，如何提供一种蜂蜜中正己醇、正庚醇、雪松醇等醇类物质同时检测的方法是本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种蜂蜜样本中的正己醇、正庚醇和雪松醇同时定性定量检测的方法，先提取富集后利用气相色谱-串联质谱法检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
首先，本发明提供了一种蜂蜜中正己醇、正庚醇和雪松醇的检测方法，包括以下步骤：
步骤一：样品处理
称取蜂蜜样品，向其中加入氯化钠，用水溶液溶解后加入乙酸乙酯振荡提取，提取后高速离心取上清液，氮吹浓缩后定容；
步骤二：固相萃取
取步骤一处理后的样品进行固相萃取，对正己醇、正庚醇和雪松醇进行富集、净化以及洗脱；
步骤三：测定
采用气相色谱-串联质谱法对蜂蜜样品中正己醇、正庚醇和雪松醇进行定性和定量检测，外标法定量，其中，所述气相色谱-串联质谱法检测条件为：
气相色谱条件：
色谱柱：DB-5MS气相色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；
进样口温度：260℃；
程序升温，初始温度40℃，保持1min，然后以10℃/min升到120℃，然后以30℃/min升到270℃，保持3min；
柱流量：1mL/min；载气：高纯氦气；进样方式：分流进样，分流比为10:1；进样量：1μL；
质谱条件：
离子源：电子轰击离子源EI；传输线温度：270℃；离子源温度：250℃；检测方式：多反应监测扫描模式SRM；其中，
正己醇：定量离子对(m/z)69.1/41.1，碰撞能量10eV；定性离子对(m/z)69.1/39.1，碰撞能量14eV；
正庚醇：定量离子对(m/z)70.2/55.1，碰撞能量8eV；定性离子对(m/z)70.2/41，碰撞能量10eV；
雪松醇：定量离子对(m/z)149.9/135.1，碰撞能量8eV；定性离子对(m/z)95/67.1，碰撞能量10eV。
优选的，步骤一中所述的蜂蜜与氯化钠质量比为1：1，蜂蜜和水的质量体积比为0.2g/mL，水和乙酸乙酯的体积比为1：1。
优选的，步骤一中所述的离心转速3500r/min，时间5min。
优选的，步骤一中所述振荡提取和离心重复两次，合并上清液。
进一步的，步骤一中所述的氮吹浓缩定容具体为：
30℃、≤5kpa条件下氮吹至500μL，然后用体积比乙酸乙酯：正己烷＝1:1的混合液定容至1mL。
优选的，步骤二中所述固相萃取步骤具体如下：
(2.1)萃取柱用体积比乙酸乙酯：正己烷＝1：1的混合液活化；
(2.2)将步骤一得到的定容后样品溶液过活化后的萃取柱，以2～3滴/秒的速度滴下；
(2.3)采用体积比乙酸乙酯：正己烷＝1：1的混合液洗脱，洗脱液30℃、≤5kpa条件下氮吹至900μL左右，然后用体积比乙酸乙酯：正己烷＝1:1的混合液定容至1mL，置于进样瓶中待测。
优选的，所述萃取柱采用Florisil固相萃取柱。
进一步的，步骤三中所述外标法定量中，外标曲线方程为：
正己醇：Y＝9.524e5X-5.226e4，线性相关系数R2＝0.9997；
正庚醇：Y＝1.799e6X-1.416e5，线性相关系数R2＝0.9997；
雪松醇：Y＝2.298e6X-1.055e4，线性相关系数R2＝0.9995；
其中，X为样品中目标物的浓度，Y为样品中目标物的峰面积。
此外，本发明还提供了一种采用如上技术方案所述的方法在薰衣草蜂蜜鉴别中的应用。
进一步的，所述薰衣草蜂蜜中含有正己醇、正庚醇和雪松醇，且正己醇含量0.796±0.213mg/kg、正庚醇含量0.294±0.038mg/kg、雪松醇含量0.221±0.031mg/kg。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种蜂蜜中正己醇、正庚醇和雪松醇的检测方法及其应用，具有如下有益效果：
本发明首次确定了正己醇、正庚醇和雪松醇作为薰衣草蜂蜜的特征标志物及其含量范围，根据蜂蜜中正己醇、正庚醇和雪松醇含量可以对薰衣草蜂蜜进行有效鉴别，纯薰衣草蜂蜜中正己醇、正庚醇和雪松醇含量分别为0.583-1.009mg/kg、0.256-0.332mg/kg、0.190-0.252mg/kg。
