CN109580861A - 一种用于测定蜂蜜样品抗氧化活性的标志物组合及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于检测领域,特别是食品检测领域。具体地,本发明涉及一种用于测定蜂蜜样品的抗氧化活性的标志物组合及方法。更具体地,本发明涉及一种用于测定或评价蜂蜜药品抗氧化活性的标志物组合,包括下述标志物:总酚酸、总黄酮、染料木苷、甲硫氨酸和3,4‑二羟基苯甲酸。本发明首次通过细胞水平评价蜂蜜的抗氧化活性,以酚酸、黄酮、氨基酸的多维靶标分析,基于化学计量统计学原理构建蜂蜜抗氧化组效关系营养谱的研究方法,对于加强蜂蜜的营养学研究,提高蜂蜜质量,保证消费者的健康,开发蜂蜜在食品化妆品等多工业消费品领域的健康使用等具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于检测领域,特别是食品检测领域。具体地,本发明涉及一种用于测定蜂蜜样品的抗氧化活性的标志物组合及方法。
背景技术
氧化还原作用是机体内的一种最基本的化学反应,在生物的代谢过程和能量转化过程中起着非常重要的作用。在正常生理情况下,氧化还原体系是处于动态平衡中的。当受到应激时,机体的氧化还原过程遭到破坏,打破了自由基的平衡,产生的过多自由基会给机体带来损害,主要表现为对生物膜、蛋白质、DNA和核酸的损伤,干扰细胞凋亡,导致慢性疾病的发生,如动脉粥样硬化、关节炎、糖尿病、神经病变、心血管疾病以及肿瘤等。
蜂蜜是蜜蜂采集花粉后混合其唾液,经过唾液的淀粉酶在蜂巢酝酿的自然甜性物质,它具有多而复杂的成分,如糖类(葡萄糖、蔗糖、果糖)、各种氨基酸、酶、维生素、多种微量元素、挥发性成分、黄酮和酚酸类等。因此,具有很好的营养价值和药用价值,是很好的保健品和药用辅料。研究发现蜂蜜具有抗氧化活性,其替代传统甜味剂会促进健康成人的抗氧化防御系统增强,具有十分明显的促进伤口愈合的作用。蜂蜜对脂质过氧化有较强的抑制能力,可以增加血液中的抗氧化物质,减少细胞中活氧量的累加,且蜂蜜中含有的酚类化合物对亚硝基的积极抑制,能使血浆中的酚酸含量增加;此外蜂蜜中含有许多抗氧化性因子,如黄酮类化合物、酚类物质、氨基酸(董蕊,郑毅男.蜂蜜中氨基酸含量对抗氧化能力的影响,食品科学,2011-11-15)等,这些抗氧化因子可以清除人体代谢过程中积累过多的自由基,其对羟基自由基和超氧阴离子的清除作用可保护DNA免受自由基诱导产生氧化损伤。
抗氧化活性研究方法主要包括体外抗氧化活性评价、体内抗氧化活性评价及离体抗氧化活性评价。体外抗氧化活性研究最常用的方法有:1,1-二苯基-2-苦基苯肼自由基清除法(DPPH)、氧自由基吸收能力测试(ORAC)、2,2′-连氮基-二-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐自由基清除法(ABTS,又称TEAC法)和铁离子还原抗氧化能力测试(FRAP)、总氧自由基清除能力测试(TOSC)、总自由基捕获抗氧化参数测定法(TRAP)等。化学方法可以快速评价抗氧化活性物质具有一种或多种抗氧化的能力,但检测手段多为紫外可见分光光度法,由于抗氧化作用机理十分复杂,且与生命体系中的各种物质之间存在着复杂的相互作用,因此游离于生命体系外的化学方法,依然无法摆脱不能真实模拟或反映机体内部生理环境的缺陷,无法实现评价方法的准确性。
体内抗氧化活性评价方法主要是以动物或人为研究对象模型,通过检测抗氧化酶和抗氧化物质的变化来评价抗氧化活性的一种方法。与体外抗氧化活性评价方法相比,体内抗氧化活性评价方法将复杂的生命体系与待评价活性物质有机关联,可全面、客观地反映抗氧化活性物质与体内复杂体系之间的关系,但由于该方法实验周期较长、重复性差、成本高、受试样品需求量大等局限,不利于抗氧化活性物质的快速筛选。
