CN108333206A - 一种拟穴青蟹产地的鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于代谢组学研究手段进行拟穴青蟹产地识别的方法，属于拟穴青蟹产地鉴别技术领域，本发明的主要步骤在于先选择若干个不同产地的拟穴青蟹，对拟穴青蟹肌肉的水相提取物中的小分子代谢物组成进行分析，然后采用OPLS‑DA对1H NMR数据进行多变量统计分析，建立OPLS‑DA模型获得不同产地的拟穴青蟹的特征性代谢物，利用特征性代谢物区分不同产地的拟穴青蟹，与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明通过核磁共振氢谱法测定不同产地拟穴青蟹总提取物中小分子物质的变化进行分析，从而对拟穴青蟹产地进行识别，为拟穴青蟹溯源提供了一条新途径。
Description
技术领域
本发明涉及基于代谢组学研究手段进行拟穴青蟹产地识别的方法，属于拟穴青蟹产地鉴别技术领域。
背景技术
拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是我国东南沿海主要的青蟹品种，自然分布在江苏省到海南省之间。不同地域来源的青蟹有着不同的口感和质量。因此，许多消费者通常根据青蟹的产地来判断蟹的质量，特殊产地的青蟹也就有了更高的商品价值。一般而来，消费者根据青蟹的色泽和大小来鉴别其产地，通常从南到北，青蟹的个体逐渐变小，而甲壳颜色逐渐变浅。但这种方法带有主观性，而且青蟹的大小和甲壳的色泽受到多种因素的影响，实际上很难对拟穴青蟹的产地进行准确鉴别。Overton等(1997)曾测定了不同产地的5种锯缘青蟹(S.serrata)的22种形态特征指标，但这些指标并不能把这5种锯缘青蟹全部区分开。因此，青蟹的形态特征并不能有效地鉴别锯缘青蟹的产地。尽管分子生物学方法能可靠地把青蟹属分为4个种：S.serrata、S.paramamosain、S.olivacea和S. tranquebarica，但同一种内的青蟹具有几乎完全一样的遗传背景，因此，分子生物学方法也不适用于不同产地拟穴青蟹的鉴别。
因此，有必要开发一些检测方法精确简便，且能反映出不同产地拟穴青蟹的具体差异的方法，以便为拟穴青蟹产地识别提供一条新途径。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种基于NMR的代谢组学研究手段对不同产地的拟穴青蟹进行分类识别的方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该拟穴青蟹产地的鉴别方法，其特征在于：所述方法是先选择若干个不同产地的拟穴青蟹，对拟穴青蟹肌肉的水相提取物中的小分子代谢物组成进行分析，然后采用OPLS-DA对1H NMR数据进行多变量统计分析，建立OPLS-DA模型获得不同产地的拟穴青蟹的特征性代谢物；当需要检测某一来自上述产地的未知拟穴青蟹时，能够采用方案A或者方案B获知其产地信息：
其中方案A具体是：先对这一未知拟穴青蟹的水相提取物中的小分子代谢物的种类进行检测并计算相对含量，然后将数据导入OPLS-DA模型中，即可获得这一未知拟穴青蟹的产地信息；
方案B具体是：检测一个以上的特征性代谢物在这一未知拟穴青蟹中的存在情况，根据特征性代谢物的存在情况获知产地信息。
进一步地，建立所述OPLS-DA模型以获得不同产地的拟穴青蟹的特征性代谢物，具体是将OPLS-DA模型中一维1H-NMR的权重值|r|大于0.666的主成分进行ANOVA检验，结合P值判断差异表达代谢物，p<0.05为差异有统计学意义，获得若干个差异代谢物。
其中，所述产地选自慈溪、三门、霞浦和钦州。
具体地，所述鉴别方法包括如下步骤：
