CN113189025B - 一种超灵敏无标记快速检测蓖麻毒素的光子晶体传感材料及其制备方法与应用 - Google Patents

一种超灵敏无标记快速检测蓖麻毒素的光子晶体传感材料及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种超灵敏无标记快速检测蓖麻毒素的光子晶体传感材料及其制备方法与应用。该光子晶体传感材料为连接有H1序列的蛋白石SiO2‑AuNPs光子晶体，所述蛋白石SiO2‑AuNPs光子晶体由修饰金纳米颗粒的二氧化硅微球悬浮液经重力垂直沉降自组装堆垒形成，所述H1序列如SEQID NO：1所示。本发明的传感材料制备简单，操作方便，具有优异的响应性能，成本较低，检测限可达2.089fg/mL。

Description

一种超灵敏无标记快速检测蓖麻毒素的光子晶体传感材料及 其制备方法与应用
技术领域
本发明属于毒素检测领域，具体地，涉及一种超灵敏无标记快速检测蓖麻毒素的光子晶体传感材料及其制备方法与应用。
背景技术
蓖麻，拉丁学名Ricinus communis L.，原产于非洲东北部的索马里和肯尼亚，在全球热带地区均有广泛分布。蓖麻属于大戟科、蓖麻属的一年生或多年生草本植物，在热带地区常形成多年生的小乔木或灌木。蓖麻植株的茎、叶或蓖麻的籽实中含有有毒物质，主要包括蓖麻毒素、蓖麻碱、蓖麻反应原等。蓖麻毒素经化学提纯后，通常呈现出颗粒状、粉末状或雾状的形态。其能够溶于弱酸或水中，且理化性质较为稳定，不易被高低温所影响。蓖麻毒素作为剧毒蛋白质，其往往只需极少的剂量，就足以杀死一个成年人。其毒性高于氰化物的6000倍。一克高纯度的蓖麻毒素，甚至可令3000人中毒身亡。而且蓖麻毒素的分离与提取相对较为容易。
毒素相对金属武器更加隐蔽和高效，对人类生命安全造成极大威胁。因此，开发灵敏、高效的检测手段是应对威胁的主要措施。
CN109852673A公开了一种用于在复杂基质中检测活性蓖麻毒素的金/量子点纳米探针及其应用。该金/量子点纳米探针是利用脱氧核糖核苷酸单链(ssODN)修饰的金纳米微粒和量子点通过碱基配对杂交的方式形成脱氧核糖核苷酸双链，将金纳米微粒和量子点组装为核-卫星结构的纳米探针。该专利用金/量子点纳米探针用于检测活性蓖麻毒素，检测限为7.46ng/mL。该专利公开的金/量子点纳米探针虽可实现活性蓖麻毒素的检测，但是制备和检测步骤复杂，并且检测限也有待进一步提高。因此，有必要进一步开发更加简便、检测限更低的检测手段。
发明内容
针对现有技术的缺点，本发明要解决的技术问题是提供一种制作简单、操作便捷、灵敏度高的光子晶体传感检测材料，以实现对食品中痕量蓖麻毒素超灵敏无标记快速检测。
为了实现上述目的，本发明提供一种超灵敏无标记快速检测蓖麻毒素的光子晶体传感材料，该光子晶体传感材料为连接有H1序列的蛋白石SiO2-AuNPs光子晶体，所述蛋白石SiO2-AuNPs光子晶体由修饰金纳米颗粒的二氧化硅微球悬浮液经重力垂直沉降自组装堆垒形成，所述H1序列如SEQ ID NO：1所示：5'-SH C6-GAC CTA CTT ATG AAA AAA AAA AAATTA TAT CTA TCT-3'(SEQ ID NO：1)。
优选地，所述光子晶体传感材料由包括以下步骤的方法制得：使用金纳米颗粒修饰氨基化的二氧化硅微球，将修饰金纳米颗粒的二氧化硅微球悬浮液滴加在多孔板中，通过重力垂直沉降自组装的方法，堆垒形成蛋白石SiO2-AuNPs光子晶体；在光子晶体制备完成后，将巯基化的H1序列通过Au-S键固定在光子晶体上，获得以H1序列为识别元件的光子晶体传感材料。
具体地，所述方法包括以下步骤：
S1.利用Duff's法合成金纳米颗粒
将去离子水、NaOH溶液和四羟甲基氯化磷混合均匀，然后快速加入四氯金酸溶液，在室温条件下避光搅拌进行反应，反应完成后将反应液避光保存；
