CN103383352A - 一种柚皮苷和/或新橙皮苷的近红外透射光谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种柚皮苷和/或新橙皮苷的近红外透射光谱检测方法，包括以下步骤：步骤1，取含有柚皮苷和/或新橙皮苷的中药材，加5-15倍量的碱水煎煮，得到煎煮液，经过滤得到待测液；步骤2，待测液用近红外光谱仪扫描得到近红外光谱数据；步骤3，根据预先制作的校正模型测定待测液中柚皮苷和/或新橙皮苷的含量。

Description

一种柚皮苷和/或新橙皮苷的近红外透射光谱检测方法

技术领域

本发明属于医药、化学领域，具体涉及枳壳或枳实提取过程中柚皮苷和/或新橙皮苷含量的近红外光谱检测方法及其应用。该方法既可分别检测柚皮苷或新橙皮苷的含量，也可同时检测柚皮苷和新橙皮苷的含量。

背景技术

枳实(Fructus Aurantii Immaturus)和枳壳(Fructus Aurantii)分别是芸香科植物酸橙(Citrus aurantiumL)及其栽培变种或甜橙(Citrus sinensis Osbeck)的干燥未成熟和成熟的果实。其化学成分为黄酮类、生物碱类、挥发油类等，其中以柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷等黄酮类物质起主要药理作用。药理研究表明，枳壳对胃肠道、心血管、子宫等方面有不同的调节作用。相比较而言，在枳壳黄酮类成分中柚皮苷和新橙皮苷的含量较高且较稳定。然而，不同植物来源的枳壳的柚皮苷和新橙皮苷的含量变化较大。

目前，柚皮苷和/或新橙皮苷的含量测定主要为高效液相色谱法(HPLC法)，具有定量准确，重现性好的特点，但是一般需要复杂的前处理，分析时间长，难以在生产过程中对其的含量进行有效的在线监测。因此需要建立一种快速、简便的检测方法。

近红外(near infrared，NIR)光谱分析是近年迅速发展起来的一种快速检测方法，它无需对样品做复杂的预处理即可直接对多种成分含量同时进行测定，具有快速、方便、无污染、非破坏性等优点，已在众多工业领域的过程分析和质量控制中得到应用。

近红外技术预测的准确度主要取决于建模前所采用的测定方法的准确度，还与仪器系统误差，测量环境(温湿度变化大小)、建模样品的数量、样品的代表性及时效性有关。

本研究利用近红外透射技术，将四川产枳壳药材作为提取样本，采用碱水提取法，研究NIR光谱在中药水提过程的分析应用：分别采用矢量归一化和多元散射校正(MSC)预处理方法，结合偏最小二乘法(PLS)建立一种柚皮苷、新橙皮苷快速、简便的定量分析方法，可以指导生产过程中柚皮苷和/或新橙皮苷含量的实时监控，同时可作为其他中药材提取液含量快速分析的借鉴，具有重要的研究意义和应用前景。

发明内容

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种快速检测柚皮苷和/或新橙皮苷含量的近红外光谱法，具体来说，该方法既可分别检测柚皮苷或新橙皮苷的含量，也可同时检测柚皮苷和新橙皮苷的含量。

本发明的检测方法包括以下步骤：

步骤1，取含有柚皮苷和/或新橙皮苷的中药材，加5-15倍量的碱水煎煮，得到煎煮液，经过滤得到待测液；

步骤2，待测液用近红外光谱仪扫描得到近红外光谱数据；

步骤3，根据预先制作的校正模型测定待测液中柚皮苷和/或新橙皮苷的含量。

其中步骤1所述含有柚皮苷和/或新橙皮苷的中药材包括枳实，枳壳、陈皮、青皮、化橘红、橘红、佛手等，优选枳壳、枳实。所述加碱水煎煮采用pH9～12的氢氧化钠水溶液煎煮，煎煮1-4次，优选2-3次，每次使用的碱水为药材的6-10倍量，提取液经过过滤得到含有柚皮苷和/或新橙皮苷的待测液。