(1)待检测拟穴青蟹的预处理
将分别获取不同产地的待检测拟穴青蟹样品，清洗后，获取不同产地的拟穴青蟹游泳足的肌肉；
(2)破碎
分别称取不同产地的待检测拟穴青蟹肌肉样品加入冷甲醇水溶液进行细胞破碎；
(3)离心
离心具体步骤为：将步骤(2)破碎后的肌肉样品在10000r/min-15000r/min、0-4℃下离心，抽取上清液，残渣中再加入冷甲醇水溶液，振荡混匀，重复上述操作3～4次，合并上清液；
(4)真空挥发
将步骤(3)的上清液放入离心管中，真空下挥发甲醇；
(5)真空冷冻干燥
将步骤(4)中挥发甲醇后的肌肉提取液，先放入-20℃～的冰箱内冷冻12h，再冷冻干燥过夜，获得冻干粉；
(6)核磁谱采集
取上述真空冷冻干燥的样品加入磷酸缓冲溶液进行离心得到上清液，上清液在核磁共振仪为600MHz以上的核磁共振波谱仪进行拟穴青蟹肌肉小分子代谢物的检测，得到一维1H-NMR谱数据；
所述核磁共振技术鉴定参数如下：使用标准的Noesypr1D脉冲序列RD-90°-t1-90°-tm- 90°-ACQ采集一维1H NMR谱，在该序列中的等待时间RD为25s和混合时间tm为100ms施加强度约50Hz的低功率连续波进行水峰抑制，每一个样品的90°脉冲宽度均设置约10s，谱宽设置为20ppm，采样点数32，768，FID累加32次；
所述的拟穴青蟹特征小分子代谢物是延胡索酸、谷氨酰胺、三甲胺氧化物、2-吡啶甲醇、腺苷单磷酸、谷氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、肌苷单磷酸和丙氨酸；
(7)数据分析；
对待鉴定的样品的所有一维1H-NMR谱数据经傅立叶变换得到谱图，并依照COSY、TOCSY、HSQC和HMBC二维NMR谱对区分不同产地有显著贡献的代谢物进行了归属。以内标物(TSP，0ppm)对所有一维1H NMR进行化学位移定标，调整相位并校正基线之后，对NMR谱(0.80-9.50ppm)进行分段积分，积分区间为2.4Hz。去除残存的水信号(4.70-5.15 ppm)和甲醇信号(3.35-3.38ppm)所在的积分区间之后，对整个谱进行重量归一化。采用 SIMCA-P+软件对归一化的NMR数据进行OPLS-DA分析，该分析中选用了自动规格化的数据处理模式，并以该自动规格化的NMR数据作为X变量，而分组信息作为Y变量，采用7倍交叉验证和进一步的交叉验证的方差分析来确保OPLS-DA模型的可靠性，R2和 Q2值可分别指示模型的可预测能力和质量，而CV-ANOVA的分析结果也同时符合p< 0.05时，模型才可靠。在对自动规格化的NMR数据作进一步的回溯转换处理后，再利用 MATLAB软件可获得OPLS-DA模型的载荷图；载荷图上的每一个点用颜色来表征，不同颜色对应于自动规格化的权重值，权重即表示回溯转换处理后的变量(X)和分组变量(Y)之间的皮尔森积差相关系数(r)；采用相关系数的绝对值(|r|)，只有当|r|大于0.666时，其相应的代谢物才对组间区分具有显著性贡献(n＝8，p<0.05)；
(8)样品鉴别
若待检测拟穴青蟹的样品中含有最高水平的丙氨酸和延胡索酸，含有最低水平的腺苷单磷酸和、2-吡啶甲醇，则该样品为慈溪产地的拟穴青蟹；
若待检测拟穴青蟹的样品中含有最高水平的谷氨酰胺、酪氨酸和苯丙氨酸，则该样品为三门产地的拟穴青蟹；
若待检测拟穴青蟹的样品中含有最高水平的2-吡啶甲醇，但含有最低水平的丙氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸和苯丙氨酸，则该样品为霞浦产地的拟穴青蟹；
若待检测拟穴青蟹的样品中含有最高水平的腺苷单磷酸，但含有最低水平的肌苷单磷酸，则该样品为钦州产地的拟穴青蟹。