本发明建立了一种气相色谱-串联质谱法测定蜂蜜中正己醇、正庚醇和雪松醇的方法，此方法可以实现蜂蜜中正己醇、正庚醇和雪松醇的良好分离和准确检测，对于薰衣草蜂蜜的真实性鉴别与品质评价具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为正己醇、正庚醇和雪松醇的线性曲线；
图2为正己醇、正庚醇和雪松醇的总离子流色谱图；
图3为正己醇、正庚醇和雪松醇的多反应监测(SRM)色谱图；
图4为正己醇、正庚醇和雪松醇定量离子在检出限(LOD)和定量限(LOQ)水平下的多反应检测色谱图及信噪比；
图5为单花种蜂蜜样品中正己醇、正庚醇和雪松醇含量图。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中的仪器、试剂与材料如下：
气相色谱-串联质谱仪：TSQ 8000(Thermo Fisher Scientific，USA)；
MPS多功能样品前处理平台(德国Gerstel公司)；
色谱柱：Agilent DB-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；
漩涡混合器：Vortex-Genie2(Scientific Industries)；
多功能振荡器：SA 300(Yomato)；
电子分析天平：XP105(Mettler Toledo)；
超纯水发生器：Mili-Q(Millipore)；
微量可调移液器：量程20μL、100μL、200μL、1mL、5mL(ThermoFisher)；
正己醇标准品：纯度>99.5％(宁波海曙奥汉生物化工有限公司)；
正庚醇标准品：纯度99％(罗恩试剂)；
雪松醇标准品：纯度98％(罗恩试剂)；
乙酸乙酯、正己烷：色谱纯(迪马公司)；
氯化钠：分析纯(天津汇杭化工科技有限公司)；
试验用水均为超纯水。
具体测定步骤如下：
步骤一：标准曲线绘制
(1.1)标准储备溶液配制：分别准确称取0.01g正己醇、正庚醇标准品于10mL容量瓶中，用正己烷溶解并定容至刻度，均配制成1000mg/L，置于4℃条件下储存；准确称取0.1g雪松醇标准品于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成10000mg/L，置于4℃条件下储存；准确移取0.01mL雪松醇标准储备液于1mL进样小瓶中，用体积比丙酮：正己烷＝1:9的混合液定容至刻度，配制成100mg/L；
(1.2)混合标准储备溶液配制：分别准确移取1mL正己醇、正庚醇标准储备液于同一10mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，配制成100mg/L混合标准储备液，置于4℃条件下储存；
(1.3)混合标准工作溶液配制：准确移取1mL混合标准储备液和0.1mL100mg/L雪松醇于10mL容量瓶中，用体积比乙酸乙酯：正己烷＝1:1的混合液定容至刻度，配制成10mg/L正己醇、正庚醇，1mg/L雪松醇的混合标准工作溶液；
(1.4)混合系列标准溶液配制：取混合标准工作溶液用体积比乙酸乙酯：正己烷＝1:1的混合液稀释成正己醇、正庚醇浓度分别为0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、5.0mg/L和雪松醇浓度分别为0.01mg/L、0.02mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L的混合系列标准溶液；
(1.5)以正己醇、正庚醇和雪松醇定量离子的峰面积为Y轴，目标组分的浓度为X轴，绘制标准曲线，线性曲线见附图1，三种化合物的标准曲线方程和线性相关系数见表1；
表1正己醇、正庚醇和雪松醇线性范围、线性方程和相关系数
| 化合物 | 线性范围(mg/L) | 线性方程(mg/kg) | 相关系数R2 |
| 正己醇 | 0.1-5.0 | Y＝9.524e5X-5.226e4 | 0.9997 |
| 正庚醇 | 0.2-5.0 | Y＝1.799e6X-1.416e5 | 0.9997 |
| 雪松醇 | 0.01-0.5 | Y＝2.298e6X-1.055e4 | 0.9995 |
步骤二：样品处理
(2.1)准确称取1g(精确至0.01g)蜂蜜样品、1g(精确至0.01g)氯化钠至离心管中，加入5mL去离子水，涡旋溶解；