其中步骤3所述预先制作的校正模型，通过如下方法建立：

(1)收集含有柚皮苷和/或新橙皮苷的中药材提取液，得到校正集样本；

(2)用HPLC法测定校正集样本的柚皮苷和/或新橙皮苷含量；

(3)用近红外光谱仪扫描校正集样本，得到校正集样本的近红外光谱数据，选择合适的谱段区间和预处理方法，获取特征近红外光谱数据；

(4)构建校正集样本柚皮苷和/或新橙皮苷含量与特征近红外光谱数据之间关系的校正模型；

(5)取柚皮苷和/或新橙皮苷含量已知的验证集样本，在与步骤(3)相同的条件下采集近红外光谱数据，根据建立的校正模型计算验证集样本的柚皮苷和/或新橙皮苷含量以及与真值相比较的测量误差。

其中步骤2及步骤3所述近红外光谱仪，其光谱条件是：

采用仪器的透射检测器，将样品溶液装入1mm的石英比色皿中扫描图谱，扫描波长范围为4000～12000cm^-1，扫描次数32次，分辨率8cm^-1，每份样品扫描3次，取其平均光谱。

优选地，柚皮苷在11995.6-7498.2cm^-1、6101.9-5446.2cm^-1和4601.5-4246.7cm^-1三个波段内，新橙皮苷在11995.6-5446.2cm^-1和4601.5-4246.7cm^-1波段分别进行数据分析。

其中步骤3所述建立的校正模型中，HPLC法色谱条件为：

色谱柱：Waters

C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈(A)-0.02％磷酸(B)二元梯度洗脱，0min：10％A，15～30min：20％A；平衡时间10min；检测波长为283nm，柱温30℃；流速为1mL/min；进样量为1μL。

根据本发明实施方式之一，近红外光谱预处理方法包括消除常数偏移量、矢量归一化、多元散射校正、一阶导数、二阶导数预处理方法。优选的光谱预处理方法为：矢量归一化和多元散射校正预处理法。

选择合适的光谱预处理技术能剔除干扰信号，提取关键信息，从而减少仪器噪音、基线不稳等因素带来的影响，提高模型的稳定性和预测的准确性。

发明人通过调整不断优化预处理方法，最终发现矢量归一化和多元散射校正预处理方法在所有预处理方法中内部交叉验证均方差(RMSECV)最小，交叉验证相关系数(R²)接近于1，说明模型具有良好的稳定性。

根据本发明实施方式之一，步骤(4)中校正模型的维数选择为9。

根据本发明实施方式之一，步骤(4)中校正模型的建立方法为偏最小二乘法。

根据本发明实施方式之一，步骤(5)中测量误差在20％以内，优选的，测量误差在10％以内。

发明人根据建立的校正模型计算验证集样本的柚皮苷和/或新橙皮苷含量与真值相比较的测量误差，可以验证校正模型的准确性，测量误差在10％以内，说明校正模型的预测值和真实值相对吻合，可证明校正模型有较好的预测能力。

本发明的检测方法，其检测条件是经过筛选获得的，筛选过程如下：

1仪器和试药

BRUKER TENSOR37型傅里叶变换近红外光谱仪(德国布鲁克公司)，配有定量分析软件为OPUS6.5(德国布鲁克公司)；Agilent1100高效液相色谱仪(AgilentTechnology，USA)；色谱柱Waters

C₁₈(5μm，4.6×250mm，美国Waters公司)；Mettler XS105电子天平(上海梅特勒托利多仪器有限公司)；柚皮苷和新橙皮苷标准品(中国药品生物制品检定所)；提取用水为纯化水，液相用水为超纯水(Millipore)，色谱乙腈(Merck，Germany)，其它试剂为分析纯。