S2.SiO2-AuNPs微球的制备
将氨基化二氧化硅微球的水相悬浮液和金纳米颗粒水溶液混合，超声使溶液混合均匀，在室温条件下避光搅拌进行反应，将所得产物多次离心重悬，以除去未修饰在微球上的金纳米颗粒，最后，将深酒红色沉淀超声分散于去离子水中，以获得SiO2-AuNPs悬浮液；
S3.基于巯基化的H1序列光子晶体传感材料的制备
将SiO2-AuNPs悬浮液加入聚苯乙烯多孔板中，置于真空干燥箱中干燥，通过微球的重力沉降自组装获得堆垒在多孔板底部的光子晶体,将修饰巯基的H1序列加热变性，然后逐渐恢复至室温，使用PBS缓冲液将寡核苷酸序列稀释，将含有H1序列的稀释液滴加在多孔板的SiO2-AuNPs光子晶体上，37℃孵育，通过Au-S键在光子晶体上修饰H1序列，制备得到H1寡核苷酸序列修饰的光子晶体传感材料。
更具体地，所述方法包括以下步骤：
S1.利用Duff's法合成2-3nm的金纳米颗粒
在100mL的三口圆底烧瓶中加入45mL去离子水，在室温条件下(25℃)加入250μL2mol/L NaOH溶液和12μL四羟甲基氯化磷(THPC)，在室温条件下(25℃)用磁力搅拌器以800r/min的速度搅拌5分钟，使溶液混合均匀，之后将2mL 1％四氯金酸溶液快速加入混合溶液中，溶液立即变成红棕色，在室温条件下(25℃)用磁力搅拌器以700r/min的速度避光搅拌12小时；反应完成后将反应液用棕色广口瓶存放，置于4℃冰箱避光保存；
S2.SiO2-AuNPs微球的制备
将10mL 1％230nm的氨基化二氧化硅微球的水相悬浮液和2-3nm的金纳米颗粒水溶液等体积混合，超声10分钟，使溶液混合均匀，在室温条件下(25℃)用磁力搅拌器以700r/min的速度避光搅拌6小时，将所得产物6000rpm离心15分钟，去上清液留沉淀，加入适量的去离子水超声重悬，再离心再超声重悬反复三次，以除去未修饰在微球上的金纳米颗粒，最后，将深酒红色沉淀超声分散于10mL去离子水中，以获得1％SiO2-AuNPs悬浮液，4℃存储备用；
S3.基于巯基化的H1序列光子晶体传感材料的制备
将1％SiO2-AuNPs悬浮液加入聚苯乙烯24孔板中，每孔600μL，并置于60℃的真空干燥箱中干燥24小时，通过微球的重力沉降自组装获得堆垒在24孔板底部的光子晶体，将10μM修饰巯基的H1序列在95℃的金属浴中加热5分钟，然后逐渐恢复至室温，使用PBS缓冲液将寡核苷酸序列稀释，将50μL 10μM H1序列滴加在24孔板SiO2-AuNPs光子晶体，在恒温培养箱中以37℃孵育12小时，通过Au-S键在光子晶体上修饰H1序列，制备得到H1寡核苷酸序列修饰的光子晶体传感材料。
本发明还提供所述光子晶体传感材料的制备方法，包括以下步骤：使用金纳米颗粒修饰氨基化的二氧化硅微球，将修饰金纳米颗粒的二氧化硅微球悬浮液滴加在多孔板中，通过重力垂直沉降自组装的方法，堆垒形成蛋白石SiO2-AuNPs光子晶体；在光子晶体制备完成后，将巯基化的H1序列通过Au-S键固定在光子晶体上，获得以H1序列为识别元件的光子晶体传感材料。
本发明的光子晶体传感材料可用于快速检测蓖麻毒素中。
本发明光子晶体传感材料的检测原理如下：活性蓖麻毒蛋白通过B链介导的内吞作用进入真核细胞，随后蛋白链间二硫键被还原裂解，游离出A链。A链是一种蛋白酶，从28SrRNA中水解腺嘌呤N-糖甙键，使其脱去腺嘌呤，导致蛋白质合成的抑制，最终细胞死亡。根据此原理，设计含有连续多个腺嘌呤的寡核苷酸序列H1，当存在蓖麻毒素时，蓖麻毒素会脱去腺嘌呤，使得H1断裂，引起光子晶体折射率改变，从而引起衍射峰强度的改变，产生可测的响应信号，达到检测目的。
