CN112198121A - 一种用于seb超灵敏检测的光子晶体传感材料及其制备方法和超灵敏检测seb的方法 - Google Patents

一种用于seb超灵敏检测的光子晶体传感材料及其制备方法和超灵敏检测seb的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于毒素检测领域，涉及一种用于SEB超灵敏检测的光子晶体传感材料及其制备方法和超灵敏检测SEB的方法。包括以下步骤：将原硅酸四乙基酯进行水解反应制得硅球；将硅球与3‑氨丙基三乙氧基硅烷混合反应制得氨基化硅球；将氨基化硅球的水溶液与纳米金溶液进行接触反应，获得修饰纳米金颗粒的氨基化硅球SiO2‑AuNPs，然后配制为SiO2‑AuNPs微球悬浮液，置于恒温干燥箱中干燥、进行堆垒，制得光子晶体；将5'端修饰有巯基的SEB适配体加入SiO2‑AuNPs光子晶体中，孵育得到SEB适配体‑光子晶体传感材料。本发明的光子晶体传感材料可以实现SEB的超灵敏、无标记检测。

Description

一种用于SEB超灵敏检测的光子晶体传感材料及其制备方法 和超灵敏检测SEB的方法
技术领域
本发明属于毒素检测领域，具体地，涉及一种用于SEB超灵敏检测的光子晶体传感材料的制备方法，由该制备方法制得的用于SEB超灵敏检测的光子晶体传感材料，以及一种超灵敏检测SEB的方法。
背景技术
食品及环境中的生物毒素污染具有来源广泛、种类繁多等特点，对人类健康、经济发展甚至社会安全构成潜在威胁并产生严重危害。其中，金黄色葡萄球菌肠毒素B容易引起食物中毒事件且致死量极低，还被列为“潜在生物战剂”。因此，对食品、环境样本中的SEB进行定量检测受到国际组织及各国政府监管部门的高度重视。
目前，灵敏度高且结果可靠的检测方法往往依赖于昂贵的实验设备，操作流程较繁复，且检测过程所需时间较长，无法满足快速便捷检测的需求。
发明内容
针对现有技术的缺点，本发明的目的是提供一种用于SEB超灵敏检测的光子晶体传感材料及其制备方法和超灵敏检测SEB的方法，以实现食品中SEB的快速超灵敏定量检测。
为了实现上述目的，本发明提供一种用于SEB超灵敏检测的光子晶体传感材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)在无水乙醇和氨水的存在下，将原硅酸四乙基酯进行水解反应，去除所述无水乙醇和剩余氨水，离心筛分粒径，制得硅球；
(2)在无水乙醇的存在下，将所述硅球与3-氨丙基三乙氧基硅烷混合，超声、充氮除氧后，进行搅拌反应，制得氨基化硅球；
(3)将所述氨基化硅球的水溶液与纳米金溶液进行接触反应，获得修饰纳米金颗粒的氨基化硅球SiO2-AuNPs；
(4)将所述修饰纳米金颗粒的氨基化硅球SiO2-AuNPs充分混匀，配制为SiO2-AuNPs微球悬浮液，置于恒温干燥箱中干燥、进行堆垒，制得光子晶体；
(5)将5'端修饰有巯基的SEB适配体在金属浴中加热，然后在室温下放置，然后加入PBS缓冲液将SEB适配体稀释为适配体稀释液，将所述适配体溶液加入步骤(4)所得的SiO2-AuNPs光子晶体中，在恒温培养箱中孵育，通过Au-S键在光子晶体上修饰SEB适配体，得到SEB适配体-光子晶体(SEB Aptamer-PC)传感材料。
根据本发明，优选地，步骤(1)中，所述原硅酸四乙基酯与氨水的体积比为0.6-1.0：1，所述水解反应的温度为20-40℃，反应时间为6-12h。
根据本发明，优选地，步骤(2)中，所述硅球与3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为2-10：1，所述搅拌反应的温度为60-80℃，反应时间为1-10h。
根据本发明，优选地，步骤(3)中，所述氨基化硅球与纳米金溶液的体积比为0.5-2：1，所述接触反应的温度为20-28℃，反应时间为1-10h。
