CN103525927A - 一种检测赭曲霉毒素a的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测赭曲霉毒素A的方法，该方法利用固定在光子晶体微球上的核酸适配体序列与其荧光标记互补序列进行杂交，通过加入待测样品，利用芯片扫描仪对加入样品前后的荧光信号进行检测；根据测得的荧光信号的变化值对样品中的赭曲霉毒素A进行检测。该方法对赭曲霉毒素A的检测限为0.001ng/mL，线性检测范围为0.001到1ng/mL之间，仅仅需要2μL试样。

Description

一种检测赭曲霉毒素A的方法
技术领域
本发明涉及农产品、饲料和食品中的真菌毒素快速、高通量、低成本检测技术方法。具体通过谷物中典型的赭曲霉毒素A为检测对象，利用三维光子晶体微球为载体，通过核酸适配体识别技术和荧光分析技术相结合构建液相芯片检测新技术。
背景技术
赭曲霉毒素(Ochratoxin)是曲霉属和青霉属等产毒菌株产生的一种有毒的次级代谢产物。自然界中产生赭曲霉毒素的真菌种类繁多，主要以纯绿青霉(Penieilliumverrucosum)、赭曲霉(Aspergillusochraceus)、和碳黑曲霉(Carbonarius)为主。赭曲霉毒素主要包括A、B、C、D等7种结构类似物，其中毒性最强、最为常见、分布最广的是赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)。OTA对食品污染的范围较广，包括谷物及谷物产品、豆类、咖啡豆、葡萄干、葡萄汁和啤酒等。赭曲霉毒素具有肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性，不但会引起人畜的急、慢性中毒，还具有致癌、致畸、致突变的潜在危害。OTA被认为是危害性仅次于黄曲霉毒素的真菌毒素。1993年,国际癌症研究机构(The International Agency for Research on Cancer,IARC)将其定为IIB类致癌物。鉴于OTA的毒性，会给人类和动物的健康带来巨大威胁，因此世界上许多国家和组织都很重视对OTA的控制，制定了食品、饲料中赭曲霉毒素的相关法规和限量标准，并积极研究相关检测方法。目前常用的检测方法有薄层色谱法（TLC）、气相色谱法(GC)、液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳技术（CE）、酶联免疫吸附法(ELISA)等。这些常用的检测方法对赭曲霉毒素A的检测起着非常重要的作用，但是这些方法或多或少存在一些缺陷如：样品前处理复杂、仪器昂贵、灵敏度低等，而且随着科学技术的发展以及检测水平的提高，对食品中的赭曲霉毒素A限量标准的要求也在不断地提高，传统的检测方法已不能满足现在的检测需求。因此建立一种快速、高通量、高灵敏度、成本低、特异性好的检测方法，从而对农产品中存在的真菌毒素进行有效监控十分必要。
发明内容
本发明目的在于开发一种高灵敏度、高通量、低成本、检测时间快、特异性好的检测食品中赭曲霉毒素A新技术，以替代传统色谱技术或酶联免疫法（ELISA）赭曲霉毒素A检测的方法。
本发明的原理如图1所示，用浓硫酸(98%)与浓过氧化氢溶液(30%)按照体积比7:3混合的洗液清洗光子晶体微球，同时进行羟基化修饰，用γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）对微球表面修饰环氧基，固定赭曲霉毒素A-核酸适配体，牛血清蛋白（BSA）封闭，加入荧光标记互补序列进行杂交，加入样品中赭曲霉毒素A后，使其与核酸适配体的特异性结合，同时互补杂交的荧光标记序列从微球上解离，从而引起荧光信号的变化，利用芯片扫描仪对荧光信号进行检测。
本发明所述用单珠光子晶体微球检测赭曲霉毒素A的方法，是利用固定在光子晶体微球上的核酸适配体序列与其荧光标记互补序列进行杂交，通过加入待测样品，利用芯片扫描仪对加入样品前后的荧光信号进行检测；根据测得的荧光信号的变化值对样品中的赭曲霉毒素A进行检测；所述核酸适配体序列是：5′-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAGCAT CGG ACA-NH2-3′；荧光标记互补序列是5′-FITC-TGT CCG ATG CTC CCT TTACGC CAC CCA CAC CCG ATC-3′。
