CN113109280B - 一种不同产地骆驼蓬植物抗氧化活性的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于代谢组学技术领域,具体公开一种基于代谢组学技术分析不同产地骆驼蓬植物抗氧化活性的方法,包括以下步骤:对不同产地的骆驼蓬进行分析,获得骆驼蓬提取物中代谢物信息、矿质元素含量数据及其对DPPH自由基的半抑制浓度数据;并根据采集到的核磁共振谱图数据筛选出差异代谢物,分析所述半抑制浓度与所述矿物质元素含量、所述差异代谢物含量的相关性。本发明运用核磁、电感耦合等离子体原子发射光谱及分光光度联合技术,以不同地区的骆驼蓬植物为研究对象,对其中代谢物、矿质元素及抗氧化活性展开代谢组学分析,为不同地区植物的抗氧化活性分析提供了新方法。
Description
技术领域
本发明属于代谢组学技术领域,具体公开一种基于代谢组学技术分析不同产 地骆驼蓬植物抗氧化活性的方法。
背景技术
植物骆驼蓬为蒺藜科多年生草本植物,是一种具有代表性的盐生植物,即可 在轻度至中、重度盐渍化土壤生境中均能生存的物种,在国内外均有分布。骆驼 蓬不仅具有重要的生态价值,而且还有很高的经济价值。骆驼蓬在我国西北地区 常以种子或全草入药,用以治疗咳嗽气喘、无名肿痛、风湿痹痛等疾病的重要的 民族药材。最新研究成果表明骆驼蓬植物具有多种的药理活性。其具有止咳平喘、 祛风湿、消肿毒的功效。
目前,代谢组学研究中常用的分析工具主要是以核磁共振波谱(Nuclearmagnetic resonance,NMR)和质谱(Mass spectrometry,MS)技术为核心的分析手段及 其与色谱的联用技术,其中NMR技术具有快速、高通量和自动化分析程度高的 优点,且对极性化合物敏感,对样本处理要求低。NMR技术能为代谢物鉴定提 供原子水平上的结构信息,是其他方法难以比拟而被广泛用于植物抗逆性研究的 平台。然而单一平台对代谢组学样品进行研究,获取化学成分种类有限,只能从 这些代谢物信息中推测植物的抗逆性。因此如何利用多平台代谢组学技术提供一 种多角度准确的检测方法,研究植物抗氧化体系抵御逆境胁迫类型是有待解决的 技术问题。
发明内容
本发明提供的不同产地骆驼蓬植物抗氧化活性的分析方法,运用核磁、电感 耦合等离子体原子发射光谱及分光光度联合技术,以不同地区的骆驼蓬植物为研 究对象,对其甲醇提取物中代谢物、抗氧化活性及样品中矿质元素展开代谢组学 分析,为研究不同地区骆驼蓬植物的抗氧化活性分析提供了新方法。
本发明提供的不同产地骆驼蓬植物抗氧化活性的分析方法,包括以下步骤:
对不同产地的骆驼蓬进行分析,获得骆驼蓬提取物中代谢物信息、矿质元素 含量数据及所述骆驼蓬提取物对DPPH自由基的半抑制浓度数据;并根据采集到 的核磁共振谱图数据筛选出差异代谢物,分析所述半抑制浓度与所述矿物质元素 含量、所述差异代谢物含量的相关性。
优选地,所述矿物质元素含量是骆驼蓬样品经消解后利用电感耦合等离子体 原子发射光谱法测定。
优选地,所述半抑制浓度是利用分光光度法得到不同浓度骆驼蓬甲醇提取液 对DPPH自由基的抑制率曲线,再计算得到半抑制浓度。
优选地,所述代谢物信息是利用一维核磁共振波谱法对骆驼蓬甲醇提取物进 行信号采集,确定代谢物类型;再使用代谢轮廓定量分析方法对不同代谢物的特 征峰进行积分,再计算获得代谢物含量。
优选地,所述甲醇提取物是将骆驼蓬植物样品与5倍量的甲醇溶液混合,超 声提取后离心,得到的上清液依次浓缩、干燥得到。
优选地,所述信号采集是通过二维核磁共振波谱法获得所述骆驼蓬甲醇提取 物的COSY、HSQC和HMBC谱图;
其中,所述COSY谱图中谱宽为5000Hz,采样点数分别是400(F1)×4096 (F2),累加次数24次;
所述HSQC谱图1H谱宽为5000Hz,13C谱宽为22638Hz,采样点数分别是 256(F1)×2048(F2),累加次数60次;