优选地，所述步骤(2)和(3)中所使用的甲醇水溶液，其中甲醇与水的体积比为2：1。
更进一步地，所述步骤(6)中的磷酸缓冲溶液的制备方法为：称取0.4728g的NaH2PO4·2H2O，2.7663g的K2HPO4·3H2O，0.1g的NaN3和0.001g的三甲基甲硅烷基丙酸，溶于50mL的重水中，再用双蒸水补足至100mL。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明通过核磁共振氢谱法测定不同产地拟穴青蟹总提取物中小分子物质的变化进行分析，从而对拟穴青蟹产地进行识别，为拟穴青蟹溯源提供了一条新途径。
附图说明
图1为基于代谢组学技术鉴别拟穴青蟹产地的方法流程图；
图2为实施例一中不同产地拟穴青蟹肌肉提取物的1H NMR谱；
图3为实施例一中慈溪拟穴青蟹与三门、霞浦和钦州拟穴青蟹肌肉提取物的OPLS-DA 得分图(左)和相关系数图(右)；
图4为实施例一中三门、霞浦和钦州拟穴青蟹肌肉提取物的OPLS-DA得分图(左)和相关系数图(右)；
图5为实施例一中与产地显著相关的代谢物的浓度变化。
具体实施方式
以下通过结合附图、序列表及实施例对本发明作进一步说明。
实施例一
如图1所示，本实施例中通过NMR技术结合OPLS-DA分析对来自浙江省慈溪(CX)、三门(SM)、福建省霞浦(XP)和广西省钦州(QZ)拟穴青蟹进行鉴别的方法，依次包括预处理、破碎、离心、挥发甲醇、真空冷冻干燥、核磁谱采集、数据分析和鉴别，其具体步骤如下：
预处理步骤为：分别获取不同产地的拟穴青蟹游泳足的肌肉。
破碎步骤为：分别取4个产地的拟穴青蟹肌肉约400mg至2mL离心管中，加入1mL 冷甲醇水溶液(甲醇水的体积比＝2：1)，于20Hz下进行细胞破碎90s，实现细胞的破碎。每个样品平行数目为8。
离心步骤为：将上述破碎后的样品进行离心，转速12,000g，4℃，10min，获得上清液，残渣中再加入冷甲醇水溶液，振荡提取1次，于12,000g和4℃下离心10min，得到第二次上清液，合并这两个上清液。
真空挥发步骤为：把上清液，放入真空干燥仪，真空度0.095MPa，以去除甲醇。
真空冷冻干燥为：将上述挥发甲醇后的肌肉提取液，先放入-20℃的冰箱内冷冻12h，再冷冻干燥过夜，获得冻干粉。
核磁谱采集步骤为：取上述肌肉提取物的冻干粉，加入550μL磷酸缓冲溶液，于12,000 g和4℃下离心10min，取500μL上清液于直径为5mm的NMR管内。使用600MHz 核磁共振波谱仪采集一维1H-NMR谱和二维NMR谱。所得代表性的4个产地拟穴青蟹肌肉提取物的一维1H-NMR谱见图2。
数据分析步骤为：对待鉴定的样品的所有一维1H-NMR谱数据经傅立叶变换得到谱图，并依照COSY、TOCSY、HSQC和HMBC二维NMR谱对区分不同产地有显著贡献的代谢物进行了归属。以内标物(TSP，0ppm)对所有一维1H NMR进行化学位移定标，调整相位并校正基线之后，对NMR谱(0.80-9.50ppm)进行分段积分，积分区间为2.4Hz。去除残存的水信号(4.70-5.15ppm)和甲醇信号(3.35-3.38ppm)所在的积分区间之后，对整个谱进行重量归一化。采用SIMCA-P+软件对归一化的NMR数据进行OPLS-DA分析，该分析中选用了自动规格化的数据处理模式，并以该自动规格化的NMR数据作为X变量，而分组信息作为Y变量。采用7倍交叉验证和进一步的交叉验证的方差分析来确保OPLS-DA模型的可靠性。结果表明6个OPLS-DA模型的Q2值在0.61to 0.87(图3，图4)，CV-ANOVA 得到的p值都小于0.05，表明所有模型都是可靠的，即4个产地的拟穴青蟹的区分具有显著意义。经过进一步地对自动规格化的NMR数据作回溯转换处理后，再利用MATLAB软件可获得OPLS-DA模型的载荷图。就获得了对区分不同产地具有显著意义的代谢物。