近年来,以细胞培养技术为基础的抗氧化活性评价方法迅速发展,它是检测抗氧化物质对人肝癌细胞内活性氧清除能力的方法,以细胞为载体,结合荧光检测技术,利用荧光探针2,7-二氯荧光素双乙酸盐,与细胞内ROS结合的原理,评价抗氧化活性物质的抗氧化活性。与化学评价方法相比,该方法与生命体——细胞体密切相关,能够解释吸收、运输和代谢中的机理问题,与体内抗氧化法比较,操作简便灵敏,可以作为食物抗氧化高通量分析或营养谱构建的评价方法。
蜂蜜对氧自由基的清除活性与蜂蜜的植物来源有关,虽然同种单花蜜的抗氧化活性具有地域差异的特点,但是差异性显著小于蜜源种类差异性。由于蜂蜜的成分十分复杂,目前对其发挥抗氧化的具体成分仍需进一步阐明。目前已经建立的体外抗氧化活性评价方法,因其局限性,面对复杂的抗氧化活性物质时,其准确性、灵敏度和选择性有所降低,严重制约着抗氧化活性研究的深入。
因此,尚需要开发一种新的测定蜂蜜样品的或其中成分的抗氧化活性的方法。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动,基于化学计量学计算不同蜜源植物蜂蜜的营养组分分析与细胞抗氧化活性评价,得到了一种构建抗氧化活性组效关系谱的方法,从而能够灵敏、快速、准确、客观地评价不同蜜源植物蜂蜜的抗氧化特性,为蜂蜜的质量控制与市场开发提供评价标准。由此提供了下述发明:
本发明的一个方面涉及一种用于测定或评价蜂蜜药品抗氧化活性的标志物组合,包括下述标志物(或者由下述标志物组成):
总酚酸、总黄酮、染料木苷、甲硫氨酸和3,4-二羟基苯甲酸;
优选地,所述标志物组合还包括选自酪氨酸、牡荆素、黄芩苷、异亮氨酸和异鼠李素中的任意一种或多种(例如前2种、前3种、前4种或5种);
更优选地,所述标志物组合还包括选自对香豆素、天冬氨酸、白杨素、咖啡酸和谷氨酸中的任意一种或多种(例如前2种、前3种、前4种或5种);
进一步优选地,所述标志物组合还包括选自隐绿原酸、赖氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和没食子酸中的任意一种或多种(例如前2种、前3种、前4种或5种);
特别优选地,所述标志物组合还包括选自半胱氨酸、生松素、绿原酸、槲皮素和苏氨酸中的任意一种或多种(例如前2种、前3种、前4种或5种);
最优选地,所述标志物组合还包括选自樱花亭、高良姜素、甘氨酸、木犀草素、脯氨酸和丁香酸中的任意一种或多种(例如前2种、前3种、前4种、前5种或6种)。
在本发明的一些实施方案中,所述的标志物组合,其包括总酚酸、总黄酮、染料木苷、甲硫氨酸和3,4-二羟基苯甲酸。
在本发明的一个实施方案中,所述的标志物组合,其包括总酚酸、总黄酮、染料木苷、甲硫氨酸、3,4-二羟基苯甲酸、酪氨酸、牡荆素、黄芩苷、异亮氨酸和异鼠李素。
在本发明的一个实施方案中,所述的标志物组合,其包括总酚酸、总黄酮、染料木苷、甲硫氨酸、3,4-二羟基苯甲酸、酪氨酸、牡荆素、黄芩苷、异亮氨酸、异鼠李素、对香豆素、天冬氨酸、白杨素、咖啡酸和谷氨酸。
在本发明的一个实施方案中,所述的标志物组合,其包括总酚酸、总黄酮、染料木苷、甲硫氨酸、3,4-二羟基苯甲酸、酪氨酸、牡荆素、黄芩苷、异亮氨酸、异鼠李素、对香豆素、天冬氨酸、白杨素、咖啡酸、谷氨酸、隐绿原酸、赖氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和没食子酸。
在本发明的一个实施方案中,所述的标志物组合,其包括总酚酸、总黄酮、染料木苷、甲硫氨酸、3,4-二羟基苯甲酸、酪氨酸、牡荆素、黄芩苷、异亮氨酸、异鼠李素、对香豆素、天冬氨酸、白杨素、咖啡酸、谷氨酸、隐绿原酸、赖氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、没食子酸、半胱氨酸、生松素、绿原酸、槲皮素和苏氨酸。
在本发明的一个实施方案中,所述的标志物组合,其包括总酚酸、总黄酮、染料木苷、甲硫氨酸、3,4-二羟基苯甲酸、酪氨酸、牡荆素、黄芩苷、异亮氨酸、异鼠李素、对香豆素、天冬氨酸、白杨素、咖啡酸、谷氨酸、隐绿原酸、赖氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、没食子酸、半胱氨酸、生松素、绿原酸、槲皮素、苏氨酸、樱花亭、高良姜素、甘氨酸、木犀草素、脯氨酸和丁香酸。
