CN109752536B - 基于金纳米颗粒高效组装结构的光学探针及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于金纳米颗粒高效组装结构的光学探针及其制备方法与应用，本发明首先在有机相中利用巯基‑金属亲和作用制备了高负载的树状介孔硅球/金纳米颗粒组装体，以正辛基三甲氧基硅烷/甲醇/氨水为水解体系，实现了该疏水组装体的硅烷化修饰，并确保修饰过程中树状介孔硅球载体对金纳米颗粒的超高负载量，通过有机硅烷水解缩合、
生长过程制备了性质稳定、性能优越的微球，将微球进一步羧基化、用甲基苯丙胺抗体功能化后，应用于免疫层析试纸条中，可在15分钟内快速、特异、精准、灵敏地检测冰毒。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种基于金纳米颗粒高效组装结构的光学探针及其制备方法，以及在毒品快检中的应用。
(二)背景技术
甲基苯丙胺(MA)，俗称冰毒，是一种具有剧烈毒性的兴奋剂药物，长期过量服用会导致精神混乱、出现幻觉、体重下降、器官衰竭，血液感染细菌病毒等。由于冰毒滥用问题在近年来尤为突出，为打击毒品肆虐，快速、准确地检测甲基苯丙胺显得十分重要。现在常见的检测方法有高效液相色谱法、气-质联用法、薄层色谱法、毛细管电泳法、固相萃取法等。这些方法具有检测灵敏度高、特异性强等优点，但是这些方法也有检测流程复杂，需要昂贵设备支撑和专业人员操作等缺点，不适用于即时检测。相比之下，基于免疫层析试纸条的分析检测由于其快速、便捷、经济等特性受到关注。
传统免疫层析试纸条主要采用胶体金作为定性或半定量比色检测的探针，较低的灵敏度限制了其在需要高灵敏度和定量测定领域中的进一步应用。常见的利用柠檬酸钠还原法制备的水相金纳米颗粒由于表面修饰剂的吸附-脱附动态平衡，常存在粒径分布宽，峰宽，且极不稳定等缺陷。因此，胶体金易受基质及外界条件的干扰，显色后暴露在空气中，会从酒红色逐渐变成紫色，这种颜色的变化并不影响定性检测，但是会造成灰度值的变化，因此对胶体金的定量检测有所影响。胶体金与抗体等特异性蛋白的结合方式主要靠静电吸附作用，这种方式虽然简便易行，但是容易受到干扰，如样品pH或高离子强度都会对胶体金-蛋白复合物的结合情况造成影响。汪世华等人报道了利用基于胶体金的免疫层析试纸条检测河豚毒素，灵敏度较低，且易受血样基质及外界条件的干扰而出现漏检现象。刘国栋等人报道了通过将金纳米颗粒负载于硅纳米棒上作为免疫层析试纸条的探针来检测蛋白质，虽然灵敏度有所提高，但金纳米颗粒的负载只局限于硅纳米棒的表面，并且探针的流动性变差，检测时间变长，故还有改善的空间。
通过有机相高温热分解法合成的油相金纳米颗粒具有性能稳定、合成可控，粒径均一等优点。将金纳米颗粒与纳米载体进行组装，不仅可以极大提高免疫检测信号输出单元的信号强度，还可进行有效的相转移修饰并提高探针在水溶液中的化学及胶体稳定性。二氧化硅具有较高的光学透明度、化学惰性强、可以进行多种表面硅烷化改性，因此常被作为纳米粒子的组装模板及包覆材料。而树状介孔硅球作为负载模板，由于其超大的孔道及内表面，在提高纳米粒子负载量上有突出的优势。利用配体与金属之间的亲和作用(配位作用)将疏水纳米粒子直接固定到载体表面是一种高效的组装方法，可以避免水相组装中由静电排斥导致的颗粒包覆密度低等问题。在获得了高负载的树状介孔硅球/金纳米颗粒组装体之后，需对疏水组装体进行水溶性修饰，才能满足生物应用需求。借助烷基硅烷试剂对微球进行转相，烷基硅烷介导包硅防止了金纳米颗粒脱落，并且有利于均相二氧化硅壳层的形成，在微球表面包覆一层二氧化硅能有效改善其水溶性及稳定性并有利于生物功能化。包覆二氧化硅后的微球表面修饰羧基或氨基等活性基团可与抗体表面基团共价偶联形成复合物，由于形成的肽键等共价键需要很高的自由能才能打开，因此具有很好的稳定性和抗干扰能力。此外，向组装微球中引入其他功能材料例如荧光材料、磁性纳米粒子等来构建新型多功能材料，在多元分析、多模态成像以及医学诊断-治疗一体化研究中有着广阔的应用前景。