鉴别，即基于上述数据分析得出不同产地拟穴青蟹的鉴别方法，步骤包括：拟穴青蟹肌肉提取物的NMR数据的OPLS-DA分析，根据OPLS-DA得分图区分不同产地的拟穴青蟹，根据OPLS-DA相关系数图获得拟穴青蟹不同产地的特征性代谢物。结果发现，与三门(SM)拟穴青蟹相比，慈溪(CX)拟穴青蟹含有较高水平的延胡索酸，较低水平的谷氨酰胺和一个未知代谢物U1；与(霞浦)XP拟穴青蟹相比，慈溪(CX)拟穴青蟹含有较高水平的延胡索酸，较低水平的三甲胺氧化物(TMAO)、2-吡啶甲醇和腺苷单磷酸(AMP)和U1；而与钦州(QZ)拟穴青蟹相比，慈溪(CX)拟穴青蟹含有较较低水平的AMP(图3)。与三门(SM) 拟穴青蟹相比，(霞浦)XP拟穴青蟹含有较高水平的U1，但较低水平的谷氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸和苯丙氨酸；同样与三门(SM)拟穴青蟹相比，钦州(QZ)拟穴青蟹含有较高水平的苯丙氨酸，但较低水平的肌苷单磷酸(IMP)。此外，相比于(霞浦)XP拟穴青蟹，钦州(QZ) 拟穴青蟹含有较高水平的丙氨酸和谷氨酰胺，但较低水平的2-吡啶甲醇(图4)。
通过对这些显著差异的代谢物的定量分析表明(图5)，在4个产地的拟穴青蟹中，慈溪(CX)拟穴青蟹含有最高水平的丙氨酸和延胡索酸，但含有最低水平的AMP和、2-吡啶甲醇；三门(SM)拟穴青蟹含有最高水平的谷氨酰胺、酪氨酸和苯丙氨酸；(霞浦)XP拟穴青蟹含有最高水平的2-吡啶甲醇，但含有最低水平的丙氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸和苯丙氨酸；而钦州(QZ)拟穴青蟹含有最高水平的AMP，但含有最低水平的IMP。
Claims (6)
1.一种拟穴青蟹产地的鉴别方法，其特征在于：所述方法是先选择若干个不同产地的拟穴青蟹，对拟穴青蟹肌肉的水相提取物中的小分子代谢物组成进行分析，然后采用OPLS-DA对1H NMR数据进行多变量统计分析，建立OPLS-DA模型获得不同产地的拟穴青蟹的特征性代谢物；当需要检测某一来自上述产地的未知拟穴青蟹时，能够采用方案A或者方案B获知其产地信息：
其中方案A具体是：先对这一未知拟穴青蟹的水相提取物中的小分子代谢物的种类进行检测并计算相对含量，然后将数据导入OPLS-DA模型中，即可获得这一未知拟穴青蟹的产地信息；
方案B具体是：检测一个以上的特征性代谢物在这一未知拟穴青蟹中的存在情况，根据特征性代谢物的存在情况获知产地信息。
2.根据权利要求1所述的拟穴青蟹产地的鉴别方法，其特征在于建立所述OPLS-DA模型以获得不同产地的拟穴青蟹的特征性代谢物，具体是将OPLS-DA模型中一维1H-NMR的权重值|r|大于0.666的主成分进行ANOVA检验，结合P值判断差异表达代谢物，p<0.05为差异有统计学意义，获得若干个差异代谢物。
3.根据权利要求1所述的拟穴青蟹产地的鉴别方法，其特征在于所述产地是慈溪、三门、霞浦和钦州。
4.根据权利要求1～3任意一项权利要求所述的鉴别方法，其特征在于：所述鉴别方法包括如下步骤：
(1)待检测拟穴青蟹的预处理
将分别获取不同产地的待检测拟穴青蟹样品，清洗后，获取不同产地的拟穴青蟹游泳足的肌肉；
(2)破碎
分别称取不同产地的待检测拟穴青蟹肌肉样品加入冷甲醇水溶液进行细胞破碎；
(3)离心
离心具体步骤为：将步骤(2)破碎后的肌肉样品在10000r/min-15000r/min、0-4℃下离心，抽取上清液，残渣中再加入冷甲醇水溶液，振荡混匀，重复上述操作3～4次，合并上清液；
(4)真空挥发
将步骤(3)的上清液放入离心管中，真空下挥发甲醇；
(5)真空冷冻干燥