(2.2)然后向其中加入5mL乙酸乙酯，振荡提取20min，在3500r/min下离心5min，取出上清液，重复提取两次，合并上清液，在30℃，≤5kpa条件下氮吹至500μL左右，用体积比乙酸乙酯：正己烷＝1:1的混合液定容至1mL；
(2.3)取6mL体积比乙酸乙酯：正己烷＝1:1的混合溶液活化Florisil固相萃取柱，然后将上述1mL样品溶液转移至固相萃取柱上，以2～3滴/秒的速度滴下，上样完成后，用8mL体积比乙酸乙酯：正己烷＝1:1的混合液进行洗脱，收集洗脱液于玻璃试管中，在30℃，≤5kpa条件下氮吹至900μL左右，用体积比乙酸乙酯：正己烷＝1:1的混合液定容至1mL；
(4)将上述溶液转移至进样小瓶中，气相色谱-串联质谱仪检测，得到正己醇、正庚醇和雪松醇的总离子流图，见附图2，其中，检测条件为：
气相色谱条件：
色谱柱：DB-5MS气相色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；
进样口温度：260℃；
程序升温，初始温度40℃，保持1min，然后以10℃/min升到120℃，然后以30℃/min升到270℃，保持3min；
柱流量：1mL/min；载气：高纯氦气；进样方式：分流进样，分流比为10:1；进样量：1μL；
质谱条件：
离子源：电子轰击离子源EI；传输线温度：270℃；离子源温度：250℃；检测方式：多反应监测扫描模式SRM；其中，
正己醇：定量离子对(m/z)69.1/41.1，碰撞能量10eV；定性离子对(m/z)69.1/39.1，碰撞能量14eV；
正庚醇：定量离子对(m/z)70.2/55.1，碰撞能量8eV；定性离子对(m/z)70.2/41，碰撞能量10eV；
雪松醇：定量离子对(m/z)149.9/135.1，碰撞能量8eV；定性离子对(m/z)95/67.1，碰撞能量10eV；
正己醇、正庚醇和雪松醇的多反应监测(SRM)色谱图见附图3。
测定方法的检出限、准确度和精密度
以不低于3倍信噪比对应样品浓度为方法检出限，以不低于10倍信噪比对应样品浓度为方法定量限。三种化合物的检出限和定量限如表2所示，对应定量离子的色谱图见附图4。
表2正己醇、正庚醇和雪松醇检出限和定量限
| 化合物 | 检出限(mg/kg) | 定量限(mg/kg) |
| 正己醇 | 0.03 | 0.1 |
| 正庚醇 | 0.06 | 0.2 |
| 雪松醇 | 0.003 | 0.01 |
说明本发明方法具有较高的灵敏度和准确性。
向空白蜂蜜样品(不含正己醇、正庚醇和雪松醇)中加入低、中、高浓度(见表3)的混合标准工作液，按照以上所述检测方法进行分析测定并计算回收率。结果如表3所示。
表3正己醇、正庚醇和雪松醇回收率和精密度
表3表明，在低、中、高三种浓度的添加下，正己醇、正庚醇和雪松醇的回收率和相对标准偏差均符合分析要求。
实施例1
正己醇、正庚醇和雪松醇作为薰衣草蜂蜜特征标志物的确立及应用
样品来源：本研究所使用的蜂蜜样品均为各个蜜源植物开花流蜜季节采集的天然成熟蜜，所有样品直接购自蜂农，检测前置于4℃条件下保存。
采用本发明建立的分析方法，针对采集的7种不同蜜源植物的蜂蜜样品进行检测，具体包括：薰衣草蜂蜜15批、油菜蜜18批、洋槐蜜13批、枣花蜜15批、荆条蜜16批、椴树蜜15批、荔枝蜜14批。
对所有蜂蜜样品中正己醇、正庚醇和雪松醇含量进行检测、分析和对比，发现薰衣草蜂蜜与其他蜜种中正己醇、正庚醇和雪松醇的含量存在明显差异，见附图5，正己醇和正庚醇仅在薰衣草蜂蜜中检出，雪松醇在薰衣草蜂蜜中的含量明显高于其他蜜种。因而确定正己醇、正庚醇和雪松醇可以作为薰衣草蜂蜜的特征标志物。
由上述研究样本检测值可以确定的薰衣草蜂蜜的判别依据为：
A)正己醇、正庚醇和雪松醇均有检出，且含量分别在0.796±0.213mg/kg、0.294±0.038mg/kg、0.221±0.031mg/kg范围内，则样品为纯正薰衣草蜂蜜；
B)正己醇、正庚醇和雪松醇未检出，或检出目标物含量不在A)所述范围，则样品为非纯正薰衣草蜂蜜(掺杂或掺假)或非薰衣草蜂蜜(其他蜜种蜂蜜或非蜂蜜)。