(三)发明内容
本发明公开了一种基于油溶性金纳米颗粒与树状介孔硅球模板的探针及其制备方法，旨在提供一种尺寸均一、金纳米颗粒负载均匀且致密、性能稳定、易于功能化的体外诊断探针。首先在有机相中利用巯基-金属亲和作用制备了高负载的树状介孔硅球/金纳米颗粒组装体；以正辛基三甲氧基硅烷/甲醇/氨水为水解体系，实现了该疏水组装体的硅烷化修饰，并确保修饰过程中树状介孔硅球载体对金纳米颗粒的超高负载量。通过有机硅烷水解缩合、
生长过程制备了性质稳定、性能优越的微球。将微球进一步羧基化、用甲基苯丙胺抗体功能化后，应用于免疫层析试纸条中，可在15分钟内快速、特异、精准、灵敏得检测冰毒。
本发明的技术方案如下：
一种基于金纳米颗粒高效组装结构的光学探针，按如下方法制备得到：
(1)金纳米颗粒的合成
氩气环境中，四氯金酸、甲苯、油胺混合后，于100～110℃搅拌反应6h，之后反应体系降至室温(20～30℃)，加入乙醇，析出沉淀，离心收集沉淀并溶于氯仿中，得到金纳米颗粒的氯仿溶液，备用；
所述甲苯的体积用量以四氯金酸的质量计为121～182mL/g；
所述油胺的体积用量以四氯金酸的质量计为12～18mL/g；
(2)巯基化树状介孔硅球模板的合成
将三乙醇胺(TEA)加入到水中，于80℃下搅拌30min，然后加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、水杨酸钠继续保温搅拌1h，接着注入正硅酸乙酯(TEOS)保温搅拌3～4h，之后降至室温，离心收集沉淀并萃取残余的有机模板，所述萃取的方法为：将所得沉淀分散在盐酸溶液(36～38％)和甲醇体积比1：1的混合溶液中，于60℃搅拌6h，离心收集固体物质重复萃取一次，得到树状介孔硅球，将所得树状介孔硅球分散在乙醇中，加入氨水(25～28wt％)、(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(MPS)，室温搅拌12h，离心收集沉淀，再分散在乙醇中，得到巯基化树状介孔硅球模板的乙醇溶液；
所述三乙醇胺、十六烷基三甲基溴化铵、水杨酸钠的质量比为1：5.6：2.5～3.2；
所述正硅酸乙酯的体积用量以三乙醇胺的质量计为55～60mL/g；
所述盐酸溶液和甲醇的混合溶液的体积用量以三乙醇胺的质量计为1.4～1.5mL/mg；
所述氨水的体积用量以三乙醇胺的质量计为35～40mL/g；
所述(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的体积用量以三乙醇胺的质量计为14～16mL/g；
(3)SAS(树状介孔硅球/金纳米颗粒/二氧化硅)微球的制备
取步骤(2)所得巯基化树状介孔硅球模板的乙醇溶液，离心去除上清液，加入步骤(1)所得金纳米颗粒的氯仿溶液，超声混匀，离心收集沉淀，得到树状介孔硅球/金纳米颗粒复合物；在所得树状介孔硅球/金纳米颗粒复合物中加入辛基三甲氧基硅烷(OTMS)，超声溶解，然后加入甲醇和氨水体积比1：0.025的混合液，超声30min，离心收集沉淀，得到硅烷化的树状介孔硅球/金纳米颗粒复合物；将所得硅烷化的树状介孔硅球/金纳米颗粒复合物分散在水中，搅拌18h，离心收集沉淀，将所得沉淀分散在乙醇、水、氨水体积比1：0.25：0.03125的混合液中，分批加入正硅酸乙酯(TEOS)，之后离心收集沉淀，再溶于乙醇中，得到SAS微球的乙醇溶液；
所述巯基化树状介孔硅球模板与金纳米颗粒的质量比为1：0.6～0.7；
所述辛基三甲氧基硅烷的体积用量以巯基化树状介孔硅球模板的质量计为33～34mL/g；
所述甲醇和氨水的混合液的体积用量以巯基化树状介孔硅球模板的质量计为1.7～1.8mL/mg；
所述乙醇、水、氨水的混合液的体积用量以巯基化树状介孔硅球模板的质量计为2.8～2.9mL/mg；