枳壳药材产地四川，批号为20111210。

2方法

2.1标准品的制备

柚皮苷3.58mg，新橙皮苷2.79mg溶解于5ml容量瓶中，加甲醇定容，得储备液。分别吸取1，0.8，0.4，0.2和0.1ml储备液至2ml容量瓶中，加甲醇定容。配成浓度分别为0.358mg/mL、0.2864mg/mL、0.1432mg/mL、0.0716mg/mL、0.0358mg/mL的一系列标准品溶液。得柚皮苷的回归方程：Y＝19436X+11.673，R2＝0.9999；新橙皮苷的回归方程：Y＝22069X+11.77，R2＝0.9999。

2.2校正集及验证集样品的制备

称取700g枳壳药材，纯化水加NaOH调至pH＝11，加10倍量于10L圆底烧瓶中，加电热套煎煮，直至微沸一小时，每次煎煮每隔10min取10mL提取液，重复提取三次。三次煎煮共获得56个样品：前44个提取液样品作为校正集，其余12个提取样品作为验证集。

2.3HPLC法测定样品的含量

校正集及验证集提取液样品溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液和柚皮苷和新橙皮苷混合对照品溶液按照如下HPLC色谱条件进行测定：

色谱柱：Waters

C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈(A)-0.02％磷酸(B)二元梯度洗脱，0min：10％A，15～30min：20％A；平衡时间10min；检测波长为283nm，柱温30℃；流速为1mL/min；进样量为1μL。

2.4近红外光谱的采集

采用仪器的透射检测器，将样品溶液装入1mm的石英比色皿中扫描图谱，扫描波长范围为4000～12000cm^-1，扫描次数32次，分辨率8cm^-1，每份样品扫描3次，取其平均光谱，见图1。采用运用OPUS 6.5数据分析软件对数据进行处理和计算。

为避免建模波段过宽，含有的冗余信息过多，考虑到各成分分子结构存在差异，应选择柚皮苷和新橙皮苷各自最优的建模波段，分别在一定的区间内建立数学模型来确定近红外光谱和含量的关系有利于提高模型的预测准确性。在近红外透射光谱中，水分子在NIR图谱中的7000cm^-1和5100cm^-1附近有一个很强的倍频和合频吸收带，对其他分子吸收峰有干扰。因此，除去水分子有干扰及噪音较大的波段，结合含量信息丰富的谱段，最终优选柚皮苷在11995.6-7498.2cm^-1、6101.9-5446.2cm^-1和4601.5-4246.7cm^-1三个波段内，新橙皮苷在11995.6-5446.2cm^-1和4601.5-4246.7cm^-1波段分别进行数据分析。

2.5光谱预处理方法的选择

采用OPUS6.5数据分析软件，参考仪器自动优化功能，不断优化预处理方法，剔除干扰信号、提取关键信息的同时，比较了几种常用预处理方法，能提高模型的稳定性和预测的准确性，结果见表1和表2。交叉验证相关系数R²越接近于1，内部交叉验证均方差RMSECV越小说明预处理方法越好。最终确定对柚皮苷和新橙皮苷分别进行矢量归一化(vector normalization)预处理和多元散射校正(multiplicative scatter correction，MSC)预处理，在其所有预处理方法中RMSECV最小，分别为0.07和0.0652。校正模型的决定因子R²＝0.9974和R²＝0.9966，更接近于1。液体样本采用透射近红外色谱法采集光谱，选择预处理方法时通常考虑如何消除仪器自身引起的偏差和测量时间有关的光谱漂移引起的误差。进行矢量归一化预处理可以消除基线偏移；而多元散射校正(MSC)预处理能基本消除颗粒度的影响，可有效减少回归模型的最佳因子数，简化数学模型，使模型更稳定，更便于传递。

表1不同预处理方法对柚皮苷PLS校正模型RMSECV的影响

表2不同预处理方法对新橙皮苷PLS校正模型RMSECV的影响

2.6模型维数的确定

采用偏最小二乘法建立校正模型，维数大小的选择对模型的预测能力有很大的影响。在校正集样本一定的情况下，维数过多，引入过多的测量噪音，出现过拟合现象；维数过少，有用的信息包含不全从而导致模型预测能力差。采用内部交叉验证法，根据RMSECV值随维数的变化见图2，其最小的RMSECV值，对应的即为最佳维数，两种成分的最佳维数均为9，如图2所示。