在本发明的一些实施方案中,所述的标志物组合,其中,各个标志物相互之间是独立存在的,即没有混合在一起。在本发明的一些实施方案中,所述的标志物组合,其中,各个标志物混合在一起。
在本发明的一些实施方案中,所述的标志物组合,其不包括选自下述化合物中的任意一种或多种:
阿魏酸、芥子酸、刺芒柄花素、柚皮素、山奈酚、非瑟酮、橙皮素、短叶松素、槲皮苷、橙皮苷、异樱花亭、花旗松素、杨梅素、丙氨酸、精氨酸、组氨酸和丝氨酸(例如其中任意的2种、任意的3种、任意的4种、任意的5种、任意的6种、任意的7种、任意的8种、任意的9种、任意的10种、任意的11种、任意的12种、任意的13种、任意的14种、任意的15种、任意的16种或17种)。
本发明的另一方面涉及一种测定蜂蜜样品的抗氧化活性的方法,包括下述步骤:
(1)测定该蜂蜜样品中的各标志物的含量,其中所述标志物为本发明的标志物组合中的标志物;
(2)将每个标志物的含量乘以每个标志物的相关系数,如此每个标志物得到一个乘积,其中所述相关系数如说明书中的表8所示;
(3)将步骤(2)中的各个乘积累加求总和,将得到的总和作为抗氧化活性数值。
本发明的再一方面涉及一种测定不同蜂蜜样品的抗氧化活性高低的方法,其通过本发明的测定蜂蜜样品的抗氧化活性的方法得到不同蜂蜜样品的抗氧化活性数值,然后比较不同蜂蜜样品的抗氧化活性数值的大小。抗氧化活性数值大的蜂蜜样品的抗氧化活性较高,抗氧化活性数值小的蜂蜜样品的抗氧化活性较低。
本发明的再一方面涉及一种测定蜂蜜样品中的成分的抗氧化活性的方法或者一种测定蜂蜜样品中的成分与其抗氧化活性的相关性的方法,包括下述步骤:
将该成分的含量以及各标志物的含量作为变量X,细胞抗氧化能力值作为变量Y,采用偏最小二乘回归法分析变量X和变量Y构成的矩阵,得到表示变量Y与变量X的系统相关程度的相关系数;其中,所述标志物为本发明的标志物组合中的标志物。
在本发明的一些实施方案中,所述成分可以是一种化合物,也可以是多种化合物,例如2种、3种、4种、5种或5种以上化合物。
在本发明的一些实施方案中,所述成分的含量以及各标志物的含量以高效液相色谱或超高效液相色谱的峰面积表示。
在本发明的一些实施方案中,总酚含量以每百克蜂蜜中没食子酸当量计,和/或总黄酮含量以每百克蜂蜜中槲皮素当量计。
在本发明的一些实施方案中,所述偏最小二乘回归法通过Simca p13.0软件进行;优选地,模型参数R2Y=0.883,Q2=0.706。
在本发明的一些实施方案中,将变量X的原始数据进行均一化和log转换,和/或将变量Y的原始数据进行均一化和log转换。
本发明的再一方面涉及一种测定蜂蜜样品中的成分的抗氧化活性的装置或者一种测定蜂蜜样品中的成分与其抗氧化活性的相关性的装置,包括:高效液相色谱或超高效液相色谱仪、质谱仪和处理器,
其中,所述处理器能够通过运行偏最小二乘回归法得到前述的方法中的相关系数。
在本发明的一些实施方案中,所述的装置,其中,所述质谱仪为三重四级杆质谱仪;优选地,所述装置还包括显示器和/或存储介质。
本发明的再一方面涉及本发明检测本发明的标志物组合的试剂或试剂组合在制备测定蜂蜜样品的抗氧化活性或者测定蜂蜜样品中的成分的抗氧化活性的药物中的用途。在本发明的一些实施方案中,所述试剂组合中的各个试剂之间是相互独立的,例如独立包装或者分装在不同的容器中。
在本发明中,如果没有特别说明,所述测定(例如测定蜂蜜样品的抗氧化活性或者测定蜂蜜样品中的成分的抗氧化活性)是指定量测定。在本发明的一些实施方案中,所述抗氧化活性以抗氧化活性数值表示,例如通过相关系数或者相关系数之和来表示。所述相关系数或者相关系数之和可以通过前述方法或者参考本发明的实施例得到。
发明的有益效果
本发明取得了如下技术效果中的一项或多项:
(1)该方法基于组学分析、活性评价以及化学计量学计算等学科交叉构建了蜂蜜抗氧化组效关系营养谱的研究方法,具有高通量、全面、快速、高效、准确等优点。