根据本发明，优选地，步骤(4)中，所述SiO2-AuNPs微球悬浮液的浓度为0.5-1.5％；所述干燥的的温度为50-70℃，时间为20-28小时。
根据本发明，优选地，步骤(5)中，SEB适配体的序列如SEQ ID NO：1所示且5’端修饰有巯基，
5’-SH-TTTTTTTTTTGGTATTGAGGGTCGCATCCACTGGTCGTTGTTGTCTGTTGTCTGTTATGTTGTTTCGTGATGGCTCTAACTCTCCTCT-3’(SEQ ID NO：1)。
根据本发明，优选地，金属浴加热的温度为90-98℃，金属浴加热的时间为2-10分钟；在室温下放置的时间为0.8-1.2小时；孵育的温度为36-38℃，时间为20-28小时。
根据本发明，优选地，步骤(5)中，孵育结束后，使用PBS缓冲液洗涤以除去未结合在光子晶体上的适配体。
根据本发明，所述纳米金溶液可通过常规的方法制备，例如，将四羟甲基氯化磷(THPC)和氢氧化钠加入水中，剧烈搅拌，然后快速加入氯金酸，溶液颜色变为深棕色，避光搅拌过夜，得到纳米金溶液。其中，所述四羟甲基氯化磷溶液与氯金酸的体积比为0.002-0.008:1。
本发明第二方面提供由上述制备方法制得的用于SEB超灵敏检测的光子晶体传感材料。
本发明第三方面提供一种超灵敏检测SEB的方法，包括以下步骤：
(1)将上述光子晶体传感材料浸泡在PBS缓冲液中，把光纤光谱仪的探头垂直固定在光子晶体上方并浸入液面下，获得光子晶体的反射光谱图；
(2)待体系稳定后，依次加入不同浓度的SEB，使体系的SEB浓度成为0.01fg/mL～1μg/mL，分别记录稳定后的反射峰；
(3)以SEB浓度的对数为横坐标，反射峰强度的变化量为纵坐标，建立工作曲线；
(4)将待测样品加入到光子晶体传感体系中，待体系稳定后，记录反射峰的变化，根据变化量，通过工作曲线计算出SEB的含量。
根据本发明的方法，当所述待测样品为牛奶样品时，该方法还包括对待测样品的预处理步骤：以6000-8000rpm离心10-30分钟以除去脂肪，用PBS缓冲液稀释400-600倍。
本发明的光子晶体传感材料可以实现SEB的超灵敏、无标记检测。使用SiO2-AuNPs微球堆垒的SiO2-AuNPs光子晶体不仅具有显著的光学信号，还提高了光子晶体的生物相容性和适配体的修饰率。该传感材料制备简单，操作便捷，检测范围更宽且灵敏度更高。这主要归因于生物识别元件与光学材料的高效结合，使得适配体能够充分发挥其识别功能，并且，这种目标物识别引起的改变能够通过光学信号输出而无需额外标记或染色。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1a和图1b分别示出了SiO2-AuNPs光子晶体的光学图像和反射光谱。
图2a示出了SiO2-AuNPs光子晶体SEM 2D图像；图2b示出了SiO2-AuNPs光子晶体SEM3D图像。
图3a示出了Aptamer-PC传感材料对SEB的响应情况；图3b示出了SEB浓度对数与反射峰强度变化量的关系；图3c示出了检测SEB的标准曲线。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
实施例1
光子晶体传感材料的制备
(1)在洗涤干净的干燥烧瓶中加入150mL无水乙醇和9mL氨水混匀，再加入7.2mL原硅酸四乙基酯(TEOS)，30℃下剧烈搅拌，转速600rpm,反应9小时；反应结束后将剩余氨水和无水乙醇通过离心的方法去除(转速4000rpm)，然后重新分散在无水乙醇中，通过离心筛分粒径(800rpm取上清，1500rpm取沉淀)，最后将制得的胶体颗粒(硅球)分散在10mL无水乙醇中保存；
(2)取合成的硅球1mL并用无水乙醇稀释到10mL，将其置于50mL的烧瓶中，加入200μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)并超声5min，然后充氮除氧30min，最后在70℃条件下机械搅拌6小时，反应完成后用乙醇洗3次，得到氨基化硅球，并重悬于无水乙醇中；