所述正硅酸乙酯的体积用量以乙醇、水、氨水的混合液的体积计为1μL/mL；
(4)羧基化SAS微球的制备
在步骤(3)所得SAS微球的乙醇溶液中加入氨水、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)反应12h，离心收集沉淀，将所得沉淀分散在丁二酸酐的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中反应4h，离心收集沉淀得到羧基化SAS微球，分散在2-吗啉乙磺酸缓冲盐水(MES)中备用；
所述氨水的体积用量以SAS微球的质量计为20～21mL/g；
所述3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积用量以SAS微球的质量计为0.8～0.9mL/g；
所述SAS微球与丁二酸酐的质量比为1：2.0～2.1；
(5)SAS免疫标记光学探针的制备
取步骤(4)准备好的分散在2-吗啉乙磺酸缓冲盐水中的羧基化SAS微球，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)，反应20min，离心收集沉淀并重新分散于2-吗啉乙磺酸缓冲盐水中，然后加入甲基苯丙胺抗体，于25℃温育搅拌2h，离心收集沉淀，得到SAS免疫标记光学探针，分散于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，于4℃下保存；
所述羧基化SAS微球与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、甲基苯丙胺抗体的质量比为1：0.2：0.5：0.02。
本发明制备的SAS免疫标记光学探针可用于冰毒免疫层析快速检测，具体的，所述应用的方法为：
首先，用含有1％牛血清白蛋白(BSA)、2.5％蔗糖、1％吐温-20、0.3％聚乙烯吡咯烷酮-K30、0.03％叠氮钠的PBS处理样品垫和结合垫，并在37℃下干燥，在硝酸纤维膜的测试线和质控线上分别喷涂BSA-MA缀合物和羊抗鼠二抗，将SAS免疫标记光学探针(0.2wt％)喷到结合垫上，然后冻干，将各部件组装好后切成3mm宽条装卡，将100μL冰毒标准溶液或尿液样品加到免疫层析试纸条的样品垫上，可在15分钟内实现可视化检测，通过读条机进行定量分析。
本发明的有益效果在于：
1、利用载体树状介孔硅球的超大孔道和高度可及的内表面，实现金纳米颗粒的超高负载量从而达到单模板内信号最大化，提高检测灵敏度。
2、利用巯基-金属亲和作用，在有机相中对金纳米颗粒直接组装，无需对金纳米颗粒进行任何表面改性及修饰，从而保证金纳米颗粒在模板上均匀致密的负载。
3、经过有机硅烷水解缩合以及
二氧化硅生长可获得水溶性及胶体稳定性优良的探针，将探针进一步功能化可应用于生物医学研究。
4、将包覆二氧化硅后的微球表面修饰羧基与抗体表面基团共价偶联形成复合物，作为探针具有很好的稳定性和抗干扰能力。
5、将探针用甲基苯丙胺抗体功能化后，应用于免疫层析试纸条中，可在15分钟内快速、特异、精准、灵敏得检测冰毒。
(四)附图说明
图1：SAS微球的制备过程示意图；
图2：透射电镜图：树状介孔硅球(a)；巯基化树状介孔硅球(b)；油溶性金纳米颗粒(c)；不同组装密度巯基化树状介孔硅球/金纳米颗粒组装体(d-f)；转相后巯基化树状介孔硅球/金纳米颗粒组装体(g)；包硅初始阶段微球(h)；包硅后微球(i)；
图3：基于SAS新型探针的免疫层析试纸条示意图；
图4：检测原始浓度为0-1500ng/mL冰毒尿液样品的免疫层析试纸条照片(检测时稀释4倍)。
(五)具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：
1、金纳米颗粒的合成：