(2)基于柱前衍生-高效液相色谱法-荧光检测分析与固相萃取-超高效液相色谱法-三重四级杆质谱分析等分析仪器构建了蜂蜜中氨基酸与黄酮酚酸类单体的组学分析,方法重现性好,回收率高,针对性强,用量少,可适用于大范围样本的高通量分析。
(3)该方法首次基于细胞水平全面评价多种不同蜜源蜂蜜的抗氧化营养特性,充分考虑到了蜂蜜中抗氧化成分在细胞内的生物利用率、吸收和代谢情况,较常规的体外化学法更加接近机体内的生理状况,样品处理快速简便,用量少,重复性好,实用性强,实现高通量水平对蜂蜜的抗氧化能力进行研究,对蜂蜜的抗氧化营养特性评价具有重要意义。
(4)该方法基于化学计量学统计方法系统地构建了蜂蜜多维组效关系的营养谱,偏最小二乘法是一种新型的多元统计数据分析方法,集多元回归分析、典型相关分析和主成分分析优点三位一体,以主成分分析为数学基础,能够在自变量存在多重相关性的条件下进行回归建模,并在最终模型中包含原有的所有自变量,它是建立在化学计量学基础上的一种同时实现数据结构简化、变量相关分析和回归建模的统计学方法,可最大化反映蜂蜜抗氧化分析数据变异的最大信息并且具有预测功能。
附图说明
图1:每个蜂蜜样本中共有酚酸和黄酮单体的色谱图。横坐标是出峰时间,纵坐标是质谱离子强度,Ppb的含义是ng/mL。其中,图1-1至图1-30中的化合物依次分别为:
阿魏酸、丁香酸、芥子酸、白杨素、生松素;
刺芒柄花素、柚皮素、木犀草素、山奈酚、非瑟酮;
槲皮素、橙皮素、杨梅素、染料木苷、牡荆素;
黄芩苷、对香豆素、没食子酸、短叶松素、3,4-二羟基苯甲酸;
咖啡酸、异鼠李素、绿原酸、槲皮苷、橙皮苷;
高良姜素、樱花亭、异樱花亭、花旗松素、隐绿原酸。
图2:每个蜂蜜样本中氨基酸的定量谱峰数据。
图3:CAA值-槲皮素浓度标准曲线:以不同浓度槲皮素预处理细胞的槲皮素组在不同时间的荧光值。
图4-1:每个蜂蜜样本的细胞抗氧化活性半数有效量柱形图。
图4-2:每个蜂蜜样本的细胞抗氧化活性半数有效量累计频率图。
图5:蜂蜜抗氧化活性的组效关系谱,即每个化学成分的含量分布对细胞抗氧化活性的贡献系数图。
其中:
横坐标是X变量,从左到右依次是X1(阿魏酸),X2(丁香酸),X3(芥子酸),X4(白杨素),X5(生松素),X6(刺芒柄花素),X7(柚皮素),X8(木犀草素),X9(山奈酚),X10(非瑟酮),X11(槲皮素),X12(橙皮素),X13(染料木苷),X14(牡荆素),X15(黄芩苷),X16(对香豆素),X17(没食子酸),X18(短叶松素),X19(3,4-二羟基苯甲酸),X20(咖啡酸),X21(异鼠李素),X22(绿原酸),X23(隐绿原酸),X24(槲皮苷),X25(橙皮苷),X26(高良姜素),X27(樱花亭),X28(异樱花亭),X29(花旗松素),X30(杨梅素),X31(丙氨酸),X32(精氨酸),X33(天冬氨酸),X34(半胱氨酸),X35(谷氨酸),X36(甘氨酸),X37(组氨酸),X38(亮氨酸),X39(异亮氨酸),X40(赖氨酸),X41(甲硫氨酸),X42(苯丙氨酸),X43(脯氨酸),X44(丝氨酸),X45(酪氨酸),X46(缬氨酸),X47(苏氨酸),X48(总黄酮),X49(总酚酸);
纵坐标是X变量与Y变量(细胞抗氧化值)的相关关系值。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
蜂蜜样本的准备:从每个已知品种蜂蜜的主产区采集样本,构成多种已知不同品种的蜂蜜样本群,包括洋槐蜜、枣花蜜、荆条蜜、椴树蜜、小茴香蜜、荞麦蜜、雪莲蜜、党参蜜、黄芪蜜、龙眼蜜、荔枝蜜、麦卢卡蜂蜜、桉树蜜、向日葵蜂蜜、橙花蜜、薰衣草蜂蜜共37个样本。用于下面的实施例。如下面的表1所示。
表1
实施例1:各蜂蜜样本中酚酸类化合物和黄酮类化合物的分析
取前述的蜂蜜样本,分别进行MAX固相萃取-超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用分析多种酚酸与黄酮类化合物,得到每个蜂蜜样本中黄酮与酚酸类化合物的谱峰数据。