将步骤(4)中挥发甲醇后的肌肉提取液，先放入-20℃～的冰箱内冷冻12h，再冷冻干燥过夜，获得冻干粉。
(6)核磁谱采集
取上述真空冷冻干燥的样品加入磷酸缓冲溶液进行离心得到上清液，上清液在核磁共振仪为600MHz以上的核磁共振波谱仪进行拟穴青蟹肌肉小分子代谢物的检测，得到一维1H-NMR谱数据；
所述核磁共振技术鉴定参数如下：使用标准的Noesypr1D脉冲序列RD-90°-t1-90°-tm-90°-ACQ采集一维1H NMR谱，在该序列中的等待时间RD为25s和混合时间tm为100ms施加强度约50Hz的低功率连续波进行水峰抑制，每一个样品的90°脉冲宽度均设置约10s，谱宽设置为20ppm，采样点数32，768，FID累加32次；
所述的拟穴青蟹特征小分子代谢物是延胡索酸、谷氨酰胺、三甲胺氧化物、2-吡啶甲醇、腺苷单磷酸、谷氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、肌苷单磷酸和丙氨酸；
(7)数据分析
对待鉴定的样品的所有一维1H-NMR谱数据经傅立叶变换得到谱图，并依照COSY、TOCSY、HSQC和HMBC二维NMR谱对区分不同产地有显著贡献的代谢物进行了归属。以内标物(TSP，0ppm)对所有一维1H NMR进行化学位移定标，调整相位并校正基线之后，对NMR谱(0.80-9.50ppm)进行分段积分，积分区间为2.4Hz；去除残存的水信号(4.70-5.15ppm)和甲醇信号(3.35-3.38ppm)所在的积分区间之后，对整个谱进行重量归一化。采用SIMCA-P+软件对归一化的NMR数据进行OPLS-DA分析，该分析中选用了自动规格化的数据处理模式，并以该自动规格化的NMR数据作为X变量，而分组信息作为Y变量，采用7倍交叉验证和进一步的交叉验证的方差分析来确保OPLS-DA模型的可靠性，R2和Q2值可分别指示模型的可预测能力和质量，而CV-ANOVA的分析结果也同时符合p<0.05时，模型才可靠；在对自动规格化的NMR数据作进一步的回溯转换处理后，再利用MATLAB软件可获得OPLS-DA模型的载荷图；载荷图上的每一个点用颜色来表征，不同颜色对应于自动规格化的权重值，权重即表示回溯转换处理后的变量(X)和分组变量(Y)之间的皮尔森积差相关系数(r)；采用相关系数的绝对值(|r|)，只有当|r|大于0.666时，其相应的代谢物才对组间区分具有显著性贡献(n＝8，p<0.05)；
(8)样品鉴别
若待检测拟穴青蟹的样品中含有最高水平的丙氨酸和延胡索酸，含有最低水平的腺苷单磷酸和、2-吡啶甲醇，则该样品为慈溪产地的拟穴青蟹；
若待检测拟穴青蟹的样品中含有最高水平的谷氨酰胺、酪氨酸和苯丙氨酸，则该样品为三门产地的拟穴青蟹；
若待检测拟穴青蟹的样品中含有最高水平的2-吡啶甲醇，但含有最低水平的丙氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸和苯丙氨酸，则该样品为霞浦产地的拟穴青蟹；
若待检测拟穴青蟹的样品中含有最高水平的腺苷单磷酸，但含有最低水平的肌苷单磷酸，则该样品为钦州产地的拟穴青蟹。
5.根据权利要求4所述的鉴别方法，其特征在于：所述步骤(2)和(3)中所使用的甲醇水溶液，其中甲醇与水的体积比为2：1。
6.根据权利要求4所述的鉴别方法，其特征在于：所述步骤(6)中的磷酸缓冲溶液的制备方法为：称取0.4728g的NaH2PO4·2H2O，2.7663g的K2HPO4·3H2O，0.1g的NaN3和0.001g的三甲基甲硅烷基丙酸，溶于50mL的重水中，再用双蒸水补足至100mL。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20180727 |