取824μL四氯金酸储备液(1g四氯金酸溶于4mL乙醇)于50mL三颈烧瓶中，将乙醇抽干，进行脱气处理后保持瓶内始终充满氩气，然后加入25mL甲苯，2.5mL油胺，于100℃下快速搅拌反应6h。反应结束后，加入等体积乙醇，摇晃后有沉淀产生，然后离心，将得到的沉淀溶于10mL氯仿中，备用。
2、巯基化树状介孔硅球模板的合成：
首先，将68mg TEA加入到25mL水中于80℃下搅拌30分钟，然后加入380mg CTAB和168mg水杨酸钠继续搅拌1小时。在上述溶液中注入4mL TEOS，并在80℃下慢慢搅拌4小时。将产物离心并用乙醇洗涤3次，最后分散在50mL盐酸和50mL甲醇的混合溶液中，于60℃下搅拌6小时。重复萃取一次，最后将树状介孔硅球分散在200mL乙醇中。在上述树状介孔硅球乙醇溶液中加入2.5mL氨水和1mLMPS，然后在室温下剧烈搅拌12小时。通过离心收集最终产物，用乙醇洗涤3次后分散在50mL乙醇中。
3、SAS(树状介孔硅球/金纳米颗粒/二氧化硅)微球的制备：
取0.5mL上述巯基化树状介孔硅球的乙醇溶液，离心去除上清，然后加入1mL上述金纳米颗粒的氯仿溶液并超声7分钟，得到均一的溶液。通过离心收集树状介孔硅球/金纳米颗粒复合物并用氯仿洗涤一次以除去过量的金纳米颗粒。将该沉淀物在空气中稍干燥，加入150μL OTMS，超声溶解。然后将该溶液与7.5mL甲醇和187.5μL氨水的混合液混合，超声30分钟。通过离心收集复合物并用甲醇洗涤以除去过量的OTMS。将硅烷化的树状介孔硅球/金纳米颗粒复合物分散在16.5mL水中，搅拌18小时以形成有机二氧化硅层。为了通过
法生长二氧化硅壳，将上述复合物离心并分散在10mL乙醇，2.5mL水，312.5μL氨水的混合物中，每1h加入TEOS，共加入7次，正硅酸乙酯的体积用量以乙醇、水、氨水的混合液的体积计为1μL/mL。反应结束后，将产物离心并用乙醇洗涤3次，然后溶于20mL乙醇中，得到SAS的乙醇溶液。
4、羧基化SAS微球的制备：
在得到的20mL SAS乙醇溶液中加入0.5mL氨水，20μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，反应12小时。将氨基封端的SAS微球离心，用乙醇纯化后分散在10mL含有5mg/mL丁二酸酐的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中并反应4小时。用乙醇和水洗涤羧基封端的SAS微球数次，分散在2-吗啉乙磺酸缓冲盐水(MES,0.1M,pH＝6.0)中以供进一步使用。
5、SAS免疫标记光学探针的制备：
首先，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，4mg mL-1)和N-羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS，10mg mL-1)以活化MES(0.1M,pH＝6.0)中的羧基化SAS微球(2wt％)并反应20分钟。将活化的微球用水洗涤并重新分散于相同体积的MES(0.1M,pH＝6.5,0.05％吐温-20)中。然后加入最终浓度为0.4mg mL-1的甲基苯丙胺抗体，于25℃温育搅拌2小时。通过离心收集产物，并分散于磷酸盐缓冲盐水(PBS,20×10-3M,pH＝8.0,含2.5％牛血清白蛋白(BSA),1％蔗糖,2％聚乙二醇-2000和0.03％叠氮钠)中，于4℃下保存。
实施例2：
1、金纳米颗粒的合成：
取824μL四氯金酸储备液(1g四氯金酸溶于4mL乙醇)于50mL三颈烧瓶中，将乙醇抽干，进行脱气处理后保持瓶内始终充满氩气，然后加入37.5mL甲苯，3.75mL油胺，于110℃下快速搅拌反应6h。反应结束后，加入等体积乙醇，摇晃后有沉淀产生，然后离心，将得到的沉淀溶于10mL氯仿中，备用。
2、巯基化树状介孔硅球模板的合成：