通过聚苯乙烯凝胶电泳实验、SYBR Green1荧光实验和NUPACK软件对DNA序列进行优化和设计。最终选择修饰巯基的H1序列如SEQ ID NO：1所示，5'-SH C6-GAC CTA CTT ATGAAA AAA AAA AAA TTA TAT CTA TCT-3'(36bp)(SEQ ID NO：1)，巯基化的H1序列作为识别元件。
本发明还提供一种超灵敏无标记快速检测蓖麻毒素的方法，包括以下步骤：向上述光子晶体传感材料中加入缓冲液，将光纤光谱仪探头垂直固定，待光子晶体传感材料衍射峰稳定后，用光纤光谱仪记录衍射峰的强度和位置，向稳定的传感体系中加入含蓖麻毒素的待测样品，30分钟后用光纤光谱仪记录其衍射光谱，根据衍射光谱的衍射峰值计算待测样品中蓖麻毒素的含量。
优选地，该方法还包括预先建立检测蓖麻毒素的标准曲线：向上述光子晶体传感材料中加入缓冲液，将光纤光谱仪探头垂直固定，待光子晶体传感材料衍射峰稳定后，用光纤光谱仪记录衍射峰的强度和位置，向稳定的传感体系中加入一系列不同浓度的蓖麻毒素标准溶液，30分钟后用光纤光谱仪记录其衍射光谱，根据衍射光谱的衍射峰值和对应浓度建立标准曲线。后续检测时，可直接将测得的衍射峰值代入标准曲线，计算出待测样品中蓖麻毒素的含量。
本发明在制备光子晶体传感材料的过程中优化了识别元件H1孵育浓度，在最优条件下制备的光子晶体传感材料可以更加准确灵敏的对蓖麻毒素进行识别。将AuNPs均匀修饰在氨基化二氧化硅微球表面，使得SiO2-AuNPs光子晶体传感材料具有良好的生物相容性，可以保持H1序列活性和结构，其次，均匀修饰在微球表面的AuNPs为巯基化的H1序列提供更多的结合位点，提高了H1序列的修饰率，增加了光子晶体传感材料的灵敏性。修饰在光子晶体上的H1序列被目标物切割溶解，改变了光子晶体传感材料的折射率，从而引起衍射峰强度降低。本发明的传感材料制备简单，操作方便，具有优异的响应性能，成本较低，检测限可达2.089fg/mL。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1为NUPACK软件模拟H1序列构型的结果。
图2a为SiO2-AuNPs微球TEM表征图，图2b为SiO2-AuNPs堆垒光子晶体的SEM表征图。
图3为SiO2-AuNPs堆垒光子晶体光学图片。
图4a为光子晶体传感材料对蓖麻毒素的响应情况；图4b为检测蓖麻毒素的标准曲线。
图5为光子晶体传感对不同浓度蓖麻毒素类似物响应情况；其中，a：对相思子毒素的响应情况；b：对赭曲霉毒素的响应情况；c：对BSA的响应情况；d：对OVA的响应情况；e：对玉米赤霉烯酮的响应情况；f：对呕吐毒素的响应情况。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
实施例中，H1序列如SEQ ID NO：1所示：5'-SH C6-GAC CTA CTT ATG AAA AAA AAAAAA TTA TAT CTA TCT-3'(SEQ ID NO：1)。NUPACK软件模拟H1序列构型的结果如图1所示。NUPACK软件分析条件设置：Nucleic acid type:DNA Temperature:37℃Number of strandspecies:1Maximum complex size:2strand Concentration:1μM。可以看出，序列是呈直链型的，不会自身折叠成环，使得A序列充分暴露，便于毒素的识别与切割。
实施例1
本实施例用于说明本发明食品中痕量蓖麻毒素无标记快速检测的光子晶体传感材料，具体包括以下步骤：
1)利用Duff's法合成2-3nm的金纳米颗粒
