CN104390946B

CN104390946B - 测定果汁中赭曲霉毒素a含量的方法

Info

Publication number: CN104390946B
Application number: CN201410640396.6A
Authority: CN
Inventors: 王军; 冯清清; 林亚青; 陈敏
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2014-11-13
Filing date: 2014-11-13
Publication date: 2017-11-17
Anticipated expiration: 2034-11-13
Also published as: CN104390946A

Abstract

本发明公开了一种测定果汁中赭曲霉毒素A含量的方法。通过简单的液液萃取纯化步骤对样品进行预处理，然后在优化的扫描波长和扫描间隔等参数下扫描并采集标准品和样品的三维荧光数据，采用平行因子分析法(PARAFAC)对所得的数据进行数学分离处理，以“数学分离”结合化学和物理分离，利用已知浓度的标准品建立校正模型，在含有未知、未校正背景干扰和光谱严重重叠的情况下，实现对待测组分的预测。该方法简单、快速，灵敏度高，可实现在未知背景干扰下果汁中赭曲霉毒素含量的测定。属于食品安全领域。

Description

测定果汁中赭曲霉毒素A含量的方法

技术领域

本发明涉及一种赭曲霉毒素A含量的方法，具体涉及基于三维荧光二阶校正法测定果汁中赭曲霉毒素A含量的方法，属于食品安全领域。

技术背景

赭曲霉毒素A(OTA)是一种由真菌产生的有毒代谢产物，常见于谷物及其制品，咖啡，水果及其制品中，国际癌症研究机构(IARC)已将其确定为2B类致癌物。我国目前还没有果汁中赭曲霉毒素A的明确限量标准，尤其是其快速分析检测方法研究较少。

赭曲霉毒素A主要检测方法有薄层色谱法、酶联免疫法、免疫亲和柱层析净化荧光光度法和固相萃取高效液相色谱法、液液萃取净化高效液相色谱法等。赭曲霉毒素A结构中具有共轭双键，可以在紫外光照射下发出荧光，所以目前较为常用的检测方法是高效液相色谱荧光检测器法，但对多组分复杂基质化学体系进行分析时，必须先对体系样本组分进行物理或化学分离，然后再对目标分析物利用色谱柱的保留时间不同进行分析，这种处理方法通常会让整个分析过程变的繁琐，时间周期较长，并不适合企业生产中的低成本，大量样品快速检测的要求。

荧光分光光度法仪器相对成本较低，具有操作简单，检测速度快，灵敏度高等优点。但测定的是总发射荧光值，对复杂基质中单一物质测定选择性差，果汁中由于赭曲霉毒素A的荧光光谱与复杂样品基质的光谱混合重叠，因而未经分离直接用该方法检测其中赭曲霉毒素A含量的可行性较差，即常规荧光分析法难以满足分析要求。

将样品简单前处理纯化后经荧光光谱测定得到三维数据信息，结合化学计量学方法以“数学分离”结合“化学分离”以提高其选择性，可以在含有未知、未校正背景干扰和光谱严重重叠的情况下，实现对待测组分的直接快速定量测定，在食品质量安全等领域具有重要的分析潜力。

发明内容

本发明公开一种测定果汁中赭曲霉毒素A含量的方法，基于三维荧光二阶校正法，以数学分离结合化学分离来快速测定果汁中的赭曲霉毒素A含量的方法，旨在提供一种低成本、快速测定的方法。

本发明采用如下技术方案：

本发明采用激发—发射荧光矩阵(EEM)与平行因子法(PARAFAC)相结合，对样品简单处理后，分析果汁产品中赭曲霉毒素A含量。

一种测定果汁中赭曲霉毒素A含量的方法，包括如下步骤：

步骤(1)建立模型：基于平行因子法(PARAFAC)，配制赭曲霉毒素A校正样以建立定量分析的校正模型；

在线性范围内配制赭曲霉毒素A的校正样、验证样、果汁萃取液，并在优化后的扫描波长和扫描间隔下采集其三维激发-发射荧光光谱数据，以避免瑞利散射、拉曼散射的干扰，减少冗余光谱区域和信噪比很低的光谱区域的干扰；对所得到三维数据阵采用平行因子法进行数学分离解析，并建立校正模型；