首先，将68mgTEA加入到25mL水中于80℃下搅拌30分钟，然后加入380mgCTAB和168mg水杨酸钠继续搅拌1小时。在上述溶液中注入4mL TEOS，并在80℃下慢慢搅拌4小时，将产物离心并用乙醇洗涤3次。重复上述实验，并将最终产物混合，最后分散在100mL盐酸和100mL甲醇的混合溶液中，于60℃下搅拌6小时。重复萃取一次，最后将树状介孔硅球分散在400mL乙醇中。在上述树状介孔硅球乙醇溶液中加入5mL氨水和2mLMPS，然后在室温下剧烈搅拌12小时。通过离心收集最终产物，用乙醇洗涤3次后分散在100mL乙醇中。
3、SAS(树状介孔硅球/金纳米颗粒/二氧化硅)微球的制备：
取1mL上述巯基化树状介孔硅球的乙醇溶液，离心去除上清，然后加入2mL上述金纳米颗粒的氯仿溶液并超声7分钟，得到均一的溶液。通过离心收集树状介孔硅球/金纳米颗粒复合物并用氯仿洗涤一次以除去过量的金纳米颗粒。将该沉淀物在空气中稍干燥，加入300μLOTMS，超声溶解。然后将该溶液与15mL甲醇和375μL氨水的混合液混合，超声30分钟。通过离心收集复合物并用甲醇洗涤以除去过量的OTMS。将硅烷化的树状介孔硅球/金纳米颗粒复合物分散在33mL水中，搅拌18小时以形成有机二氧化硅层。为了通过
法生长二氧化硅壳，将上述复合物离心并分散在20mL乙醇，5mL水，625μL氨水的混合物中，每1h加入TEOS，共加入7次，正硅酸乙酯的体积用量以乙醇、水、氨水的混合液的体积计为1μL/mL。反应结束后，将产物离心并用乙醇洗涤3次，然后溶于40mL乙醇中，得到SAS的乙醇溶液。
4、羧基化SAS微球的制备：
在得到的40mL SAS乙醇溶液中加入1mL氨水，40μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，反应12小时。将氨基封端的SAS微球离心，用乙醇纯化后分散在20mL含有5mg/mL丁二酸酐的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中并反应4小时。用乙醇和水洗涤羧基封端的SAS微球数次，分散在2-吗啉乙磺酸缓冲盐水(MES,0.1M,pH＝6.0)中以供进一步使用。
5、SAS免疫标记光学探针的制备：
首先，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，4mg mL-1)和N-羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS，10mg mL-1)以活化MES(0.1M,pH＝6.0)中的羧基化SAS微球(2wt％)并反应20分钟。将活化的微球用水洗涤并重新分散于相同体积的MES(0.1M,pH＝6.5,0.05％吐温-20)中。然后加入最终浓度为0.4mg mL-1的甲基苯丙胺抗体，于25℃温育搅拌2小时。通过离心收集产物，并分散于磷酸盐缓冲盐水(PBS,20×10-3M,pH＝8.0,含2.5％牛血清白蛋白(BSA),1％蔗糖,2％聚乙二醇-2000和0.03％叠氮钠)中，于4℃下保存。
实施例3：
1、金纳米颗粒的合成：
取824μL四氯金酸储备液(1g四氯金酸溶于4mL乙醇)于50mL三颈烧瓶中，将乙醇抽干，进行脱气处理后保持瓶内始终充满氩气，然后加入25mL甲苯，2.5mL油胺，于110℃下快速搅拌反应6h。反应结束后，加入等体积乙醇，摇晃后有沉淀产生，然后离心，将得到的沉淀溶于10mL氯仿中，备用。
2、巯基化树状介孔硅球模板的合成：
首先，将68mg TEA加入到25mL水中于80℃下搅拌30分钟，然后加入380mg CTAB和218mg水杨酸钠继续搅拌1小时。在上述溶液中注入4mL TEOS，并在80℃下慢慢搅拌3小时。将产物离心并用乙醇洗涤3次，最后分散在50mL盐酸和50mL甲醇的混合溶液中，于60℃下搅拌6小时。重复萃取一次，最后将树状介孔硅球分散在200mL乙醇中。在上述树状介孔硅球乙醇溶液中加入2.5mL氨水和1mLMPS，然后在室温下剧烈搅拌12小时。通过离心收集最终产物，用乙醇洗涤3次后分散在25mL乙醇中。