只要样品中存在赭曲霉毒素A，就会与核酸适配体的特异性结合，同时互补杂交的荧光标记序列从微球上解离，从而引起荧光信号的变化，因此只要检测到加入样品前后的荧光信号发生了变化，就表明样品中含有赭曲霉毒素A。
进一步地，我们可预先建立荧光信号的变化值与赭曲霉毒素A标准溶液浓度的关系作为定量分析指标，就可根据测得的荧光信号的变化值对样品中的赭曲霉毒素A进行定量检测。
上述方法包括以下步骤：
（1）光子晶体微球的制备
（2）光子晶体微球表面功能化：通过体积比3：7的双氧水与浓硫酸对步骤（1）得到的微球表面进行羟基化修饰，再用γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）对微球表面进行环氧基修饰；
（3）固定赭曲霉毒素A-核酸适配体序列：通过化学键合的方法将赭曲霉毒素A-核酸适配体序列5′-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-NH2-3′固定于经步骤（2）表面修饰的光子晶体微球表面；加入荧光标记互补序列5′-FITC-TGT CCGATG CTC CCT TTA CGC CAC CCA CAC CCG ATC-3′进行杂交，
（4）用经过步骤（3）处理的单珠的光子晶体微球分别加入不同浓度有赭曲霉毒素A标准溶液，利用芯片扫描仪检测加入赭曲霉毒素A标准溶液前、后的荧光信号值，加入前所获得的荧光信号为I0，加入之后的荧光强度为I，△I=I0-I，建立△I与赭曲霉毒素A标准溶液的关系，作为定量分析指标；
（5）用单珠光子晶体微球对待测样品进行检测；利用芯片扫描仪检测荧光信号值，根据测得的荧光信号的变化值，依据步骤（4）建立的定量分析指标对样品中的赭曲霉毒素A进行定量。
上述方法中，优选的条件是：核酸适配体序列浓度为400ng/mL、互补序列浓度为500ng/mL、杂交温度为37摄氏度、杂交时间为3h、OTA结合温度为37摄氏度、结合时间为1h。
光子晶体微球的制备：将装有单分散纳米二氧化硅乳液的1号注射器及装有甲基硅油的2号注射器连接到三通管上，利用微流注射泵将水相和油相通过三通管混合包裹，并通过玻璃管流入疏水性的收集器皿中，在界面力的作用下单分散纳米二氧化硅乳液形成球状结构。
将制备好的液态微球置于60℃烘箱内过夜，使液态微球中的水分逐渐蒸发并使单分散纳米二氧化硅微球进一步自组装。微球成型后，用正己烷浸泡微球，每次10min，直至将甲基硅油洗净，后用无水乙醇清洗微球3次，将正己烷完全洗净。将清洗好的微球至于管式炉中煅烧，升温速度为2℃/min，逐渐升至700℃，保温3小时，后自然降至室温。
光子晶体微球表面功能化
修饰羟基：将1mL食人鱼洗液（浓硫酸：双氧水=7：3）加入到光子晶体微球的烧杯中过夜，后用双蒸水冲洗3次，用氮气流吹干。经过该食人鱼洗液处理后，清除掉微球表面的有机杂质，并且使微球表面形成更多的硅羟基。
修饰环氧基：将上述处理过的微球浸泡于含5%（v/v）γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）的甲苯溶液中，37摄氏度摇晃6小时，待反应结束后，用甲苯、无水乙醇以及双蒸水按顺序分别清洗微球3次，后用氮气流吹干，将微球置于110℃下加热30min。处理好后的微球用于下一步的毒素检测。
谷物试样的处理：
将市场上购买的大米、玉米和小麦分别使用中药粉碎机粉碎，过200目筛，称取试样各5g于已清洗干净的具塞锥形瓶中，向样品中添加不同浓度及体积的赭曲霉毒素A-甲醇溶液标准品，充分混合试样后，将其放入通风处内，直至溶剂蒸发完全。向其中加入提取剂（甲醇：水=4：6）15mL，，瓶塞上涂上一层水，将瓶塞盖紧，防止漏液。在摇床内摇晃提取2小时（180r/min），用whatman滤纸过滤，取滤液离心10min（4000r/p），取上清液，即为待测样品。同时做空白试验。
对赭曲霉毒素A样品进行检测：