步骤(2)验证模型：以赭曲霉毒素A验证样对所建校正模型进行判断，并验证校正模型的可靠性；

以与校正样相同的处理方法配制验证样，并经荧光扫描采集三维荧光数据，经平行因子法分析，校正模型预测后得预测浓度，并与理论浓度比较分析以判断模型的可靠性；

步骤(3)分析测定：以校正模型对果汁实际样品中赭曲霉毒素A的含量快速分析测定；

以不同品种的果汁为实际样品，果汁实际样品经过液液萃取前处理后，在相同的实验参数下采集三维荧光光谱数据阵，经数学分离和校正模型预测得到实际样品中赭曲霉毒素A的含量。

在上述技术方案基础上，进一步，

所述步骤(1)中，赭曲霉毒素A校正样线性范围为：0.27～3.24ng/mL；

所述步骤(1)中，优化好的扫描波长和扫描间隔：激发波长范围为285～360nm，扫描间隔5nm；发射波长范围为420～510nm，扫描间隔5nm；

所述步骤(2)中，对模型进行验证的赭曲霉毒素A验证样溶液配制的浓度范围为：0.44～2.18ng/mL；

所述步骤(3)中果汁实际样品的加标浓度为：0～8.89ng/mL，保证萃取之后的浓度在线性范围之内；

所述步骤(3)中液液萃取前处理步骤为：果汁实际样品经二氯甲烷液液萃取，离心分层，取二氯甲烷相经稀碳酸氢钠溶液反萃，离心分层后，取上层水相，加盐酸酸化，除气泡并保存待测。空白实验为未加标的果汁样品。

测定果汁中赭曲霉毒素A含量方法的性能评价：

对果汁实际样品经数学分离后得到相对激发光谱、相对发射光谱和背景干扰光谱，并与赭曲霉毒素A标准品的相对激发光谱、发射光谱进行比较分析，看其相似程度；对加标果汁经前处理和数学分离后，得到预测浓度和回收率，以灵敏度(SEN)、选择性(SEL)、检测下限(LOD)，预测残差均方根(RMSE)等品质因子(FOM)，以验证方法，评估方法的准确性。

化学计量学分析的基础，三线性成分模型：

假设测定的标样和预测样的总样本数为K，激发波长数为I，发射波长数为J。对于1个采集到的3D荧光响应数阵X(I×J×K)，其中的元素(i，j，k)表示样本k在激发光谱数为i、发射光谱数为j时的荧光强度，它满足下面的三线性成分模型：

其中：i＝1，2…，I；j＝1，2，…，J；k＝1，2，…，K

N表示对荧光响应有实际贡献的组分数(包含目标物，背景及共存干扰的总组分数)；X_ijk是3D荧光响应数阵X中的元素(i，j，k)，它表示样本k在激发光谱数为i、发射光谱数为j时的荧光强度；C_kn是相对浓度阵C(K×N)中的元素(k，n)；a_in是相对激发光谱阵A(I×N)中的元素(i，n)；b_jn是相对发射光谱阵B(J×N)中的元素(j，n)，e_ijk是3D残差数阵E(I×J×K)中的元素(i，j，k)。

从上述公式可以看出三维数据阵X具有三线性分解的唯一性，可以在未知干扰存在下，获得K个样本中相对激发矩阵A，相对发射矩阵B以及相对浓度矩阵C。二阶校正方法具有独特的“二阶优势”，即可实现在未知干扰组分共存下对复杂多组分分析体系中目标组分的快速定量分析的独特优越性，这一特点使得三线性成分模型可应用于实际样品分析。

组分数的确定：

三维数据中的组分数指的是准确地拟合解析三线性模型所需的最小组分数，既包含待测组分，也包含与之共存的干扰组分。Corcondia是用来确定组分的方法，该方法通过计算平行因子分析模型中超对角矩阵T和最小二乘拟合阵G之间的相似程度来估计组分数，此方法被称为核一致诊断法确定组分数，公式如下：

其中，F是模型的组分数；g_def为三维矩阵G(最小二乘拟合阵)的元素；t_def为三维矩阵T(超对角阵)的元素。对于理想的PARAFAC模型(组分数选择合适)，超对角阵和最小二乘拟合阵应该非常相似，此时的核一致值将会等于100％。通常，当核一致值大于或等于60％时认为模型接近三线性。但当核一致值小于60％时，则认为偏离三线性。所以，可以根据核一致值的变化情况判断样品的组分数。