3、SAS(树状介孔硅球/金纳米颗粒/二氧化硅)微球的制备：
取0.625mL上述巯基化树状介孔硅球的乙醇溶液，离心去除上清，然后加入1.25mL上述金纳米颗粒的氯仿溶液并超声8分钟，得到均一的溶液。通过离心收集树状介孔硅球/金纳米颗粒复合物并用氯仿洗涤一次以除去过量的金纳米颗粒。将该沉淀物在空气中稍干燥，加入187.5μL OTMS，超声溶解。然后将该溶液与9.5mL甲醇和234.5μL氨水的混合液混合，超声30分钟。通过离心收集复合物并用甲醇洗涤以除去过量的OTMS。将硅烷化的树状介孔硅球/金纳米颗粒复合物分散在20.5mL水中，搅拌18小时以形成有机二氧化硅层。为了通过
法生长二氧化硅壳，将上述复合物离心并分散在12.5mL乙醇，3.125mL水，390.5μL氨水的混合物中，每1h加入TEOS，共加入9次，正硅酸乙酯的体积用量以乙醇、水、氨水的混合液的体积计为1μL/mL。反应结束后，将产物离心并用乙醇洗涤3次，然后溶于20mL乙醇中，得到SAS的乙醇溶液。
4、羧基化SAS微球的制备：
在得到的20mL SAS乙醇溶液中加入0.5mL氨水，20μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，反应12小时。将氨基封端的SAS微球离心，用乙醇纯化后分散在10mL含有5mg/mL丁二酸酐的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中并反应4小时。用乙醇和水洗涤羧基封端的SAS微球数次，分散在2-吗啉乙磺酸缓冲盐水(MES,0.1M,pH＝6.0)中以供进一步使用。
5、SAS免疫标记光学探针的制备：
首先，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，4mg mL-1)和N-羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS，10mg mL-1)以活化MES(0.1M,pH＝6.0)中的羧基化SAS微球(2wt％)并反应20分钟。将活化的微球用水洗涤并重新分散于相同体积的MES(0.1M,pH＝6.5,0.05％吐温-20)中。然后加入最终浓度为0.4mg mL-1的甲基苯丙胺抗体，于25℃温育搅拌2小时。通过离心收集产物，并分散于磷酸盐缓冲盐水(PBS,20×10-3M,pH＝8.0,含2.5％牛血清白蛋白(BSA),1％蔗糖,2％聚乙二醇-2000和0.03％叠氮钠)中，于4℃下保存。
实施例4：
基于SAS免疫标记光学探针的冰毒免疫层析快速检测
首先，用含有1％BSA，2.5％蔗糖，1％吐温-20，0.3％聚乙烯吡咯烷酮-K30，0.03％叠氮钠的PBS(20×10-3M,pH＝7.4)处理样品垫和结合垫，并在37℃下干燥。在硝酸纤维膜的测试线和质控线上分别喷涂BSA-MA缀合物和羊抗鼠二抗。将SAS免疫标记光学探针(0.2wt％)喷到结合垫上，然后冻干。按一定顺序将各部件组装好后切成3mm宽条装卡。将100μL冰毒标准溶液或尿液样品加到免疫层析试纸条的样品垫上，可在15分钟内实现可视化检测，通过读条机进行定量分析。每个样品检测3次。
对比例：
现有技术：金纳米颗粒负载的硅纳米棒应用于试纸条中检测蛋白质(参考文献：Hui Xu,Jiao Chen,Joseph Birrenkott,Julia Xiaojun Zhao,Sunitha Takalkar,KwakuBaryeh,and Guodong Liu.Gold-Nanoparticle-Decorated Silica Nanorods forSensitive Visual Detection of Proteins.Anal.Chem.2014,86,7351-7359.)