MAX固相萃取方法采用10g蜂蜜用50ml 0.5%氨水溶解,10000rpm离心5min后取全部上清液通过0.5%氨水预平衡的1g MAX固相萃取柱,50mL超纯水洗脱后收集30mL 2%甲酸甲醇洗脱液,氮吹浓缩至干后1mL甲醇溶解0.22μm过滤上机分析。
超高效液相色谱采用ACQUITY HSS T3column(2.1×100mm,1.8μm)色谱柱,以0.1%甲酸-水溶液为流动相A,0.1%甲酸-乙腈溶液为流动相B,按照体积比进行梯度洗脱:0-1.00min,A:97%;1.00-18.00min,A:97%-10%;18.00-20.00min,A:10%;20.00-20.10min,A:10%-0%;20.10-23.00min,A:0%;23.00-23.10min,A:0-97%;23.10-28.00min,A:97%,流速0.3mL/min,柱温35℃,进样量1μL。
质谱分析采用选择离子扫描模式(MRM)和分段扫描,以保证每个定量峰的采集点数和测量的准确度与重现性,ESI正模式和负模式的喷雾电压分别为3.50KV和3.00KV,离子源温度150℃,脱溶剂气温度500℃,脱溶剂气流量650L/Hr,气帘气流量150L/Hr,碰撞气流量0.25mL/min,雾化器气流7.00Bar,各个参数均可在±10%范围内浮动,每个化合物的锥孔电压、碰撞电压和正负离子模式选择见表2。
表2
以每个化合物标准品作标准曲线(1-1000ppb)得到每个蜂蜜样本中共有酚酸和黄酮单体的定量谱峰数据,分别如图1-1至图1-30所示。
实施例2:各蜂蜜样本中氨基酸的分析
取前述的蜂蜜样本,分别进行柱前衍生-高效液相色谱-荧光分析器分析氨基酸类化合物。使用AccQ·Tag Ultra衍生试剂(6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯)对氨基酸进行衍生,伯氨基酸和仲氨基酸均可快速、定量完成衍生反应,产生高度稳定的、具有荧光性的加合物。
每3g蜂蜜用15ml超纯水溶解,10000rpm离心5min后,取10μl样品溶液于样品衍生管中加入衍生试剂20μl和硼酸缓冲液170μl,涡旋振荡1min后转入自动进样瓶内插管中,于55℃加入10min后上机分析,采用沃特世氨基酸分析专用柱3.9×150mm,柱温37℃,激发波长250nm,发射波长395nm,流动相由AccQ·Tag Ultra浓缩型水相缓冲液A每100mL稀释至1L作为流动相A,色谱级乙腈作为流动相B,超纯水作为流动相C,梯度洗脱条件见表3,流速1.0ml/min,柱温37℃。
表3
时间(min) | %A | %B | %C | 曲率 |
Initial | 100 | 0 | 0 | * |
0.5 | 99 | 1 | 0 | 11 |
18.0 | 95 | 5 | 0 | 6 |
19.0 | 91 | 9 | 0 | 6 |
29.5 | 83 | 17 | 0 | 6 |
33.0 | 0 | 60 | 40 | 11 |
36.0 | 100 | 0 | 0 | 11 |
65.0 | 0 | 60 | 40 | 11 |
100.0 | 0 | 60 | 40 | 6 |
注:
*是因为是开始,还不存在曲率。
以每个2.5mM的17种氨基酸(其中胱氨酸浓度为1.25mM)混合标准品作标准曲线(0.025-2.5mM)得到每个蜂蜜样本中氨基酸的定量谱峰数据,如图2所示。
实施例3:各蜂蜜样本中的总酚和总黄酮的测定
因为不能保证实施例1中的单体化合物涵盖蜂蜜中所有酚酸类或黄酮类单体化合物,因此这里补充总酚,总黄酮作为组分的表达,在化学计量学构建组效关系谱的时候也分别作为2列X变量,与4中的单体定量谱峰数据是平行的关系,都作为x变量。
(1)蜂蜜中总酚的测定
取前述的蜂蜜样本,用超纯水超声溶解并稀释至0.16g/mL的浓度,采用Folin-Ciocalteu法测定总酚含量,配制0.2N福林-西奥卡特试剂和75g/L碳酸钠溶液。在96孔板上分别依次加入30μL蜂蜜溶液、150μL福林-西奥卡特试剂和120μL碳酸钠溶液,室温暗处反应2小时后在酶标仪于760nm下测定吸光度,以没食子酸(1μg/mL,10μg/mL,20μg/mL,60μg/mL,120μg/mL,250μg/mL)为对照品绘制标准曲线,获取总酚含量以每百克蜂蜜中没食子酸当量计。