品质因子的分析：

分析本实验的品质主要有灵敏度(SEN)、选择性(SEL)、检测下限(LOD)和预测残差均方根(RMSEpred)来检验二阶校正方法预测结果的准确性。

在二阶校正中，分析品质因子的估计跟纯分析信号的计算密切相关。灵敏度是指单位浓度的纯分析信号，选择性是指灵敏度和总信号的比值，本文根据以下公式来计算：

SEL＝{[(A^TA)-1]_nn*[(B^TB)^-1]_nn}^-1/2

SEL＝K{[(A^TA)^-1]_nn*[(B^TB)^-1]_nn}^-1/2

其中：下标nn为矩阵第(n，n)个元素；K为组分n在单位浓度时的总信号(浓度得分参数)

LOD＝3.3s(0)

其中：S(0)为三个背景空白样本的预测浓度标准偏差

其中：k为样本数，C_act为实际浓度，C_pred为预测浓度

若RMSE越小，预测值越接近于理论值，则预测精度越高，可利用RMSE评估校正模型的预测能力。

所述性能评价中：灵敏度(SEN)指单位浓度的纯分析信号，选择性(SEL)指灵敏度和总信号的比值。

本发明的有益效果在于：

通过简单的液液萃取步骤对样品进行预处理，然后在优化后的扫描波长和扫描间隔等参数下扫描并采集标准品和样品的三维荧光数据，采用平行因子分析法(PARAFAC)对所得的数据进行数学分离处理，以“数学分离”结合化学和物理分离，利用已知浓度的标准品建立校正模型，在含有未知、未校正背景干扰和光谱严重重叠的情况下，实现对待测组分的预测。该方法简单、快速，灵敏度高，可实现在未知背景干扰下果汁中赭曲霉毒素含量的测定，且具有未知干扰共存也不影响待测组分定量分析结果的优点。

附图说明

图1背景干扰存在时，用PARAFAC方法得到的果汁样品分辨图(N＝2)

(a)激发光分辨图(b)发射光分辨图

图中：1.真实光谱，2.分辨得到的赭曲霉毒素A光谱，3.背景干扰

图2为PARAFAC算法(N＝2)分辨的相对浓度分辨图

图中：1.赭曲霉毒素A相对浓度；2.背景干扰，

样本1-8为校正样，样本9-12为实际样

具体实施方式

下面，结合具体实施例，对发明作进一步的说明。

实施例：

一、操作步骤

步骤(1)，基于平行因子法(PARAFAC)，根据标准品建立定量分析的校正模型

1)、标准品的配制：

取1mg赭曲霉毒素A标准品用色谱级甲醇完全溶解，定容至50mL(20μg/mL，-20℃避光保存),作为赭曲霉毒素A标准储备液。

取0.5mL赭曲霉毒素A标准储备液，用甲醇定容至100mL，浓度为100ng/mL(4℃避光保存)待用；用稀碳酸氢钠溶液配制一系列不同浓度的赭曲霉毒素A溶液，逐个扫描样本3D荧光强度，进行线性范围考察，其在0.27～3.24ng/mL浓度范围内，相关系数为0.99，线性关系良好可以进行定量分析。

2)、校正样的配制：用稀碳酸氢钠溶液配制赭曲霉毒素A工作液，使赭曲霉毒素A浓度范围在0.27～3.24ng/mL之间；

利用荧光分光光度计对校正样和验证样扫描采集数据，为有效避免瑞利散射、拉曼散射的干扰，减少冗余光谱区域和信噪比低的光谱区域的干扰，选择激发波长范围为285～360nm，发射波长范围为420～510nm，分别间隔5nm采集数据，狭缝宽度为5.0/5.0nm，扫描速度为12000nm/min。在设定的参数下采集校正样和验证样的三维荧光光谱数据，构建待分析的三维数据阵。

利用核一致诊断法(corcondia)对所得到的三维数阵(19×16×14)进行秩估计，在组分数≤2时，核一致值大于60％；而当组分数>2时，核一致值降低。这说明在该体系中，当组分数为2时，模型最接近三线性。因此，对验证样进行预测时所选组分数为2。

步骤(2)验证样的配制：配制验证样(不含干扰)用来考察校正模型的稳定性，赭曲霉毒素A验证样的浓度范围包括在校正样浓度范围之内。

采用平行因子法(PARAFAC)对三维矩阵解析，对浓度进行线性回归，对加标浓度0.44～2.18ng/mL的验证样进行分析时，此算法解析得到验证样的预测浓度与真实的添加浓度非常接近。赭曲霉毒素A的平均回收率为97.38％～103.14％，RSD<8％，RMSEpred＝0.0241ng/mL，对于配制的验证样，PARAFAC给出了满意的结果，说明所建立的模型可靠。