(3)将12μL质量浓度为80％的四羟甲基氯化磷(THPC)和0.25μL2mol/L的氢氧化钠加入45mL水中，剧烈搅拌5min，然后快速加入2mL 1％的氯金酸，溶液颜色变为深棕色，避光搅拌过夜，得到纳米金溶液；将氨基化硅球重新分散在10mL水中，加入10mL上述获得的纳米金溶液，混合超声15min，然后在室温下搅拌6小时，反应完成后离心洗涤5次，得到修饰纳米金颗粒的氨基化硅球SiO2-AuNPs；
(4)将SiO2-AuNPs微球重悬于水中，配制为1％SiO2-AuNPs微球悬浮液，添加到24孔标准透明板中，每孔600μL，并在60℃的恒温干燥箱中干燥24小时。通过微球的重力沉降自组装获得堆垒在微孔板底部的光子晶体。如图1a-1b、图2a-2b所示，图1a和图1b分别示出了SiO2-AuNPs光子晶体的光学图像和反射光谱，图2a示出了SiO2-AuNPs光子晶体SEM 2D图像，图2b示出了SiO2-AuNPs光子晶体SEM 3D图像。
(5)将在5'端修饰巯基的SEB适配体(序列如SEQ ID NO：1所示)在95℃的金属浴中加热5分钟，然后在室温下放置1小时。使用PBS缓冲液将适配体稀释。将30μL适配体溶液加入24孔板SiO2-AuNPs光子晶体，在恒温培养箱中以37℃孵育24小时，通过Au-S键在光子晶体上修饰SEB适配体，构建SEB适配体-光子晶体(SEB Aptamer-PC)传感材料。孵育结束后，使用PBS缓冲液洗涤3次以除去未结合在光子晶体上的适配体。
实施例2
检测工作曲线的绘制
(1)将光子晶体传感材料浸泡在PBS缓冲液中(pH为7.4)，把光纤光谱仪的探头垂直固定在光子晶体上方并浸入液面下，获得光子晶体的反射光谱图；
(2)待体系稳定后，依次加入不同浓度的SEB，使体系的SEB浓度成为0.01fg/mL～1μg/mL，分别记录稳定后的反射峰；
(3)以SEB浓度的对数为横坐标，反射峰强度的变化量为纵坐标，建立工作曲线。如图3a-3c所示，图3a示出了Aptamer-PC传感材料对SEB的响应情况；图3b示出了SEB浓度对数与反射峰强度变化量的关系；图3c示出了检测SEB的标准曲线。
实施例3
(1)牛奶样品，以8000rpm离心15分钟以除去脂肪，再用PBS缓冲液稀释500倍；
(2)向上述处理后的样品中分别加入不同浓度的SEB标准品，使之成为不同浓度的加标样品(0.1pg/mL，1pg/mL以及100pg/mL)；
(3)将上述加标样品依次加入传感系统中，待稳定后，记录反射峰的强度变化，并计算加标回收率。结果见下表1：
表1牛奶样品中SEB的检测结果
Figure BDA0002669699930000061
注：N.D.*为未检出SEB。
由表1结果可以看出，牛奶样品的加标回收率为100.63％～114.98％，表明本发明方法的准确性较好。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
序列表
<110> 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所
<120> 一种用于SEB超灵敏检测的光子晶体传感材料及其制备方法和超灵敏检测SEB的方法
<130> BJI2001393PY
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttttttttt ggtattgagg gtcgcatcca ctggtcgttg ttgtctgttg tctgttatgt 60
tgtttcgtga tggctctaac tctcctct 88

Claims (10)

1.一种用于SEB超灵敏检测的光子晶体传感材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)在无水乙醇和氨水的存在下，将原硅酸四乙基酯进行水解反应，去除所述无水乙醇和剩余氨水，离心筛分粒径，制得硅球；