(2)蜂蜜中总黄酮的测定
取前述的蜂蜜样本,用超纯水超声溶解并稀释至2g/mL的浓度,采用氯化铝-硝酸钠反应-紫外分光光度计法测定,配制0.15g/mL硝酸钠水溶液,0.1g/mL氯化铝水溶液和0.04g/mL氢氧化钠水溶液,吸取1mL蜂蜜溶液加入4mL超纯水,0.3mL硝酸钠水溶液,0.3mL氯化铝水溶液和4mL氢氧化钠水溶液并用纯净水定容至10mL,室温暗处静置15min后在酶标仪于415nm下测定吸光度,以槲皮素(0.08mg/mL,0.16mg/mL,0.24mg/mL,0.32mg/mL,0.40mg/mL,1.0mg/mL)为对照品绘制标准曲线,获取总黄酮含量以每百克蜂蜜中槲皮素当量计。
实施例4:建立细胞水平槲皮素抑制荧光物质形成能力的标准曲线
将对数生长期的HepG2细胞(购自中国科学院干细胞库,编号SCSP-510)接种到96孔板,每孔100μl,每孔细胞数约为6×104个,于37℃、5%CO2条件下培养24小时。所用细胞的酯酶能分解2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)形成DCFH,DCFH极易被氧自由基或活性氧氧化成强荧光的二氯荧光素。
精确称取槲皮素对照品,用无水乙醇配置标准储备液,并用无血清的MEM培养基(含DCFH-DA,终浓度为25μmol/L)稀释成0.5mg/L、2.5mg/L、5mg/L、10mg/L、12mg/L、15mg/L、20mg/L、30mg/L、50mg/L,得到槲皮素梯度工作液。
槲皮素溶液预处理前述细胞,然后加入2,2'-偶氮二异丁基咪二盐酸盐(AAPH)刺激DCFH氧化成强荧光的二氯荧光素,在酶标仪荧光检测模块下扫描得到1小时内的荧光值;以细胞培养基代替槲皮素、不加AAPH做为空白调零,以含25μmol/L的DCFH-DA细胞培养基、加MEM培养基和AAPH做为空白组,加槲皮素和AAPH作为对照组,荧光值对时间的积分面积减少比例为细胞抗氧化能力值CAA,基于不同浓度槲皮素的CAA值计算出槲皮素抑制荧光物质形成能力的半数有效浓度EC50值。
具体步骤如下:培养细胞移去培养液,用PBS清洗一次后每孔加入100μl槲皮素溶液,平行3孔,96孔板周围孔弃用。37℃、5%CO2条件下培养1小时后,弃去培养液,每孔加入100μl的600μmol/L AAPH,用荧光酶标仪(激发波长538nm、发射波长485nm,37℃)每5分钟测定一次荧光值,持续测定1h,得到1小时内荧光值的变化情况。
CAA值由计算如下:CAA(unit)=100-(∫SA/CA)×100,其中∫SA为样品时间-荧光值曲线下的积分面积;∫CA为对照时间-荧光值曲线下的积分面积。样品的半数有效浓度(EC50)根据log(fa/fu)对log(does)的中效原理来计算,fa表示样品作用效应(CAA unit),fu表示100-CAA unit。
结果如图3所示。
实施例5:各蜂蜜样本的抗氧化能力的测定
每个单花蜜样本用无血清的培养基制备成梯度溶液(0.1-1.5g/mL),代替实施例4中使用的槲皮素工作溶液,按照同样的操作步骤测定荧光值,计算CAA值,通过EC50值折算每百克蜂蜜相当于槲皮素(QE)的微摩尔当量,如图4-1所示。
图4-2对于不同蜂蜜样本的抗氧化活性给出了具体数值表达即CAA的槲皮素当量折算值,以及结合柱形图比较高低差异,由图可以看到,荞麦蜂蜜的CAA值最高,达59点多,抗氧化活性强。
实施例6:蜂蜜细胞水平抗氧化组效关系谱的构建
偏最小二乘法是一种新型的多元统计数据分析方法,集多元回归分析、典型相关分析和主成分分析优点三位一体,以主成分分析为数学基础,能够在自变量存在多重相关性的条件下进行回归建模,并在最终模型中包含原有的所有自变量,它是建立在化学计量学基础上的一种同时实现数据结构简化、变量相关分析和回归建模的统计学方法,可最大化反映蜂蜜抗氧化分析数据变异的最大信息并且具有预测功能。
