CN112378889A - 一种用于检测赭曲霉毒素a的光子晶体微球毛细管柱及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测赭曲霉毒素A的光子晶体微球毛细管柱及其制备方法和应用，所述光子晶体微球毛细管柱以二氧化硅纳米粒子自组装的光子晶体为柱塞，以表面修饰有能够特异性识别赭曲霉毒素A的荧光核酸适配体的光子晶体微球为填料，并以填充方式制备该毛细管柱。本发明制备的光子晶体微球毛细管柱方便携带，能够利用毛细作用实现样品自动萃取，其中的光子晶体柱塞能够排除杂质干扰起到净化作用，并能够利用微球上修饰的荧光核酸适配体建立赭曲霉毒素A的柱上荧光检测分析方法。该检测分析方法对赭曲霉毒素A的检测简单快速、特异性高、成本低，克服了现有检测技术存在的缺点，满足了快速检测实际样品中赭曲霉毒素A的需求。

Description

一种用于检测赭曲霉毒素A的光子晶体微球毛细管柱及其制 备方法和应用

技术领域

本发明属于分析检测，具体涉及一种用于检测赭曲霉毒素A的光子晶体微球毛细管柱及其制备方法和应用。

背景技术

赭曲霉毒素(Ochratoxin)是一种有毒霉菌产生的次级代谢产物，主要包括A、B、C、D等7种结构类似物，其中赭曲霉毒素A(OTA)的毒性最强、最为常见、分布最广。OTA能够污染谷物及谷物产品、动物饲料以及食品如葡萄干等。赭曲霉毒素具有肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性，可以引起人畜的急、慢性中毒，而且具有致癌、致畸、致突变的潜在危害，被国际肿瘤研究中心(IARC)定为II B类致癌物。世界上很多国家和组织都制定了食品、饲料等产品中赭曲霉毒素的相关法规和限量标准，并大力开发快速检测技术。赭曲霉毒素的常用检测方法有薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳(CE)、酶联免疫吸附法(ELISA)等等。这些常见方法均能够对赭曲霉毒素A进行定性定量分析，在保障食品安全和人们健康方面起着非常重要的作用，但是这些方法均存在一些缺点，比如：样品前处理复杂、仪器昂贵、检测成本高等，而且随着人们生活水平的提高，人们对农产品、饲料和食品的质量要求越来越高，传统的检测方法已不能满足现在的检测需求。因此建立一种操作简单、特异性高、成本低的检测方法，对赭曲霉毒素进行有效监控是十分必要的。

目前，纸层析试纸条在线检测OTA被广为应用。但是该技术方法也存在着大量缺点，如饱和层析时间过长、滤纸较薄、分子探针固定量小、不宜做制备层析用，操作繁琐和滤纸中心边缘渗透速度不均一，影响分离效果，检测目标物数量有限，不能平行检测样本等。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于检测赭曲霉毒素A的光子晶体微球毛细管柱，该光子晶体微球毛细管柱可以利用毛细现象萃取样品中的赭曲霉毒素A，基于核酸适配体上荧光基团建立赭曲霉毒素A的荧光检测分析，有效解决了样品前处理难以实现自动富集、净化、微量化的问题，以及现有技术产品难以实现在线、快速、高通量检测的问题。

本发明还提供所述用于检测赭曲霉毒素A的光子晶体微球毛细管柱的制备方法和应用。

技术方案：为了实现上述目的，本发明所述光子晶体微球毛细管柱以二氧化硅纳米粒子自组装柱为柱塞及光子晶体微球为填料，在微球表面修饰能够特异性识别赭曲霉毒素A的荧光核酸适配体，再采用填充方式制备毛细管柱，用于实际样品中赭曲霉毒素A的柱上荧光检测分析。

其中，所述能够特异性识别赭曲霉毒素A的荧光核酸适配体为5’-NH₂-GAT CGGTGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-Cy3-3’。

其中，所述柱塞是由二氧化硅纳米粒子自组装形成的光子晶体。

本发明所述的光子晶体微球毛细管柱的制备方法，包括如下步骤：

(1)光子晶体微球的制备；

(2)光子晶体微球表面的修饰：采用双氧水与浓硫酸的混合液处理步骤(1)制备的光子晶体微球，再用2,3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷对微球表面进行环氧基团的修饰；