(2)在无水乙醇的存在下，将所述硅球与3-氨丙基三乙氧基硅烷混合，超声、充氮除氧后，进行搅拌反应，制得氨基化硅球；
(3)将所述氨基化硅球的水溶液与纳米金溶液进行接触反应，获得修饰纳米金颗粒的氨基化硅球SiO2-AuNPs；
(4)将所述修饰纳米金颗粒的氨基化硅球SiO2-AuNPs充分混匀，配制为SiO2-AuNPs微球悬浮液，置于恒温干燥箱中干燥、进行堆垒，制得光子晶体；
(5)将5'端修饰有巯基的SEB适配体在金属浴中加热，然后在室温下放置，然后加入PBS缓冲液将SEB适配体稀释为适配体稀释液，将所述适配体溶液加入步骤(4)所得的SiO2-AuNPs光子晶体中，在恒温培养箱中孵育，得到SEB适配体-光子晶体传感材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(1)中，所述原硅酸四乙基酯与氨水和无水乙醇的体积比为0.6-1.0：1：10-20，所述水解反应的温度为20-40℃，反应时间为6-12h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(2)中，所述硅球与3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为2-10：1，所述搅拌反应的温度为60-80℃，反应时间为1-10h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(3)中，所述氨基化硅球与纳米金溶液的体积比为0.5-2：1，所述接触反应的温度为20-28℃，反应时间为1-10h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(4)中，所述SiO2-AuNPs微球悬浮液的浓度为0.5-1.5％；所述干燥的的温度为50-70℃，时间为20-28小时。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(5)中，SEB适配体的序列如SEQ ID NO：1所示且5’端修饰有巯基，
5’-SH-TTTTTTTTTTGGTATTGAGGGTCGCATCCACTGGTCGTTGTTGTCTGTTGTCTGTTATGTTGTTTCGTGATGGCTCTAACTCTCCTCT-3’(SEQ ID NO：1)；
金属浴加热的温度为90-98℃，金属浴加热的时间为2-10分钟；在室温下放置的时间为0.8-1.2小时；孵育的温度为36-38℃，时间为20-28小时。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(5)中，孵育结束后，使用PBS缓冲液洗涤以除去未结合在光子晶体上的适配体。
8.由权利要求1-7中任意一项所述的制备方法制得的用于SEB超灵敏检测的光子晶体传感材料。
9.一种超灵敏检测SEB的方法，包括以下步骤：
(1)将权利要求8所述的光子晶体传感材料浸泡在PBS缓冲液中，把光纤光谱仪的探头垂直固定在光子晶体上方并浸入液面下，获得光子晶体的反射光谱图；
(2)待体系稳定后，依次加入不同浓度的SEB，使体系的SEB浓度成为0.01fg/mL～1μg/mL，分别记录稳定后的反射峰；
(3)以SEB浓度的对数为横坐标，反射峰强度的变化量为纵坐标，建立工作曲线；
(4)将待测样品加入到光子晶体传感体系中，待体系稳定后，记录反射峰的变化，根据变化量，通过工作曲线计算出SEB的含量。
10.根据权利要求9所述的超灵敏检测SEB的方法，所述待测样品为牛奶样品，该方法还包括对待测样品的预处理步骤：以6000-8000rpm离心10-30分钟以除去脂肪，用PBS缓冲液稀释400-600倍。
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