制备过程：二氧化硅纳米棒(SiNRs)的制备：将3.00g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)加入到30.00mL1-戊醇中，超声30min，得到PVP/1-戊醇溶液。将3.00mL95％乙醇，0.84mL水和0.20mL0.17M柠檬酸钠加入到上述溶液中，用手摇动几秒钟。然后，加入0.30mL TEOS和0.50mL氨水，在室温下进行过夜反应。最后以11000rpm离心30分钟收集SiNRs并除去上清液，将收集的SiNRs用乙醇洗涤3次，并于100℃的烘箱中干燥；金种子的制备：在冰浴中将4.00mL1％四氯金酸溶液加入到100.00mL水中，然后加入0.50mL0.20M碳酸钾将Au(III)还原为Au(I)。接着将溶液搅拌10分钟直至其颜色从黄色变为浅黄色或无色。然后，缓慢加入1.00mL硼氢化钠(0.50mg/mL)，溶液变成红色；金纳米颗粒负载的二氧化硅纳米棒(GNP-SiNRs)的制备：将1.00mL 10.00mg/mL的SiNR溶液加入到40.00mL金种子溶液中，并将混合物剧烈搅拌20分钟。通过离心15分钟除去过量的金种子，得到的沉淀重新分散在10.00mL水中，待用。将4.00mL1％四氯金酸溶液和0.025g碳酸钾加入到90.00mL水中，搅拌混合物直至其变为淡黄色或无色得到生长液。然后，将10.00mL负载金种子的SiNR溶液，1.00mL0.5M盐酸羟胺和1.00gPVP依次加入到上述溶液中。在过夜反应后，将溶液6500rpm离心15分钟并用水洗涤3次。最后，将获得的GNP-SiNRs进行功能化后作为探针应用于试纸条中检测蛋白质。
该方法通过将金纳米颗粒负载于硅纳米棒上作为免疫层析试纸条的探针来检测蛋白质，虽然灵敏度有所提高，但金纳米颗粒的负载只局限于硅纳米棒的表面，并且因棒状结构导致探针的流动性变差，检测时间变长，故还有改善的空间。相比之下，本发明利用树状介孔硅球为模板制备了尺寸均一、金纳米颗粒负载均匀且致密、性能稳定、易于功能化的探针，将检测信号显著放大的同时保持了良好的流动性，可在较短时间内进行检测。
Claims (4)
1.一种基于金纳米颗粒高效组装结构的光学探针，其特征在于，按如下方法制备得到：
(1)金纳米颗粒的合成
氩气环境中，四氯金酸、甲苯、油胺混合后，于100～110℃搅拌反应6h，之后反应体系降至室温，加入乙醇，析出沉淀，离心收集沉淀并溶于氯仿中，得到金纳米颗粒的氯仿溶液，备用；
所述甲苯的体积用量以四氯金酸的质量计为121～182mL/g；
所述油胺的体积用量以四氯金酸的质量计为12～18mL/g；
(2)巯基化树状介孔硅球模板的合成
将三乙醇胺加入到水中，于80℃下搅拌30min，然后加入十六烷基三甲基溴化铵、水杨酸钠继续保温搅拌1h，接着注入正硅酸乙酯保温搅拌3～4h，之后降至室温，离心收集沉淀并萃取残余的有机模板，得到树状介孔硅球，将所得树状介孔硅球分散在乙醇中，加入氨水、(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷，室温搅拌12h，离心收集沉淀，再分散在乙醇中，得到巯基化树状介孔硅球模板的乙醇溶液；
所述三乙醇胺、十六烷基三甲基溴化铵、水杨酸钠的质量比为1：5.6：2.5～3.2；
所述正硅酸乙酯的体积用量以三乙醇胺的质量计为55～60mL/g；
所述氨水的体积用量以三乙醇胺的质量计为35～40mL/g；
所述(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的体积用量以三乙醇胺的质量计为14～16mL/g；
(3)树状介孔硅球/金纳米颗粒/二氧化硅微球的制备