将实施例1-3测得的蜂蜜总黄酮、总酚酸、30个单体化合物和17个氨基酸的定量谱峰数据(如表4-表7)作为变量(X),实施例5的抗氧化评价数据作为变量(Y),采用偏最小二乘回归法(partial least squares regression,PLS)分析二者构成的矩阵,模型参数R2Y=0.883,Q2=0.706。R2Y代表在Y轴方向模型的解释率,Q2代表模型的预测率,通常该参数反映的是这个组效关系谱的构建模型在解释和预测能力的可行性,一般大于0.5就可以解释和预测。如果进行相同的实验,理论上参数波动不会很大,如果参数不能满足要求即说明模型不可行;因此R2Y和Q2能够分别反映模型的解释能力和预测能力。
采用瑞士公司Umetrics的Simca p13.0软件进行模型的构建与计算,基于如下面的表4-表7所示形式的原始数据变量进行处理,一次对多个蜂蜜样本的多组分和活性进行分析。为了尽可能满足泊松分布(如果不满足会在软件里显示红色),将原始数据进行了均一化和log转换;模型参数是软件自动计算的,是对模型的拟合性和预测能力进行评估。其中均一化是,例如,将X1列数据求平均值后,每个样本的X1值除以平均值得出的数值,以此类推。Log转换是在simca P的软件里有一个对所有矩阵变量(包括变量X和变量Y)进行10logX的转换。
得到的相关系数如表8或图5所示。相关系数表示y变量与x变量的系统相关程度。具体通过simca P软件计算:把均一化数据导入simca P后然后对数据进行log转换,选择PLS分析后点击Coefficient。可以选择图示得到图5,也可以选择list得到表8。表8即为基于表4-7所有X变量和Y变量的关系得出的结论。
表8
相关系数(Regression coefficient)的值大于0,表明该相关系数对应的化合物具有抗氧化活性;相关系数的值如果小于0,则表明该相关系数对应的化合物的含量对于蜂蜜样品的抗氧化活性不具有显著影响。
根据表8或图5中的相关系数值,确定了31个变量因素与蜂蜜细胞水平抗氧化活性呈正相关。
根据相关系数(从大到小排列)得出贡献排名:总酚酸>总黄酮>染料木苷>甲硫氨酸>3,4-二羟基苯甲酸>酪氨酸>牡荆素>黄芩苷>异亮氨酸>异鼠李素>对香豆素>天冬氨酸>白杨素>咖啡酸>谷氨酸>隐绿原酸>赖氨酸>缬氨酸>苯丙氨酸>没食子酸>半胱氨酸>生松素>绿原酸>槲皮素>苏氨酸>樱花亭>高良姜素>甘氨酸>木犀草素>脯氨酸>丁香酸。富含这些成分的蜂蜜可以加强在食品、化妆品领域的抗氧化功能的开发使用。
实施例7:蜂蜜细胞水平抗氧化组效关系谱的应用
1.实验方法
基于PLS分析的数据,可以采用simca P软件进行预测功能判断。随机从表4-表7中抽取6个蜂蜜样本组成预测集,表4-表7中的其余样本作为测试集,基于Simca P软件中Predict功能得出classification list表格,其中通过模型分类的符合系数(也称为预测系数)判断该蜂蜜样本符合XY变量相关关系的程度。符合系数是simca软件计算的一种系数用于预测判断,判断X变量基于PLS分析的相关系数得出的预测的Y变量和实际测定的Y变量的符合程度,例如随机抽取的6种蜂蜜,基于X变量预测Y变量是否和实际Y变量相符合。通常符合系数接近并大于0.5可以判断预测结论理想。
2.实验结果
6个蜂蜜样本的符合系数和预测结论如下面的表9所示。
表9
符合系数 | 预测结论 | |
槐花蜂蜜 | 0.999 | 理想 |
枣花蜂蜜 | 0.964 | 理想 |
荆条蜂蜜 | 0.996 | 理想 |
椴树蜂蜜 | 0.835 | 理想 |
党参蜂蜜 | 0.998 | 理想 |
黄芪蜂蜜 | 0.973 | 理想 |
3.结果分析