(3)荧光核酸适配体的固定：通过环氧开环反应将含有荧光基团的能够特异性识别赭曲霉毒素A的适配体固定于经过步骤(2)表面修饰的微球表面；

(4)制备毛细管柱的柱塞：取毛细管取中间部位标记，在中间偏左或右的位置加热使其熔化，待其快要融化时，将毛细管提拉同时向双向水平拉长，但不可拉断，最后中间标记处切断，将较长的毛细管插入二氧化硅乳液中，使二氧化硅乳液充满毛细管后，水平取出，倾斜，室温条件下静置，结束后竖直悬挂放置，再煅烧以形成更加稳固的二氧化硅光子晶体柱，即含二氧化硅纳米粒子自组装的光子晶体柱塞的毛细管柱；将经过步骤(4)制备得到的微球填充到具有该柱塞的毛细管柱中，获得光子晶体微球毛细管柱。

其中，步骤(3)所述的含有荧光基团的能够特异性识别赭曲霉毒素A的适配体为5’-NH₂-GAT CGG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-Cy3-3’。

其中，步骤(4)通过中间偏左或右的位置为毛细管取中间部位偏左或者右10-15mm。

其中，步骤(4)所述光子晶体柱塞，其中二氧化硅纳米粒子所用毛细管柱的材质为透明玻璃或石英，内径小于或等于0.5mm。

其中，所述光子晶体微球的粒径小于或等于0.5mm，与毛细管内径相匹配。

作为优选，所述光子晶体微球的粒径约为480μm。

本发明所述的光子晶体微球毛细管柱在赭曲霉毒素A选择性吸附中的应用。

本发明所述的光子晶体微球毛细管柱在赭曲霉毒素A定量检测分析中的应用。

其中，所述定量检测分析，将利用光子晶体微球毛细管柱的毛细作用选择性吸附样品中的赭曲霉毒素A，经过清洗后，测定该微球的荧光信号值，同时测定空白荧光信号值，根据荧光信号差值采用标准曲线法进行赭曲霉毒素A的定量分析。

本发明以二氧化硅纳米粒子自组装的光子晶体为柱塞，起到过滤、净化样本和支撑微球作用，本发明以光子晶体微球为载体，在微球表面修饰核酸适配体用于特异性识别赭曲霉毒素A，通过填充方式制备毛细管柱，利用毛细作用实现样品自动萃取，基于核酸适配体上的荧光基团实现荧光检测分析。该检测方法简单快速，特异性高和成本低，所用毛细管柱方便携带，对赭曲霉毒素A的线性检测范围为1-100ng/mL，样品量仅需2μL，克服了现有检测技术存在的缺点，满足快速检测实际样品中赭曲霉毒素A的需求。

本发明利用毛细管的毛细作用吸附原理，自动将微量样品吸入毛细管内。首先利用二氧化硅自组装光子晶体柱进行初步净化，然后利用功能化的光子晶体微球纳米微孔进行选择性富集和净化样品中的OTA，而该OTA能够被微球表面的特异性适配体结合，并引起微球表面荧光的变化来实现OTA的特异性、高灵敏度和快速的检测分析。本发明所述的毛细管柱及分析方法，可以实现赭曲霉毒素A的柱上荧光检测分析，具有如下特点和优势：1)解决了现有技术难以对样品前处理快速自动富集、净化、微量化的问题；2)解决了现有技术难以在线、快速、高通量检测的问题；3)试剂用量更少，分析时间较短，大大的提高了检测的效率以及检测的灵敏性。本发明的光子晶体微球毛细管柱的构建和检测如图7所示。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明使用预先制备好的光子晶体微球，易于通过调节微球尺寸和表面修饰基团，提高填充柱的应用灵活性；采用常规填充方式制备光子晶体毛细管柱的技术方式，具有操作简单，易于实现规模化生产的优势；(2)利用毛细现象实现样品中赭曲霉毒素A的选择性吸附，操作简单，易于实现现场取样分析；(3)利用核酸适配体上的荧光基团，通过测定样品处理前后荧光值差异，实现样品中赭曲霉毒素A的定量分析；(4)能够一次性检测多个重复样本。

附图说明

图1为具有不同柱塞形状的毛细管(a,b,c和d)及其对应的填充有光子晶体微球的毛细管(e,f,g和h)；

图2为不同粒径光子晶体微球的金相显微镜图像(×20)；(a)油相与水相流速之比为10:10，(b)油相与水相流速之比为10:15，(c)油相与水相流速之比为10:25，(d)油相与水相流速之比为10:35(上述的流速单位均为mL/h)；

图3为荧光核酸适配体修饰前后的微球荧光值；

图4为OTA浓度与猝灭率的关系；

图5为OTA检测标准曲线；

图6为光子晶体毛细管柱的特异性分析；

图7为本发明的检测赭曲霉毒素A的光子晶体微球毛细管柱的构建和检测示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明进一步进行说明。