在100mL的三口圆底烧瓶中加入45mL去离子水，在室温条件下(25℃)加入250μL2mol/L NaOH溶液和12μL四羟甲基氯化磷(THPC)，在室温条件下(25℃)用磁力搅拌器以800r/min的速度搅拌5分钟，使溶液混合均匀，之后将2mL 1％四氯金酸溶液快速加入混合溶液中，溶液立即变成红棕色，在室温条件下(25℃)用磁力搅拌器以700r/min的速度避光搅拌12小时。反应完成后将反应液用棕色广口瓶存放，置于4℃冰箱避光保存。
2)SiO2-AuNPs微球的制备
将10mL 1％230nm的氨基化二氧化硅微球的水相悬浮液和2～3nm的金纳米颗粒水溶液等体积混合超声10分钟，使溶液混合均匀，在室温条件下(25℃)用磁力搅拌器以700r/min的速度避光搅拌6小时。将所得产物6000rpm离心15分钟，去上清液留沉淀，加入适量的去离子水超声重悬，再离心再超声重悬反复三次，以除去未修饰在微球上的金纳米颗粒，最后，将深酒红色沉淀超声分散于10mL去离子水中，以获得1％SiO2-AuNPs悬浮液。4℃存储备用。通过TEM对SiO2-AuNPs的形貌进行表征。如图2a所示。
3)基于巯基化的H1序列光子晶体传感材料的制备
将均匀分散的1％SiO2-AuNPs悬浮液加入聚苯乙烯24孔板中，每孔600μL，并在60℃的真空干燥箱中干燥24小时。通过微球的重力沉降自组装获得堆垒在24孔板底部的光子晶体。将10μM修饰巯基的H1序列置于金属浴中95℃加热5分钟，然后逐渐恢复至室温，使用PBS缓冲液将寡核苷酸序列稀释，将50μL 10μM H1序列滴加在24孔板SiO2-AuNPs光子晶体，在恒温恒湿培养箱中以37℃孵育12小时，通过Au-S键在光子晶体上修饰H1序列，建立H1寡核苷酸序列光子晶体传感材料。
通过SEM对SiO2-AuNPs堆垒光子晶体的形貌进行表征。如图2b所示。SiO2-AuNPs堆垒光子晶体光学图片如图3所示。
4)传感材料检测范围及检测限研究
向传感材料中加入2mL PBS缓冲液，将光纤光谱仪探头垂直固定，待光子晶体传感材料衍射峰稳定后，用光纤光谱仪记录衍射峰的强度和位置，向稳定的传感体系中依次加入不同浓度的蓖麻毒素(从1fg/mL到1μg/mL)，30分钟后用光纤光谱仪记录其衍射光谱。随着蓖麻毒素浓度的增加，衍射峰的强度逐渐降低(图4a)。图4b表明,衍射峰的减少量与蓖麻毒素浓度的对数相关，线性范围分别为10fg/mL到1μg/mL。拟合的线性方程为y＝6.02x+37.14(R2＝0.9966)，检出限为2.089fg/mL。
5)传感材料的特异性研究
使用该传感材料对与蓖麻毒素结构和功能的相似物进行检测，分别为相思子毒素(abrin)，赭曲霉毒素(OTA)，牛血清蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，玉米赤霉烯酮(ZEN)，呕吐毒素(DON)。按照相同检测方法，分别依次检测不同浓度的类似物(1fg/mL、100fg/mL、10pg/mL、1ng/mL和1μg/mL)，用光纤光谱仪记录传感材料对不同浓度类似物的响应情况。图5为光子晶体传感对不同浓度蓖麻毒素类似物响应情况；a：对相思子毒素的响应情况；b：对赭曲霉毒素的响应情况；c：对BSA的响应情况；d：对OVA的响应情况；e：对玉米赤霉烯酮的响应情况；f：对呕吐毒素的响应情况。
实验条件优化
(1)传感材料制备条件优化
该传感材料以H1序列作为识别元件，所以其修饰效果将直影响传感材料检测性能，因此，需要优化H1序列孵育浓度，首先使用0.5μM、1μM、5μM、10μM和15μM的H1序列与光子晶体进行孵育，孵育后检测不同浓度蓖麻毒素标准品，使用光纤光谱仪记录其衍射峰的位置及强度。结果表明，当孵育H1序列浓度为10μM时，光子晶体传感材料对蓖麻毒素响应更灵敏，响应范围更宽。
(2)光子晶体传感材料对蓖麻毒素的响应时间优化