结果表明,构建的蜂蜜组效关系谱对蜂蜜基于化学成分的含量分布对抗氧化活性的影响具有良好的预测性;富含总酚酸、总黄酮、染料木苷、甲硫氨酸、3,4-二羟基苯甲酸、酪氨酸、牡荆素、黄芩苷、异亮氨酸、异鼠李素、对香豆素、天冬氨酸、白杨素、咖啡酸、谷氨酸、隐绿原酸、赖氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、没食子酸、半胱氨酸、生松素、绿原酸、槲皮素、苏氨酸、樱花亭、高良姜素、甘氨酸、木犀草素、脯氨酸和丁香酸的蜂蜜抗氧化活性高。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导,可以对那些细节进行各种修改和替换,这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (12)
1.一种用于测定或评价蜂蜜药品抗氧化活性的标志物组合,包括下述标志物:
总酚酸、总黄酮、染料木苷、甲硫氨酸和3,4-二羟基苯甲酸;
优选地,所述标志物组合还包括选自酪氨酸、牡荆素、黄芩苷、异亮氨酸和异鼠李素中的任意一种或多种;
更优选地,所述标志物组合还包括选自对香豆素、天冬氨酸、白杨素、咖啡酸和谷氨酸中的任意一种或多种;
进一步优选地,所述标志物组合还包括选自隐绿原酸、赖氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和没食子酸中的任意一种或多种;
特别优选地,所述标志物组合还包括选自半胱氨酸、生松素、绿原酸、槲皮素和苏氨酸中的任意一种或多种;
最优选地,所述标志物组合还包括选自樱花亭、高良姜素、甘氨酸、木犀草素、脯氨酸和丁香酸中的任意一种或多种。
2.根据权利要求1所述的标志物组合,其不包括选自下述化合物中的任意一种或多种:
阿魏酸、芥子酸、刺芒柄花素、柚皮素、山奈酚、非瑟酮、橙皮素、短叶松素、槲皮苷、橙皮苷、异樱花亭、花旗松素、杨梅素、丙氨酸、精氨酸、组氨酸和丝氨酸。
3.一种测定蜂蜜样品的抗氧化活性的方法,包括下述步骤:
(1)测定该蜂蜜样品中的各标志物的含量,其中所述标志物为权利要求1所述的标志物组合中的标志物;
(2)将每个标志物的含量乘以每个标志物的相关系数,如此每个标志物得到一个乘积,其中所述相关系数如说明书中的表8所示;
(3)将步骤(2)中的各个乘积进行累加求总和,将得到的总和作为抗氧化活性数值。
4.一种测定不同蜂蜜样品的抗氧化活性高低的方法,其通过权利要求3所述的方法得到不同蜂蜜样品的抗氧化活性数值,然后比较不同蜂蜜样品的抗氧化活性数值的大小。
5.一种测定蜂蜜样品中的成分的抗氧化活性的方法或者一种测定蜂蜜样品中的成分与该成分抗氧化活性的相关性的方法,包括下述步骤:
将该成分的含量以及各标志物的含量作为变量X,细胞抗氧化能力值作为变量Y,采用偏最小二乘回归法分析变量X和变量Y构成的矩阵,得到表示变量Y与变量X的系统相关程度的相关系数;其中,所述标志物为权利要求1所述的标志物组合中的标志物。
6.根据权利要求5所述的方法,其中,所述成分的含量以及各标志物的含量以高效液相色谱或超高效液相色谱的峰面积表示。
7.根据权利要求6所述的方法,其中,总酚含量以每百克蜂蜜中没食子酸当量计,和/或总黄酮含量以每百克蜂蜜中槲皮素当量计。
8.根据权利要求5所述的方法,其中,所述偏最小二乘回归法通过Simca p13.0软件进行;优选地,模型参数R2Y=0.883,Q2=0.706。
9.根据权利要求5所述的方法,其中,将变量X的原始数据进行均一化和log转换,和/或将变量Y的原始数据进行均一化和log转换。
10.一种测定蜂蜜样品中的成分的抗氧化活性的装置或者一种测定蜂蜜样品中的成分与其抗氧化活性的相关性的装置,包括:高效液相色谱或超高效液相色谱仪、质谱仪和处理器,
其中,所述处理器能够通过运行偏最小二乘回归法得到权利要求5所述的方法中的相关系数。
11.根据权利要求10所述的装置,其中,所述质谱仪为三重四级杆质谱仪;优选地,所述装置还包括显示器和/或存储介质。
12.检测权利要求1或2所述的标志物组合的试剂或试剂组合在制备测定蜂蜜样品的抗氧化活性或者测定蜂蜜样品中的成分的抗氧化活性的药物中的用途。
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