2.7预测效果及评价

利用模型预测12份验证集样品柚皮苷和新橙皮苷的含量，并与高效液相法测定值进行比较，预测结果见表3和表4，验证校正模型的准确性。模型的预测集均方根误差(RMSEP)为0.0462和0.0827，平均相对偏差为6.57％，在10％以内，说明预测值和真实值相对吻合，可以看出模型有较好的预测能力。但仍有几个样品的预测值相对偏差大于10％(小于15％)。分析其原因，有些样品的浓度相对较低，导致部分结果存在较大误差，不排除仪器引起的原因。而且对于常规的近红外定量分析而言，建立模型的校正集样品越多，代表性越强，模型性能越优良。

图3为柚皮苷和新橙皮苷预测值和测定值的相关图。在建模过程中，运用软件自动优化功能，柚皮苷的校正模型剔除了2个异常点(46和56号)。

表3柚皮苷含量的HPLC测定值和NIR预测值

表4新橙皮苷含量的HPLC测定值和NIR预测值

本发明针对枳壳提取液中的柚皮苷和新橙皮苷两种成分，将44份样品的原始光谱分别经矢量归一化和多元散射校正预处理，选取不同波段：柚皮苷选取三个波段11995.6-7498.2cm^-1、6101.9-5446.2cm^-1和4601.5-4246.7cm^-1；新橙皮苷选取11995.6-5446.2cm^-1和4601.5-4246.7cm^-1两个波段，运用偏最小二乘法(PLS)分别建立定量校正模型并分析。结果：校正均方差(RMSEC)分别为0.0247和0.036，模型的决定因子R²＝0.9974和R²＝0.9966，内部交叉验证均方差(RMSECV)为0.07和0.0652，最佳维数均为9。用建立的校正模型对12份提取液样品中的柚皮苷和新橙皮苷进行了预测，预测误差均方差(RMSEP)分别为0.0462和0.0827。采用此近红外方法，枳壳提取液样品1次测量只需20s(扫描32次)，而HPLC测量1次至少要30min，大大节省了分析时间。该方法分析快速、简便，结果准确可靠。可以为近红外技术应用于枳壳等中药的提取生产和在线监控提供技术支持，对中药提取工艺优化和生产的质量控制具有很好的应用前景。

本发明的上述和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解。

附图说明

图1枳壳提取液样品近红外透射光谱图

图2柚皮苷(左)和新橙皮苷(右)RMSECV值随维数的变化图

图3柚皮苷(左)和新橙皮苷(右)校正集的预测值和真值相关图

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。

实施例1

称取700g枳壳药材，纯化水加NaOH调至pH＝9，加15倍量于10L圆底烧瓶中，加电热套煎煮，直至微沸一小时，煎煮每隔10min取10mL提取液，共获得6个样品，提取液样品溶液用0.45μm微孔滤膜过滤。

采用BRUKER TENSOR37型傅里叶变换近红外光谱仪(配有定量分析软件为OPUS6.5，德国布鲁克公司)，对所得6个样品进行近红外光谱分析，采用仪器的透射检测器，将样品溶液装入1mm的石英比色皿中扫描图谱，扫描波长范围为柚皮苷在11995.6-7498.2cm^-1、6101.9-5446.2cm^-1和4601.5-4246.7cm^-1三个波段内，新橙皮苷在11995.6-5446.2cm^-1和4601.5-4246.7cm^-1波段内，扫描次数32次，分辨率8cm^-1，每份样品扫描3次，取其平均光谱，运用OPUS 6.5数据分析软件对数据进行处理和计算。

将待测样品的特征近红外光谱数据输入本发明建立的校正模型，得预测值如下：

表5枳壳提取液NIR预测值

实施例2

称取500g枳实药材，纯化水加NaOH调至pH＝12，加5倍量于10L圆底烧瓶中，加电热套煎煮，直至微沸一小时，煎煮每隔20min取10mL提取液，重复提取四次，取9个样品，提取液样品溶液用0.45μm微孔滤膜过滤。