实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

其中，OTA适配体：5’-NH₂-GAT CGG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-Cy3-3’，上海生工公司合成。

OTA适配体的互补链：5’-BHQ₂-TGT CCG ATG C-3’，上海生工公司合成。

含量5％的200nm二氧化硅乳液或者二氧化硅纳米粒子通过改进的

法制备，或者中国专利201210359576.8，201310279917.5，201710654975.X制备。

结合缓冲液：分别称取0.6057g Tris、3.5064g NaCl、1.1098g CaCl₂、2.033gMgCl₂·6H2O、0.1865g KCl，加入400mL蒸馏水使其溶解后，转移至容量瓶中，利用蒸馏水定容至500mL。

20×SSC+0.1％SDS：20×SSC：称取氯化钠87.6g、二水合柠檬酸钠44.1g，加入400mL蒸馏水，使用玻璃棒将其搅匀，利用1mol/L氢氧化钠和1mol/L盐酸将溶液的pH值调为8.0后，定容至500mL；0.1％SDS：质量分数0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)的20×SSC溶液。

实施例1

取内径约0.5mm透明的玻璃毛细管利用玻璃刀切割成相应的长度，对此毛细管进行图1中所示的4种方式处理。图1a表示将长100mm的毛细管切割成长度为50mm的毛细管，使用酒精灯和镊子，对长50mm的毛细管进行打钩处理，将酒精灯的外延在毛细管前端大约8mm处加热，利用高温使毛细管熔化的原理，当毛细管前端8mm处快要融化时利用镊子进行对折处理即可。图1b表示取100mm的毛细管使用直尺量出50mm的位置，利用玻璃刀进行轻轻划刻标记。在其60mm处使用酒精灯外焰将其熔化，待其快要融化时，将毛细管提拉离开外焰同时水平拉长，此时毛细管中间会逐变细，但不可拉断，最后从50mm标记处利用玻璃刀切断，取较长的一段(即含已经拉长不封的一段)。图1c表示利用玻璃刀将100mm的毛细管切割成50mm的毛细管，将内径略大于0.5mm的SPCMs，将其恰好堵在毛细管的前端。图1d表示取配置好的二氧化硅乳液(含量5％的200nm二氧化硅乳液)，选取按照图1b制作出的毛细管，将其一端插入二氧化硅乳液中，利用毛细管本身的毛细作用力使二氧化硅乳液充满毛细管后，水平取出，将圆头一端保持15°倾斜，室温条件下静置8h，结束后竖直悬挂放置，室温条件下静置2天，取出，利用管式炉550℃烧4h，使毛细管内形成的二氧化硅晶体柱更加稳固，硬度更强，即含二氧化硅纳米粒子自组装的光子晶体柱塞的毛细管柱。

图1中的e、f、g、h分别与本图中的a、b、c、d相对应，分别在其处理的特殊位置放置于金相显微镜下的放大图。图1e毛细管打弯处的两边呈现对称性，中间拐弯处还是有很大内径，不会阻碍液体在毛细管中的流动，也不会影响液体的进入时毛细管两端的压强。图1f一端在拉细，内径在缩小，但不妨碍液体进入毛细管，而且内径缩小的同时也会增加其毛细作用力。图1g前端放一个内径稍大点的SPCMs，在毛细管前端，虽然会在一定程度上阻碍液体进入毛细管，但是SPCMs本身就是大孔洞，液体是无缝不入的，且实验证实液体还是会进入毛细管中。图1h在毛细管的内径中有一段二氧化硅自组装整体柱，这段整体柱本身具有多孔洞的缝隙，可以起到大大增强毛细作用的效果，并且能够排除样品中一些杂质的干扰，起到初步净化作用，表明1d制备的柱子最好。

实施例2

(1)制备光子晶体微球

根据改进的

法制备二氧化硅纳米粒子，并通过微流控自组装平台，采用“油包水”的方式制备蛋白石光子晶体微球(参见文献：Three-dimensional orderedmacroporous magnetic photonic crystal microspheres for enrichment anddetection of mycotoxins(I):Droplet-based microfluidic self-assemblysynthesis，Journal of Chromatography A.2020,1626,461379)；所得微球在60℃烘箱中加热48h，油相中微球呈现透明状即可；先后用正己烷和乙醇洗涤微球，直至液体中无油状物，常温下晾干；最后将微球放于瓷坩埚中，于700℃条件下烧制3h，即获得光子晶体微球载体材料。根据微流控油相和水相相对速度的差异，可以制备不同粒径大小的光子晶体微球，见图2，本发明后续采用图2d制备的光子晶体微球，粒径大小约480μm。