表1 PARAFAC法测定验证样中赭曲霉毒素A结果

步骤(3)，对果汁实际样品中赭曲霉毒素A含量的快速分析测定

将果汁样品，取一定量的加标果汁实际样品经二氯甲烷液液萃取，离心分层，除去上层水相，取一定体积的二氯甲烷相经稀碳酸氢钠溶液反萃，离心分层后，取上层水相，加盐酸酸化，除气泡并保存待测。空白实验为未加赭曲霉毒素A标准品的样品。对处理后的样品在确定好的仪器条件下重复扫描三次，并采集其三维荧光光谱数据阵。

对样品采用核一致分析，估计体系组分数为2，其中一个组分由目标物赭曲霉毒素A所贡献，另一组分由拟合的背景干扰所贡献。经数学解析，获得相对激发光谱阵，相对发射光谱阵和相对浓度阵，得到果汁中赭曲霉毒素A的含量。其预测结果(以回收率表示)如表2所示：

表2 PARAFAC法测定果汁样品中赭曲霉毒素A的结果

二、方法的性能评价

对加标实际样品经PARAFAC数学分离后得到相对激发光谱，相对发射光谱，和背景干扰光谱，并与赭曲霉毒素A标准品的相对激发、发射光谱进行比较分析，看其相似程度，如图1所示，当组分数为2时，PARAFAC算法分辨得到的赭曲霉毒素A激发光谱和发射光谱分别与真实光谱相似，说明这些算法模型获得的解是可靠的，可对果汁中含有的赭曲霉毒素A进行分辨，同时也体现了三线性分解的唯一性。也可以看出，赭曲霉毒素A最大的激发、发射波长大约在330，460nm处，与赭曲霉毒素A标准品荧光扫描结果相吻合。

从相对浓度图2可知，校正样中杂质含量几乎为0，实际样中杂质含量较高，内源物质的荧光干扰与目标分析物的荧光严重重叠，对目标物的定量测定有很大的影响。需要经过数学分离的手段才能实现对目标物的快速定量分析。

以灵敏度(SEN)、选择性(SEL)、检测下限(LOD)，预测残差均方根(RMSE)等品质因子(FOM)，以验证方法的准确性。

表3PARAFAC法测定果汁样品测定结果品质因子分析

品质因子	果汁
		SEL	0.552
SEN(mL/ng)	0.104
		LOD	0.081
RMSE(ng/mL)	0.164

以上所述仅为本发明的较佳可行实施例，并非因此局限本发明的专利范围，故凡是运用本发明内容所作的等效变化，均包含于本发明的保护范围。

Claims

1.一种测定果汁中赭曲霉毒素A含量的方法，包括如下步骤：

所述步骤(2)，以和校正样相同的处理方法配制验证样，并经荧光扫描采集三维荧光数据，经平行因子法分析，得预测浓度，并判断模型的可靠性；

所述步骤(1)，在线性范围内配制赭曲霉毒素A的校正样、验证样，取用果汁萃取液，并在优化好的扫描波长和扫描间隔下采集其三维激发-发射荧光光谱数据；对所得到三维数据阵采用平行因子法(PARAFAC)进行数学分离解析，并建立校正模型；

优化的扫描波长和扫描间隔：激发波长范围为285～360nm，扫描间隔5nm；发射波长范围为420～510nm，扫描间隔5nm；

步骤(3)分析测定：以校正模型对果汁实际样品中赭曲霉毒素A的含量分析测定；

所述步骤(3)，果汁实际样品经过液液萃取前处理后，在相同的实验参数下采集三维荧光光谱数据阵，经平行因子法分析和校正模型预测得到实际果汁样品中赭曲霉毒素A的含量；

液液萃取前处理步骤为：果汁样品经二氯甲烷液液萃取，离心分层，取二氯甲烷经稀碳酸氢钠溶液反萃，离心分层后，取上层水相，加盐酸酸化，除气泡并保存待测。

2.按照权利要求1所述测定果汁中赭曲霉毒素A含量的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，赭曲霉毒素A校正样线性范围为：0.27～3.24ng/mL。

3.按照权利要求1所述测定果汁中赭曲霉毒素A含量的方法，其特征在于，对模型进行验证的赭曲霉毒素A验证样的浓度范围为：0.44～2.18ng/mL。

4.按照权利要求1所述测定果汁中赭曲霉毒素A含量的方法，其特征在于，果汁实际样品的加标浓度为：0～8.89ng/mL，保证萃取之后的浓度在线性范围之内。