所述HMBC谱图中1H谱宽为5000Hz,13C谱宽为30184Hz,采样点数分别 是256(F1)×4096(F2),累加次数112次。
优选地,所述差异代谢物的筛选是将所述1H-NMR核磁共振谱图进行分段积 分处理,对谱图的积分面积总和进行归一化处理,再经数据中心化处理后依次进 行主成分分析与偏最小二乘判别分析,得PLS-DA模型,通过载荷模型的变量重 要性因子VIP>1筛选出差异代谢物。
优选地,所述分段积分处理是将所述核磁共振谱图中δH 0.5-10ppm进行分段 积分,积分区间为0.02ppm。
对比现有技术,本发明的有益效果为:
1、首次联合使用3种检测方法对骆驼蓬植物进行代谢组学分析,可以确定 植物胁迫的类型;且应用多种分析平台获取的化学成分种类更加丰富,同时获取 有机和无机代谢物,代谢轮廓更加清晰,更有利于植物抗逆性研究。
2、利用植物代谢组学方法分析得到不同地区的骆驼蓬植物样本中抗氧化活 性的影响因素。
3、首次使用代谢组学方法研究骆驼蓬的抗氧化活性与矿质元素、代谢物的 关系。
附图说明
图1为代表两个地区骆驼蓬的甲醇提取物获取的1H-NMR核磁谱图;(A)玛 纳斯(MS)、(B)福海(FH);1、缬氨酸;2、苏氨酸;3、丙氨酸;4、赖氨酸;5、 乙酸;6、脯氨酸;7、4-羟基异亮氨酸;8、琥珀酸;9、苹果酸;10、天冬酰胺; 11、胆碱;12、磷酰胆碱;13、甜菜碱;14、蔗糖;15、β-葡萄糖;16、鸭嘴花 碱;17、α-葡萄糖;18、鸭嘴花碱酮;
图2为基于两个地区的骆驼蓬的1H-NMR核磁谱图构建的PLS-DA模型得分 图;
图3为基于两个地区的骆驼蓬的1H-NMR核磁谱图构建的PLS-DA模型线性 载荷图;
图4为3种检测方法获取两个地区具有显著性差异数据的聚类热图;
图5为3种检测方法获取两个地区具有显著性差异数据的相关性分布热图。
具体实施方式
下面通过实施例进一步描述本发明,但是本发明不受这些实施例的限制。凡 在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本 发明的保护范围之内。
以下实施例中的骆驼蓬植物样本分别选自玛纳斯和福海地区。
实施例1
矿质元素的含量分析
将两个不同地区的骆驼蓬植物样本粉碎后过100目筛,分别精密称取 0.1000g放入聚四氟乙烯消解罐中,加入2mL浓硝酸静置4h后,盖上盖后,放 入反应釜中,反应釜移入梯度升温的恒温干燥箱中,当温度升至160℃恒温4h 后,温度降至室温后将样品取出,取出的样品放入通风厨中赶酸,将赶酸后的消 解液转移至10mL的离心管中,少量多次的清洗消解罐,并用超纯水定容至10mL, 混匀后,使用ICP-AES测定溶液中的矿质元素的含量。同时制备全程序试剂空白 溶液和两份植物标准样品灌木枝叶(GBW 07602:GSV-1)及5份骆驼蓬样品 (PH-188)。元素的含量通过公式(1)计算:
C=cv/g (1)
其中,c是消解后稀释溶液的浓度,v是稀释后的溶液的体积,g是样品的质 量,C是矿质元素的含量(mg/g)。
总有机碳和氮的测定使用元素分析仪,每份样本称取3mg,使用锡舟紧密包 裹后放入样品池中,自动测定,测定结果是百分含量。
实施例2
骆驼蓬提取物DPPH抗氧化活性的测试
样品制备:分别精密称取2.0000g粉碎干燥的两个地区的骆驼蓬植物样本, 加入100mL甲醇分三次超声提取,提取液离心分离10min后,合并上清液,依 次旋蒸、冷冻干燥得到浸膏。称取冷冻干燥后的骆驼蓬甲醇提取物(即上述浸膏) 10mg用甲醇配制成浓度为10mg/mL的样品溶液备用。
取0.2mL(10mg/mL)的样品溶液,加入用甲醇配制的DPPH(23.4μg/mL) 0.2mL溶液中后摇匀,置暗处静置30min;用无水甲醇作参比液,在516nm下 测定其吸光值Aj;同时测定DPPH(23.4μg/mL)甲醇溶液和等量的无水甲醇 溶液混合液的吸光值Ai;再测定0.2mL样品液与等量无水甲醇混合液的吸光值 Ac。根据公式(2)计算样品对DPPH的抑制率IP:
IP=(1-(Ai-Aj)/Ac)×100 (2)
式中:Ac为未加测定液时DPPH的吸光度;
Aj为测定液的吸光度;
Ai为测定液加DPPH的吸光度;
IP为DPPH的抑制率。
Ec50是指将DPPH自由基(23.4μg/mL)的初始浓度降低50%时的所需 要的抗氧化剂的量。分别取两个不同地区的骆驼蓬甲醇提取物,用甲醇溶解并配 制成不同浓度的供试品溶液,从供试品溶液中分别取0.2mL,再分别与0.2mL 的DPPH自由基(23.4μg/mL)的甲醇溶液混合,在避光处反应30min后,在516 nm处测定样品的吸光度。取浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL呈等比例增 加的供试品溶液与DPPH(23.4μg/mL)甲醇溶液进行反应,在不同浓度下提 取液处于稳定状态时(30min)的IP值绘制曲线,来计算它们的半抑制浓度Ec50。
实施例3
骆驼蓬样品中的代谢物量化分析
精密称取10mg实施例2中的两个不同地区的浸膏,分别加入0.3mL磷酸 缓冲溶液(pH=6.0)、0.2mL的TSP(1mmol四甲基硅烷,NMR内标)的重 水溶液、0.2mLNaN3(10mmol)溶液,混匀后超声,离心分离,取0.6mL上清 液用移液器取转入5mm的核磁管中,进行NMR分析。每个样本平行备样3份。
NMR实验:1HNMR测定样品均在500MHz NMR谱仪、25℃恒温条件测 定,1H和13C核共振频率分别为500.13MHz和100.13MHz;一维氢谱所采用 的是压制水峰的noesygppr1d脉冲序列,水峰压制功率为41dB(Bruker nomenclature),脉冲延迟时间2s,扫描次数为128,谱宽12ppm,脉冲时间9.8 μs,采样时间2.72s,弛豫时间2.0s,采样数据点32768,FID分辨率0.18Hz, FID以增宽因子为0.3Hz指数窗函数进行处理。相位调节、基线调节及峰校正均 为手动。甲醇提取水溶性代谢物核磁测定采用预饱和技术压制水峰,用氘代水进 行锁场,内标为TSP。结果如图1所示。
1H NMR谱图叠加严重,大量的信号给识别带来了困难,通过使用二维核磁 实验对骆驼蓬每个部位的甲醇提取物进行信号采集,便于代谢物的指认和归属, 包括COSY、HSQC和HMBC,COSY谱图中谱宽为5000Hz,采样点数分别是 400(F1)×4096(F2),累加次数24次;HSQC谱图1H谱宽为5000Hz,13C谱 宽为22638Hz,采样点数分别是256(F1)×2048(F2),累加次数60次;HMBC 谱图中1H谱宽为5000Hz,13C谱宽为30184Hz,采样点数分别是256(F1)×4096 (F2),累加次数112次。被指认1H NMR谱的代谢物,使用代谢物轮廓定量分析 方法选择合适的定量峰对13个代谢物的特征峰进行积分,以标准物质d4-TSP的 峰强度为1,与其对比根据公式进行计算得到代谢物的含量,选取积分区间分别 为δH 1.48、3.01、4.12、2.22、4.31、3.23、5.42、4.65、7.10、5.21位置的质子 信号峰作为共有峰,计算积分面积。根据以下的定量公式(3)和(4)进行计 算,得到量化代谢物:
其中,Mx和MStd分别为待测样品和参比样品的质子摩尔质量数,Ax和 Astd分别为待测样品和参比品的积分面积,Nx和Nstd分别为待测样品和参比品 的质子数,Wx和Wstd分别为混合物样品和参比样品的质量,C是代谢物的含 量(mg/g)。