(2)光子晶体微球表面的修饰

微球表面羟基化：配制食人鱼试剂(质量分数98％浓硫酸/质量分数30％双氧水＝7/3(V/V))进行微球的羟基化修饰(10uL/球)：将冷却后的食人鱼试剂倒入装光子晶体微球的离心管中，用封口膜将离心管封口，于脱色摇床上室温震荡反应6h(140rpm)。反应结束后使用蒸馏水反复清洗3-4遍，将多余的蒸馏水吸去，放于100℃烘箱烘3h或者至于60℃烘箱过夜，将微球表面水分烘干后，收集羟基化的微球备用。

微球表面环氧基修饰：将羟基化的微球放入含质量分数5％GPTMS(2,3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷)的甲苯溶液中(10uL/球)，置于60℃震荡摇床中160rpm应6h。反应结束后分别利用甲苯、无水乙醇、蒸馏水反复清洗3-4遍，收集环氧基的微球备用。

(3)制备荧光核酸适配体(OTA-aptamer)修饰的光子晶体微球

OTA-aptamer的修饰：取适量步骤(2)修饰好环氧基的光子晶体微球置于离心管中，每管中加入一定浓度(600nmol/L)的Cy3荧光基团标记的OTA-aptamer(核酸适配体)(2uL/球)。修饰前，所用核酸适配体先在88℃条件下预热5min，保证适配体链打开，放置于室温下稳定30min后再加入微球中，室温下反应过夜(≥12h)。反应结束后，清洗干净(洗液20×SSC+0.1％SDS)，利用氮气吹干，得到核酸适配体功能化光子晶体微球备用。利用倒置荧光显微镜确证荧光核酸适配体成功修饰到光子晶体微球上，见图3。

(4)制备光子晶体微球毛细管柱。

将经过步骤(3)所得核酸适配体功能化光子晶体微球装入按照图1d中处理好的玻璃毛细管中(I.D.＝0.5mm)，制作成光子晶体微球毛细管器件，利用光纤光谱仪检测荧光信号。对于毛细管器件中的每个微球分别进行三次测量取其平均值作为该毛细管柱的荧光信号值。

实施例3

基于实施例2中制备的光子晶体微球毛细管建立实际样品中赭曲霉毒素A的荧光检测方法。

(1)检测OTA标准曲线的建立

标准样品溶液的制备：用结合缓冲液稀释OTA适配体的互补链母液，将其配成15mmol/L的OTA互补链溶液，在88℃水浴锅中加热5min，取出冷却至室温，使用结合缓冲液将OTA稀释为0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL，取一定量的毒素溶液(按照2uL/球计算溶液体积)加入相应的离心管中，与原先的互补链充分混合后，获得标准样品溶液。

检测方法：利用光纤光谱仪检测光子晶体微球毛细管器件的初始荧光信号，记为I0。将实施例2制备出的毛细管器件插入相应的标准样品溶液中，待毛细管中液体体积保持稳定不再变化后，取出毛细管放入培养皿中，保持有15°的倾斜度，且较尖的一段在下方。将其放入45℃恒温培养箱中，反应1.5h后，取出，利用滤纸将毛细管中的液体析出，使用氮气将毛细管中的光子晶体微球吹干，利用光纤光谱仪检测荧光信号值，记为Is。使用下面的公式：荧光猝灭率(η)＝[(I0-Is)/I0]×100％计算得出不同浓度下的光子晶体微球所对应的猝灭率，即可得到不同浓度的OTA与猝灭率对应关系(见图4)，并得出线性范围，绘制标准曲线(见图5)。

(2)光子晶体毛细管柱的特异性分析

特异性测试用样品溶液的制备：用结合缓冲液稀释OTA互补链母液，将其配成15mmol/L的OTA互补链溶液，在88℃水浴锅中加热5min，取出冷却至室温，添加真菌毒素OTA或OTB或AFB1或FB1或ZEN至互补链溶液中，浓度达到100ng/mL。

根据上述(1)中的检测方法，分别获得不同真菌毒素的荧光淬灭率。如图6所示，OTA引起的荧光猝灭率值最低，表明在5％差异水平上，该方法对OTA的特异性较强。

(3)方法回收率的测定

样品的处理：选取市场上常见的三种谷物大米、玉米、小麦进行OTA加标回收率实验。首先选取一定量的大米、玉米、小麦，将其依次通过粉碎机进行粉碎处理，并过100目筛两次。利用电子天平称取四份5.0g的大米，将其分别放置于125mL的锥形瓶中。使用甲醇对OTA母液(1mg/mL)进行稀释，将其稀释到1000ng/mL。分别取0mL、0.25mL、1.25mL、2.5mL分别加入到称好的4份大米样品中，并定容到10mL，盖上木塞。晃动样品，目的是使锥形瓶内的样品与毒素充分混合，待混合均匀后，取下木塞，放于通风橱中，待甲醇挥发。玉米、小麦如上述大米同样的操作，依次进行。