取步骤(2)所得巯基化树状介孔硅球模板的乙醇溶液，离心去除上清液，加入步骤(1)所得金纳米颗粒的氯仿溶液，超声混匀，离心收集沉淀，得到树状介孔硅球/金纳米颗粒复合物；在所得树状介孔硅球/金纳米颗粒复合物中加入辛基三甲氧基硅烷，超声溶解，然后加入甲醇和氨水体积比1：0.025的混合液，超声30min，离心收集沉淀，得到硅烷化的树状介孔硅球/金纳米颗粒复合物；将所得硅烷化的树状介孔硅球/金纳米颗粒复合物分散在水中，搅拌18h，离心收集沉淀，将所得沉淀分散在乙醇、水、氨水体积比1：0.25：0.03125的混合液中，分批加入正硅酸乙酯，之后离心收集沉淀，再溶于乙醇中，得到树状介孔硅球/金纳米颗粒/二氧化硅微球的乙醇溶液；
所述巯基化树状介孔硅球模板与金纳米颗粒的质量比为1：0.6～0.7；
所述辛基三甲氧基硅烷的体积用量以巯基化树状介孔硅球模板的质量计为33～34mL/g；
所述甲醇和氨水的混合液的体积用量以巯基化树状介孔硅球模板的质量计为1.7～1.8mL/mg；
所述乙醇、水、氨水的混合液的体积用量以巯基化树状介孔硅球模板的质量计为2.8～2.9mL/mg；
所述正硅酸乙酯的体积用量以乙醇、水、氨水的混合液的体积计为1μL/mL；
(4)羧基化树状介孔硅球/金纳米颗粒/二氧化硅微球的制备
在步骤(3)所得树状介孔硅球/金纳米颗粒/二氧化硅微球的乙醇溶液中加入氨水、3-氨丙基三乙氧基硅烷反应12h，离心收集沉淀，将所得沉淀分散在丁二酸酐的N,N-二甲基甲酰胺溶液中反应4h，离心收集沉淀得到羧基化树状介孔硅球/金纳米颗粒/二氧化硅微球，分散在2-吗啉乙磺酸缓冲盐水中备用；
所述氨水的体积用量以树状介孔硅球/金纳米颗粒/二氧化硅微球的质量计为20～21mL/g；
所述3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积用量以树状介孔硅球/金纳米颗粒/二氧化硅微球的质量计为0.8～0.9mL/g；
所述树状介孔硅球/金纳米颗粒/二氧化硅微球与丁二酸酐的质量比为1：2.0～2.1；
(5)树状介孔硅球/金纳米颗粒/二氧化硅免疫标记光学探针的制备
取步骤(4)准备好的分散在2-吗啉乙磺酸缓冲盐水中的羧基化树状介孔硅球/金纳米颗粒/二氧化硅微球，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺，反应20min，离心收集沉淀并重新分散于2-吗啉乙磺酸缓冲盐水中，然后加入甲基苯丙胺抗体，于25℃温育搅拌2h，离心收集沉淀，得到树状介孔硅球/金纳米颗粒/二氧化硅免疫标记光学探针，分散于磷酸盐缓冲盐水中，于4℃下保存；
所述羧基化树状介孔硅球/金纳米颗粒/二氧化硅微球与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、甲基苯丙胺抗体的质量比为1：0.2：0.5：0.02。
2.如权利要求1所述的基于金纳米颗粒高效组装结构的光学探针，其特征在于，步骤(2)中，所述萃取残余的有机模板的方法为：将所得沉淀分散在36～38％盐酸溶液和甲醇体积比1：1的混合溶液中，于60℃搅拌6h，离心收集固体物质重复萃取一次。
3.如权利要求1所述的基于金纳米颗粒高效组装结构的光学探针在甲基苯丙胺免疫层析快速检测中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：
首先，用含有1％牛血清白蛋白、2.5％蔗糖、1％吐温-20、0.3％聚乙烯吡咯烷酮-K30、0.03％叠氮钠的PBS处理样品垫和结合垫，并在37℃下干燥，在硝酸纤维膜的测试线和质控线上分别喷涂BSA-MA缀合物和羊抗鼠二抗，将树状介孔硅球/金纳米颗粒/二氧化硅免疫标记光学探针喷到结合垫上，然后冻干，将各部件组装好后切成3mm宽条装卡，将100μL甲基苯丙胺标准溶液或尿液样品加到免疫层析试纸条的样品垫上，可在15分钟内实现可视化检测，通过读条机进行定量分析。
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