将修饰后的微球至于离心管中，每管5球，后加入10μL浓度为400ng/mL的赭曲霉毒素A-核酸适配体序列，4℃下过夜。后用TE（Tris-HCl-EDTA）洗液清洗微球3次，后向离心管中加入10mL 1%牛血清蛋白（BSA）溶液，对微球表面上未结合位点进行封闭，室温下封闭1小时，后用TE洗液清洗微球3次。向各离心管中加入10μL浓度为500ng/mL的荧光标记互补序列，37摄氏度杂交反应3小时。然后分别用洗脱液A(1×SSC+0.2%SDS)、洗脱液B(0.2×SSC)、洗脱液C(0.1×SSC)进行洗涤。然后向离心管中加入赭曲霉毒素A毒素标准样品或提取的谷物试样，37℃下结合1小时，用洗脱液A、B、C各清洗微球3次后，最后固定微球于玻片上，放入芯片扫描仪进行荧光检测，并用LuxScan3.0软件对结果进行分析。未加入OTA标准溶液之前，所获得的荧光信号为I0，加入OTA标准品之后的荧光强度为I，△I=I0-I，作为OTA定量分析指标。赭曲霉毒素A的标准曲线见图2。线性检测范围在三个数量级范围之内见图3。
本发明通过二氧化硅颗粒自组装技术，组装成结构和均一的光子晶体微球。将其浸入食人鱼洗液（浓硫酸：双氧水=7：3）进行清洗，同时使其表面硅羟基增多，后用5%的γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）甲苯溶液浸泡，使其表面修饰环氧基。试验通过优化赭曲霉毒素A-核酸适配体序列浓度、荧光标记互补序列浓度、杂交反应温度和时间、OTA结合反应温度和时间确定了核酸适配体序列浓度为400ng/mL、互补序列浓度为500ng/mL、杂交温度为37摄氏度、杂交时间为3h、OTA结合温度为37摄氏度、结合时间为1h。
利用光子晶体微球比表面积大的特点对赭曲霉毒素A进行检测，微球表面功能化后，固定赭曲霉毒素A-核酸适配体，加入荧光标记互补序列进行杂交，然后加入样品中赭曲霉毒素A，使其与核酸适配体的特异性结合，同时互补杂交的荧光标记序列从微球上解离，利用芯片扫描仪对荧光信号进行检测，构建农产品中赭曲霉毒素A的液相芯片检测技术。建立赭曲霉毒素A检测范围在1-0.001ng/mL之间，对赭曲霉毒素A在大米、玉米和小麦中的回收率在73.73%～125.17%之间。不同毒素之间无干扰，具有良好的特异性。特异性见图4。
本发明中通过对反应条件进行优化，提高荧光信号及荧光信号变化值，从而扩大检测线性范围。这一技术对赭曲霉毒素A的检测灵敏度达到了pg/mL，检测现行范围到4个数量级，不同毒素之间不存在明显的干扰问题，具有良好的检测选择。而且，检测样品试剂仅仅需要2μL/球，节省了试剂和样品，将包被杂交好的微球直接用于检测，检测时间小于2小时。该技术可以高通量、快速、灵敏、稳定地检测样本，成本低廉。
附图说明
图1光子晶体微球检测赭曲霉毒素A原理图；
图2赭曲霉毒素A检测标准曲线；
图3为赭曲霉毒素A检测线性范围。
图4赭曲霉毒素A检测的特异性。
具体实施方式
本发明所用赭曲霉毒素A标准品（OTA），四氧乙基硅烷（TEOS）购于Sigma-Aldrich。赭曲霉毒素A-核酸适配体及荧光标记互补链由上海生工生物工程股份有限公司合成。牛血清蛋白（BSA）购于上海生工有限公司。γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）购于东京化成工业株式会社。甲基硅油购于宇诺公司。氨水、无水乙醇购于南京化学试剂公司。谷物（大米、玉米和小麦）购于南京热河南路农贸市场。
实施例1
将市场上购买的大米、玉米和小麦分别使用中药粉碎机粉碎，过200目筛，称取试样各5g于已清洗干净的具塞锥形瓶中，向样品中添加不同浓度及体积的赭曲霉毒素A-甲醇溶液标准品，充分混合试样后，将其放入通风处内，直至溶剂蒸发完全。向其中加入提取剂（甲醇：水=4：6）15mL，，瓶塞上涂上一层水，将瓶塞盖紧，防止漏液。在摇床内摇晃提取2小时（180r/min），用whatman滤纸过滤，取滤液离心10min（4000r/p），取上清液，即为待测样品。同时做空白试验。
样品中赭曲霉毒素A的检测：