NMR数据分析:将所有的1H NMR核磁图谱均采用TOPSPIN3.2(Bruker Biospin)软件进行处理,手动校正基线和相位,化学位移以TSP(δH=0.00)定 标后的谱图导入MestReNova(version 8.0.1,Mestrelab Research,Santiago de Compostella,Spain)软件进行处理,校准相位调整基线后,谱图中δH 0.5-10ppm 进行分段积分,积分区间为0.02ppm。其中δH 4.71-5.05ppm(残余水峰)不进行 积分。将谱图的积分面积总和进行归一化处理后生成Excel数据文件。将其导入 Matlab(Umetrics,Umea,Sweden)软件中,数据中心化(mean center)处理后进行 PCA(Principal component analysis)和PLS-DA(partialleast squares discriminant analysis)分析,通过载荷模型的变量重要性因子VIP>1(Variable importance factor)筛选出差异代谢物。PLS-DA模型均通过置换检验验证其有效性,对部 分差异代谢产物的相对含量数据进行方差分析ANOVA(Analysis ofvariance),t 检验,采用邓肯式新复极差法(Duncan)校正p值。两个地区的骆驼蓬的 1H-NMR核磁谱图构建的PLS-DA模型得分图如图2所示,两个地区的骆驼蓬的 1H-NMR核磁谱图构建的PLS-DA模型线性载荷图如图3所示。
对实施例1-3中两个地区的3组定量数据如表1所示。
表1玛纳斯(MS)和福海(FH)地区骆驼蓬叶片中矿物质元素、代谢物、DPPH抗氧化活性定量数据
注:同一行中不同小写字母表示具有显著性差异(P<0.05),不同大写字母表示具有极其 显著性差异(P<0.01)。
从表1可以得出,农业区MS的骆驼蓬中,N、P、K的含量较高以外,Na 的含量要高出牧区FH地区2倍多;而牧区FH的样品中C含量远远高于MS地 区,说明牧区的样品中有机质含量高。而对比两个地区样品的DPPH抗氧化活性, FH地区的样品Ec50小于MS地区,抗氧化活性强。对比两个地区的代谢物,发 现FH地区的样品中,甜菜碱和蔗糖的含量均高于MS地区,这也说明FH地区 的样品中碳水化合物含量高于MS地区;代谢物中琥珀酸和缬氨酸的含量MS地 区的样品均远远高于FH地区,正好印证了MS地区高Na含量。农业区MS中 由于使用化学肥料,导致N、P和K的含量高于FH牧区,因此植物的抗氧化活 性明显降低。
对实施例1-3中两个地区的3组数据进行聚类热图分析
进一步采用聚类热图分析,对上述14个差异成分在不同地区的分布情况进 行表征,结果如图4所示。由此可知:MS聚集为一类,其中N、P、Mg、Na及 DPPH的Ec50含量高;其次,FH地区的样本聚集为一类,其中甜菜碱、蔗糖和 C的含量高。骆驼蓬的差异性成分地区分布中可以得出,农业区MS中植物的抗 氧化活性指标Ec50的值越大,其活性越弱,这与植物中N、P和Na含量有一定 的关系。
从相关性热谱图5中可知:植物的Ec50与骆驼蓬中N、P、K、Na的含量 呈正相关,与蔗糖、甜菜碱和C的含量呈现负相关关系。Ec50越小,植物的抗 氧化活性越大。
以上结果显示,两个地区的骆驼蓬植物中琥珀酸、缬氨酸的含量差异表明盐 胁迫是造成差异的主要因素;而两个地区的抗氧化活性的差异,说明化学肥料N、 P、K的施用是造成这种差异的主要因素。因此对于野外植物样本,使用这种多 平台组合技术有利于植物复杂抗逆性研究。
综上,可以通过核磁(NMR)、电感耦合等离子体原子发射(ICP-AES)、分 光光度联合技术,建立不同地区骆驼蓬植物的的抗氧化活性与代谢物、矿质元素 的含量之间的相关关系来判断该地区骆驼蓬植物胁迫的状况。
以上公开的仅为本发明的具体实施例,但是,本发明实施例并非局限于此, 任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种不同产地骆驼蓬植物抗氧化活性的分析方法,其特征在于,包括以下步骤:
对不同产地的骆驼蓬进行分析,获得骆驼蓬提取物中代谢物信息、矿质元素含量数据及所述骆驼蓬提取物对DPPH自由基的半抑制浓度数据;并根据采集到的核磁共振谱图数据筛选出差异代谢物,分析所述半抑制浓度与所述矿物质元素含量、所述差异代谢物含量的相关性;
所述半抑制浓度是利用分光光度法得到不同浓度骆驼蓬甲醇提取液对DPPH自由基的抑制率曲线,再计算得到半抑制浓度;
所述代谢物信息是利用一维核磁共振波谱法对骆驼蓬甲醇提取物进行信号采集,确定代谢物类型;再使用代谢轮廓定量分析方法对不同代谢物的特征峰进行积分,最后计算得到代谢物含量;所述信号采集是通过二维核磁共振波谱法获得所述骆驼蓬甲醇提取物的COSY、HSQC及HMBC谱图;其中,所述COSY谱图中谱宽为5000Hz,采样点数分别是400(F1)×4096(F2),累加次数24次;所述HSQC谱图1H谱宽为5000Hz,13C谱宽为22638Hz,采样点数分别是256(F1)×2048(F2),累加次数60次;所述HMBC谱图中1H谱宽为5000Hz,13C谱宽为30184Hz,采样点数分别是256(F1)×4096(F2),累加次数112次;
所述差异代谢物的筛选是将所述1H-NMR核磁共振谱图进行分段积分处理,对谱图的积分面积总和进行归一化处理,再经数据中心化处理后依次进行主成分分析与偏最小二乘判别分析,得PLS-DA模型,通过载荷模型的变量重要性因子VIP>1筛选出差异代谢物;
所述矿物质元素含量是利用电感耦合等离子体原子发射光谱法测定骆驼蓬经消解后的样品溶液获得。
2.根据权利要求1所述的不同产地骆驼蓬植物抗氧化活性的分析方法,其特征在于,所述甲醇提取物是将骆驼蓬植物样品与5倍量的甲醇溶液混合,超声提取后离心,得到的上清液依次浓缩、干燥得到。
3.根据权利要求1所述的不同产地骆驼蓬植物抗氧化活性的分析方法,其特征在于,所述分段积分处理是将所述核磁共振谱图中δH 0.5-10ppm进行分段积分,积分区间为0.02ppm。
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干燥方式对酸枣果肉活性物质及抗氧化能力的影响;杜晨晖等;《食品科学》;20191015;第41卷(第15期);第140-147页 * |
普卡必利的NMR研究;周中高等;《波谱学杂志》;20180315;第35卷(第1期);第119-127页 * |
柚皮素7-O-葡萄糖苷非对映异构体的NMR波谱分析;孙丽娟等;《波谱学杂志》;20171215;第34卷(第4期);第465-473页 * |
柳树抗逆性研究进展;杨庆山;《林业科技通讯》;第7卷;24-27 * |
瓜馥木中一种黄酮的NMR表征;傅春燕等;《湖南师范大学自然科学学报》;20150128;第38卷(第1期);第45-49页 * |
美国豆芋地上部位有效成分及α-葡萄糖苷酶抑制活性研究;安家炜等;《核农学报》;20141227;第28卷(第12期);第2275-2282页 * |
蔡德龙等.中国硅肥.《中国硅肥》.湖北科学技术出版社,2017,(第1版),第337-338页. * |
薰衣草花穗中几种金属元素含量分析;李茵萍等;《光谱实验室》;20130125;第30卷(第1期);第19-22页 * |
黑大豆种质抗氧化能力及其与总酚和花色苷含量的关系;徐金瑞;张名位;刘兴华;刘章雄;张瑞芬;孙玲;邱丽娟;;中国农业科学(第08期);1545-1547 * |
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CN113109280A (zh) | 2021-07-13 |
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