进一步，从网络电商平台购买标注薰衣草蜂蜜的样本6批次，采用本发明方法进行正己醇、正庚醇和雪松醇的检测，采用上述判定依据对其真实性进行判定，结果见表4，其中3批样品符合本实施例判别依据，确定为真实薰衣草蜂蜜，另外3批样品经鉴定为非纯正薰衣草蜂蜜或非薰衣草蜂蜜，该结果说明本发明方法可以用于薰衣草蜂蜜的真实性鉴别。
表4市售蜂蜜样品中正己醇、正庚醇和雪松醇的测定结果及薰衣草蜂蜜真实性鉴别
a纯正薰衣草蜂蜜；b非纯正薰衣草蜂蜜或非薰衣草蜂蜜；c未检出。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (7)
1.一种蜂蜜中正己醇、正庚醇和雪松醇的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：样品处理
称取蜂蜜样品，向其中加入氯化钠，用水溶液溶解后加入乙酸乙酯振荡提取，提取后高速离心取上清液，氮吹浓缩后定容；
步骤二：固相萃取
取步骤一处理后的样品进行固相萃取，对正己醇、正庚醇和雪松醇进行富集、净化以及洗脱；
步骤三：测定
采用气相色谱-串联质谱法对蜂蜜样品中正己醇、正庚醇和雪松醇进行定性和定量检测，外标法定量，其中，所述气相色谱-串联质谱法检测条件为：
气相色谱条件：
色谱柱：DB-5MS气相色谱柱，规格：30m×0.25mm×0.25μm；
进样口温度：260℃；
程序升温，初始温度40℃，保持1min，然后以10℃/min升到120℃，然后以30℃/min升到270℃，保持3min；
柱流量：1mL/min；载气：高纯氦气；进样方式：分流进样，分流比为10:1；进样量：1μL；
质谱条件：
离子源：电子轰击离子源EI；传输线温度：270℃；离子源温度：250℃；检测方式：多反应监测扫描模式SRM；其中，
正己醇：定量离子对(m/z)69.1/41.1，碰撞能量10eV；定性离子对(m/z)69.1/39.1，碰撞能量14eV；
正庚醇：定量离子对(m/z)70.2/55.1，碰撞能量8eV；定性离子对(m/z)70.2/41，碰撞能量10eV；
雪松醇：定量离子对(m/z)149.9/135.1，碰撞能量8eV；定性离子对(m/z)95/67.1，碰撞能量10eV；
步骤二中所述固相萃取步骤具体如下：
(2.1)萃取柱用体积比乙酸乙酯：正己烷＝1：1的混合液活化；
(2.2)将步骤一得到的定容后样品溶液过活化后的萃取柱，以2～3滴/秒的速度滴下；
(2.3)采用体积比乙酸乙酯：正己烷＝1：1的混合液洗脱，洗脱液30℃、≤5kpa条件下氮吹至900μL，然后用体积比乙酸乙酯：正己烷＝1:1的混合液定容至1mL，置于进样瓶中待测；
所述萃取柱采用Florisil固相萃取柱。
2.根据权利要求1所述的一种蜂蜜中正己醇、正庚醇和雪松醇的检测方法，其特征在于，步骤一中所述的蜂蜜与氯化钠质量比为1：1，蜂蜜和水的质量体积比为0.2g/mL，水和乙酸乙酯的体积比为1：1。
3.根据权利要求1所述的一种蜂蜜中正己醇、正庚醇和雪松醇的检测方法，其特征在于，步骤一中所述的离心转速3500r/min，时间5min。
4.根据权利要求1所述的一种蜂蜜中正己醇、正庚醇和雪松醇的检测方法，其特征在于，步骤一中所述振荡提取和离心重复两次，合并上清液。
5.根据权利要求1所述的一种蜂蜜中正己醇、正庚醇和雪松醇的检测方法，其特征在于，步骤一中所述的氮吹浓缩定容具体为：
30℃、≤5kpa条件下氮吹至500μL，然后用体积比乙酸乙酯：正己烷＝1:1的混合液定容至1mL。
6.根据权利要求1所述的一种蜂蜜中正己醇、正庚醇和雪松醇的检测方法，其特征在于，步骤三中所述外标法定量中，外标曲线方程为：
正己醇：Y＝9.524e5X-5.226e4，线性相关系数R2＝0.9997；
正庚醇：Y＝1.799e6X-1.416e5，线性相关系数R2＝0.9997；
雪松醇：Y＝2.298e6X-1.055e4，线性相关系数R2＝0.9995；
其中，X为样品中目标物的浓度，Y为样品中目标物的峰面积。
7.一种权利要求1-6任一项所述的方法在薰衣草蜂蜜鉴别中的应用，其特征在于，所述薰衣草蜂蜜中含有正己醇、正庚醇和雪松醇，且正己醇含量0.796±0.213mg/kg、正庚醇含量0.294±0.038mg/kg、雪松醇含量0.221±0.031mg/kg。
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