将修饰后的微球至于离心管中，每管5球，后加入10μL浓度为400ng/mL的赭曲霉毒素A-核酸适配体序列SEQ ID NO.1，具体是5′-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGGGAG CAT CGG ACA-NH2-3′，4℃下过夜。后用TE（Tris-Hcl-EDTA）洗液(PH=8.0)清洗微球3次，后向离心管中加入10μL1%牛血清蛋白（BSA）溶液，对微球表面上未结合位点进行封闭，室温下封闭1小时，后用TE洗液清洗微球3次。向各离心管中加入10μL浓度为500ng/mL的荧光标记互补序列SEQ ID NO.2,具体是5′-FITC-TGT CCG ATG CTC CCT TTACGC CAC CCA CAC CCG ATC-3′，37摄氏度杂交反应3小时。然后分别用洗脱液A(1×SSC+0.2%SDS)、洗脱液B(0.2×SSC)、洗脱液C(0.1×SSC)进行洗涤。然后向离心管中加入赭曲霉毒素A毒素标准样品或提取的谷物试样，37℃下结合1小时，用洗脱液A、B、C各清洗微球3次后，最后固定微球于玻片上，放入芯片扫描仪进行荧光检测，并用LuxScan3.0软件对结果进行分析。未加入OTA标准溶液之前，所获得的荧光信号为I0，加入OTA标准品之后的荧光强度为I，△I=I0-I，作为OTA定量分析指标。
表1
Figure BDA0000393753420000051
检测结果见表1：回收率在73.73-125.17%之间，大部分在80%以上，作为初筛检测方法，这个回收率范围是可以接受的。

Claims (5)

1.一种检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，利用固定在光子晶体微球上的核酸适配体序列与其荧光标记互补序列进行杂交，通过加入待测样品，利用芯片扫描仪对加入样品前后的荧光信号进行检测；根据测得的荧光信号的变化值对样品中的赭曲霉毒素A进行检测；
所述核酸适配体序列是：5′-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGGACA-NH2-3′；
荧光标记互补序列是5′-FITC-TGT CCG ATG CTC CCT TTA CGC CAC CCA CACCCG ATC-3′。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，预先建立荧光信号的变化值与赭曲霉毒素A标准溶液浓度的关系作为定量分析指标，再根据测得的荧光信号的变化值对样品中的赭曲霉毒素A进行定量。
3.根据权利要求1所述的方法，包括以下步骤：
（1）光子晶体微球的制备；
（2）光子晶体微球表面功能化：通过体积比3：7的双氧水与浓硫酸对步骤（1）得到的微球表面进行清洗及羟基化修饰，再用γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷对微球表面进行环氧基修饰；
（3）DNA固定与杂交：通过化学键合方法将赭曲霉毒素A的核酸适配体序列5′-GATCGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-NH2-3′固定于经过步骤（2）表面修饰的微球表面，再与其荧光互补序列5′-FITC-TGT CCG ATG CTC CCT TTA CGC CACCCA CAC CCG ATC-3′进行杂交结合；
（4）用经步骤（3）处理的单珠光子晶体微球分别加入不同浓度有赭曲霉毒素A标准溶液，利用芯片扫描仪检测加入赭曲霉毒素A标准溶液前、后的荧光信号值，加入前所获得的荧光信号为I0，加入之后的荧光强度为I，△I=I0-I，建立△I与赭曲霉毒素A标准溶液的关系，作为定量分析指标；
（5）用单珠光子晶体微球对待测样品进行检测；利用芯片扫描仪检测荧光信号值，根据测得的荧光信号的变化值，依据步骤（4）建立的定量分析指标对样品中的赭曲霉毒素A进行定量。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤（2）中γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷对微球表面进行环氧基修饰时，110℃下烘干30min。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述赭曲霉毒素A的核酸适配体序列的包被浓度为400ng/mL，其互补序列浓度为500ng/mL。
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