向传感材料中加入2mL PBS缓冲液(pH＝7.4)，将光纤光谱仪的探头垂直固定于传感材料表面，在衍射峰达到稳定状态后开始检测，加入100ng/mL的蓖麻毒素，每分钟记录一次衍射峰的位置及强度，衍射峰强度逐渐降低，由于蓖麻毒素类似酶的催化性质，会不断切割溶解H1序列，因此不会达到平衡状态，故选择30分钟作为检测时间，既保证检测效果，又可以缩短响应时间。可以满足快速检测的需求。
测试例
采用上述方法对饮用水和脱脂牛奶进行加标检测，结果如表1所示。可以看出，本发明的检测方法具有较高的准确性和灵敏度。
表1
Figure GDA0003930109210000091
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
序列表
<110> 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所
<120> 一种超灵敏无标记快速检测蓖麻毒素的光子晶体传感材料及其制备方法与应用
<130> BJI2002277PY
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gacctactta tgaaaaaaaa aaaattatat ctatct 36

Claims (2)

1.一种无标记快速检测蓖麻毒素的方法，包括以下步骤：向光子晶体传感材料中加入缓冲液，将光纤光谱仪探头垂直固定，待光子晶体传感材料衍射峰稳定后，用光纤光谱仪记录衍射峰的强度和位置，向稳定的传感体系中加入含蓖麻毒素的待测样品，30分钟后用光纤光谱仪记录其衍射光谱，根据衍射光谱的衍射峰值计算待测样品中蓖麻毒素的含量，所述光子晶体传感材料为连接有H1序列的蛋白石SiO2-AuNPs光子晶体，所述蛋白石SiO2-AuNPs光子晶体由修饰金纳米颗粒的二氧化硅微球悬浮液经重力垂直沉降自组装堆垒形成，所述H1序列为：
5'-SH C6-GAC CTA CTT ATG AAA AAA AAA AAA TTA TAT CTA TCT-3'；
所述方法包括以下步骤：
S1. 利用Duff's法合成金纳米颗粒
将去离子水、NaOH溶液和四羟甲基氯化磷混合均匀，然后快速加入四氯金酸溶液，在室温条件下避光搅拌进行反应，反应完成后将反应液避光保存；
S2. SiO2-AuNPs微球的制备
将氨基化二氧化硅微球的水相悬浮液和金纳米颗粒水溶液混合，超声使溶液混合均匀，在室温条件下避光搅拌进行反应，将所得产物多次离心重悬，以除去未修饰在微球上的金纳米颗粒，最后，将深酒红色沉淀超声分散于去离子水中，以获得SiO2-AuNPs悬浮液；
S3. 基于巯基化的H1序列光子晶体传感材料的制备
将1% SiO2-AuNPs悬浮液加入聚苯乙烯24孔板中，每孔600μL，并置于60℃的真空干燥箱中干燥24小时，通过微球的重力沉降自组装获得堆垒在24孔板底部的光子晶体，将10μM修饰巯基的H1序列在95℃的金属浴中加热5分钟，然后逐渐恢复至室温，使用PBS缓冲液将寡核苷酸序列稀释，将50μL 10μM H1序列滴加在24孔板SiO2-AuNPs光子晶体，在恒温培养箱中以37℃孵育12小时，通过Au-S键在光子晶体上修饰H1序列，制备得到H1寡核苷酸序列修饰的光子晶体传感材料。
2.根据权利要求1所述的无标记快速检测蓖麻毒素的方法，其中，该方法还包括预先建立检测蓖麻毒素的标准曲线：向权利要求1所述的光子晶体传感材料中加入缓冲液，将光纤光谱仪探头垂直固定，待光子晶体传感材料衍射峰稳定后，用光纤光谱仪记录衍射峰的强度和位置，向稳定的传感体系中加入一系列不同浓度的蓖麻毒素标准溶液，30分钟后用光纤光谱仪记录其衍射光谱，根据衍射光谱的衍射峰值和对应浓度建立标准曲线。
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