采用BRUKER TENSOR37型傅里叶变换近红外光谱仪(配有定量分析软件为OPUS6.5，德国布鲁克公司)，对所得9个样品进行近红外光谱分析，采用仪器的透射检测器，将样品溶液装入1mm的石英比色皿中扫描图谱，扫描波长范围为柚皮苷在11995.6-7498.2cm^-1、6101.9-5446.2cm^-1和4601.5-4246.7cm^-1三个波段内，新橙皮苷在11995.6-5446.2cm^-1和4601.5-4246.7cm^-1波段内，扫描次数32次，分辨率8cm^-1，每份样品扫描3次，取其平均光谱，运用OPUS 6.5数据分析软件对数据进行处理和计算。

将待测样品的特征近红外光谱数据输入本发明建立的校正模型，得预测值如下：

表6枳实提取液NIR预测值

实施例3

称取600g枳壳药材，纯化水加NaOH调至pH＝11，加10倍量于10L圆底烧瓶中，加电热套煎煮，直至微沸一小时，煎煮每隔20min取10mL提取液，重复提取三次，共获得9个样品，提取液样品溶液用0.45μm微孔滤膜过滤。

采用BRUKER TENSOR37型傅里叶变换近红外光谱仪(配有定量分析软件为OPUS6.5，德国布鲁克公司)，对所得9个样品进行近红外光谱分析，采用仪器的透射检测器，将样品溶液装入1mm的石英比色皿中扫描图谱，扫描波长范围为柚皮苷在11995.6-7498.2cm^-1、6101.9-5446.2cm^-1和4601.5-4246.7cm^-1三个波段内，新橙皮苷在11995.6-5446.2cm^-1和4601.5-4246.7cm^-1波段内，扫描次数32次，分辨率8cm^-1，每份样品扫描3次，取其平均光谱，运用OPUS 6.5数据分析软件对数据进行处理和计算。

将待测样品的特征近红外光谱数据输入本发明建立的校正模型，得预测值如下：

表7枳壳提取液NIR预测值

实施例4

称取500g青皮药材，纯化水加NaOH调至pH＝11，加8倍量于10L圆底烧瓶中，加电热套煎煮，直至微沸一小时，煎煮每隔20min取10mL提取液，重复提取三次，取5个样品，提取液样品溶液用0.45μm微孔滤膜过滤。

采用BRUKER TENSOR37型傅里叶变换近红外光谱仪(配有定量分析软件为OPUS6.5，德国布鲁克公司)，对所得5个样品进行近红外光谱分析，采用仪器的透射检测器，将样品溶液装入1mm的石英比色皿中扫描图谱，扫描波长范围新橙皮苷在11995.6-5446.2cm^-1和4601.5-4246.7cm^-1波段内，扫描次数32次，分辨率8cm^-1，每份样品扫描3次，取其平均光谱，运用OPUS 6.5数据分析软件对数据进行处理和计算。

将待测样品的特征近红外光谱数据输入本发明建立的校正模型，得新橙皮苷NIR预测值(mg·mL^-1)如下：0.3510、0.4382、0.5467、0.5831、0.6654。

实施例5

称取500g陈皮药材，纯化水加NaOH调至pH＝8，加10倍量于10L圆底烧瓶中，加电热套煎煮，直至微沸一小时，煎煮每隔20min取10mL提取液，重复提取两次，取5个样品，提取液样品溶液用0.45μm微孔滤膜过滤。

采用BRUKER TENSOR37型傅里叶变换近红外光谱仪(配有定量分析软件为OPUS6.5，德国布鲁克公司)，对所得5个样品进行近红外光谱分析，采用仪器的透射检测器，将样品溶液装入1mm的石英比色皿中扫描图谱，扫描波长范围新橙皮苷在11995.6-5446.2cm^-1和4601.5-4246.7cm^-1波段内，扫描次数32次，分辨率8cm^-1，每份样品扫描3次，取其平均光谱，运用OPUS 6.5数据分析软件对数据进行处理和计算。