样品中赭曲霉毒素A的提取：在上述处理后的样品中，分别加入1g氯化钠和25mL甲醇的水溶液，其中甲醇的水溶液是采用水：甲醇为20:80(v:v)的比例配制。盖上木塞充分摇晃使其混匀。将混匀的样品放于均质机中均质1min后取出，在室温条件下放于摇床中180rpm的速度摇晃30min。摇晃结束后，首先使用玻璃棒和定性滤纸将萃取液(水/甲醇＝20/80(v/v))进行过滤，其次使用450nm的有机滤头进行过滤，收集滤液，在12000rpm的高速离心机中离心10min，收集上清液备用。

实际样品的制备和测量：将收集的上清液25mL吹干后，加入一定量的结合缓冲液，将其稀释至相应的浓度(10ng/mL、1ng/mL)。采用上述实施例3中(1)中所述方法测试样品溶液的荧光淬灭率，并采用标准曲线法进行定量分析，计算回收率在85-108％之间，证明了该方法的准确性，不同谷物中OTA的回收率如表1。本发明对赭曲霉毒素A的线性检测范围可达到1-100ng/mL，检测限检为0.02ng/mL，样品量仅需2μL/每微球，同时一次可以将样品富集、净化和检测完成，时间小于2小时。

表1

而采用现有普通ELISA方法加标回收率的检测结果，如表2所示，说明本发明光子晶体微球毛细管柱在赭曲霉毒素A的检测，与普通ELISA方法检测OTA毒素的结果接近，该方法可行。

表2

Claims (9)

1.一种用于检测赭曲霉毒素A的光子晶体微球毛细管柱，其特征在于，所述光子晶体微球毛细管柱以二氧化硅纳米粒子自组装的光子晶体为柱塞，以表面修饰有能够特异性识别赭曲霉毒素A的荧光核酸适配体的光子晶体微球为填料，以填充方式制备而成。

2.根据权利要求1所述的用于检测赭曲霉毒素A的光子晶体微球毛细管柱，其特征在于，所述能够特异性识别赭曲霉毒素A的荧光核酸适配体为5’-NH₂-GAT CGG TGG GTG GCGTAA AGG GAG CAT CGG ACA-Cy3-3’。

3.一种权利要求1所述的光子晶体微球毛细管柱的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)光子晶体微球的制备；

(2)光子晶体微球表面的修饰：采用双氧水与浓硫酸的混合液处理步骤(1)制备的光子晶体微球，再用2,3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷对微球表面进行环氧基团的修饰；

(3)荧光核酸适配体的固定：通过环氧开环反应将含有荧光基团的能够特异性识别赭曲霉毒素A的适配体固定于经过步骤(2)表面修饰的微球表面；

(4)制备毛细管柱的柱塞：取毛细管取中间部位标记，在中间偏左或右的位置加热使其熔化，待其快要融化时，将毛细管提拉同时向双向水平拉长，但不可拉断，最后中间标记处切断，将较长的毛细管插入二氧化硅乳液中，使二氧化硅乳液充满毛细管后，水平取出，倾斜，室温条件下静置，结束后竖直悬挂放置，再煅烧以形成二氧化硅光子晶体柱即得到含二氧化硅纳米粒子自组装的光子晶体柱塞的毛细管柱；将经过步骤(4)制备得到的微球填充到具有该柱塞的毛细管柱中，获得光子晶体微球毛细管柱。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)通过中间偏左或右的位置为毛细管取中间部位偏左或者右10-15mm。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所用毛细管的材质优选为透明玻璃或石英，内径小于或等于0.5mm。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述光子晶体微球的粒径小于或等于0.5mm，与毛细管内径相匹配。

7.一种权利要求1所述的光子晶体微球毛细管柱在赭曲霉毒素A的选择性吸附中的应用。

8.一种权利要求1所述的光子晶体微球毛细管柱在赭曲霉毒素A的定量检测分析中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述定量检测分析，将利用光子晶体微球毛细管柱的毛细作用选择性吸附样品中的赭曲霉毒素A，经过清洗后，测定该微球的荧光信号值，同时测定空白荧光信号值，根据荧光信号差值采用标准曲线法进行赭曲霉毒素A的定量分析。

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