将待测样品的特征近红外光谱数据输入本发明建立的校正模型，得新橙皮苷NIR预测值(mg·mL^-1)如下：0.4235、0.4590、0.5676、0.6395、0.7185。

实施例6

称取600g橘红药材，纯化水加NaOH调至pH＝9，加6倍量于10L圆底烧瓶中，加电热套煎煮，直至微沸一小时，煎煮每隔20min取10mL提取液，重复提取两次，取5个样品，提取液样品溶液用0.45μm微孔滤膜过滤。

采用BRUKER TENSOR37型傅里叶变换近红外光谱仪(配有定量分析软件为OPUS6.5，德国布鲁克公司)，对所得5个样品进行近红外光谱分析，采用仪器的透射检测器，将样品溶液装入1mm的石英比色皿中扫描图谱，扫描波长范围柚皮苷在11995.6-7498.2cm^-1、6101.9-5446.2cm^-1和4601.5-4246.7cm^-1三个波段内，扫描次数32次，分辨率8cm^-1，每份样品扫描3次，取其平均光谱，运用OPUS 6.5数据分析软件对数据进行处理和计算。

将待测样品的特征近红外光谱数据输入本发明建立的校正模型，得柚皮苷NIR预测值(mg·mL^-1)如下：0.2964、0.3697、0.4462、0.5365、0.5590。

Claims (10)

1.一种柚皮苷和/或新橙皮苷的近红外透射光谱检测方法，包括以下步骤：

步骤1，取含有柚皮苷和/或新橙皮苷的中药材，加5-15倍量的碱水煎煮，得到煎煮液，经过滤得到待测液；

步骤2，待测液用近红外光谱仪扫描得到近红外光谱数据；

步骤3，根据预先制作的校正模型测定待测液中柚皮苷和/或新橙皮苷的含量。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中步骤1所述含有柚皮苷和/或新橙皮苷的中药材优选包括枳实、枳壳。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中步骤1所述加碱水煎煮，为采用pH9～12的氢氧化钠水溶液煎煮，煎煮1-4次，每次使用的碱水为药材的6-10倍量，提取液经过过滤得到含有柚皮苷和/或新橙皮苷的待测液。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中步骤3所述校正模型的建立方法如下：

(1)收集含有柚皮苷和/或新橙皮苷的中药材提取液，得到校正集样本；

(2)用HPLC法测定校正集样本的柚皮苷和/或新橙皮苷含量；

(3)用近红外光谱仪扫描校正集样本，得到校正集样本的近红外光谱数据，选择合适的谱段区间和预处理方法，获取特征近红外光谱数据；

(4)构建校正集样本柚皮苷和/或新橙皮苷含量与特征近红外光谱数据之间关系的校正模型；

(5)取柚皮苷和/或新橙皮苷含量已知的验证集样本，在与步骤(3)相同的条件下采集近红外光谱数据，根据建立的校正模型计算验证集样本的柚皮苷和/或新橙皮苷含量以及与真值相比较的测量误差。

5.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，其中所述近红外光谱仪扫描，其光谱条件是：

扫描波长范围为4000～12000cm^-1，扫描次数32次，分辨率8cm^-1，每份样品扫描3张，取其平均光谱。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，近红外光谱仪扫描波长范围为柚皮苷在11995.6-7498.2cm^-1、6101.9-5446.2cm^-1和4601.5-4246.7cm^-1三个波段内，新橙皮苷在11995.6-5446.2cm^-1和4601.5-4246.7cm^-1波段内。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述近红外光谱预处理方法包括消除常数偏移量、矢量归一化、多元散射校正、一阶导数、二阶导数预处理方法。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述近红外光谱预处理方法为矢量归一化和多元散射校正预处理方法。

9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中校正模型的维数选择为9。

10.如权利要求4所述的方法，其特征在于采用偏最小二乘法建立校正模型。

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