CN115837255A - 一种胶体金-二氧化硅复合微球的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胶体金‑二氧化硅复合微球，包括表面官能化的胶体金纳米微球与表面官能化的二氧化硅微球之间的表面官能团共价偶联组装成复合微球，其中所述表面官能化的胶体金纳米微球位于所述表面官能化的二氧化硅微球的表面。本发明还公开了胶体金‑二氧化硅复合微球的制备方法：以小粒径的纳米金颗粒为种子金，滴加氯金酸和含巯基的羧酸还原剂，通过逐步生长的方法制备表面带羧基的胶体金颗粒，即羧基胶体金颗粒；二氧化硅微球在碱性条件下使用带有氨基的硅烷偶联剂进行修饰得到表面带有氨基的二氧化硅微球；将羧基胶体金颗粒经偶联剂活化后，与带有氨基的二氧化硅微球进行偶联，离心分离，复溶，得到纳米胶体金‑二氧化硅复合微球。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种胶体金-二氧化硅复合微球的制备方法。
背景技术
纳米复合微球的种类繁多，可用在不同的领域中。在IVD中，侧向层析技术已经发展多年，而以胶体金为代表的检测仍存在一些问题，如金标复合物在层析涌动过程中稳定性比较差，会产生分离，引起假阳或信号显色浅的问题。而在侧向层析方向，可用胶体金-二氧化硅复合微球作为载体材料，增大微球的粒径，提高检测灵敏度。
纳米二氧化硅微球为无定型白色粉末，无毒无味无污染，具有粒径小、纯度高、比表面积大、分散性能好等特点，并凭借其优越的稳定性及生物惰性、补强性、触变性和光学及机械性能，广泛应用于吸附、标记、示踪、检测、体内成像、免疫医学、高通量药物筛选等领域。
在IVD领域，胶体金检测具有方便快捷、不需要特殊设备和试剂，且结果判断直观等特点，因而适合于广大基层检验人员，具有巨大的发展潜力和广阔的应用前景。然而，在以胶体金为载体的侧向层析检测中，定量以及灵敏度低的问题一直困扰着各大体外诊断试剂盒研发厂家。目前，既能实现定性简单易判读又能辅助提升灵敏度，同时实现定量的固相载体材料市场上是没有的。
发明内容
本发明的目的是提供一种胶体金-二氧化硅复合微球，作为侧向层析固相载体，既保留了胶体金显色特性，能够使结果判断直观的特点，同时又解决了金标复合物在层析涌动过程中稳定性比较差，会产生分离，引起假阳或信号显色浅等问题。
具体地，胶体金-二氧化硅复合微球，包括表面官能化的胶体金纳米微球与表面官能化的二氧化硅微球，胶体金纳米微球与二氧化硅微球之间的表面官能团共价偶联组装成复合微球，其中胶体金纳米微球位于二氧化硅微球的表面。复合微球为纳米微球与二氧化硅微球的共价偶联物，其结构是二氧化硅母球上偶联胶体金子球，即胶体金纳米微球偶联在二氧化硅微球表面，保留胶体金纳米微球的显色特征；同时因胶体金球与二氧化硅微球表面均具有官能团，在复合微球表面分布有修饰基团，可以与生物活材偶联反应，可以用于IVD领域中，作为侧向层析的固相载体材料。胶体金-二氧化硅复合微球粒径增大且颜色无明显变化，提高检测灵敏度；胶体金表面的官能团与抗体或蛋白偶联，从而增加金标结合物的稳定性。
胶体金纳米微球表面官能团为羧基和巯基等。在一个实施例中，采用含巯基的羧酸还原剂对胶体金纳米微球进行表面修饰。所述含巯基的羧酸还原剂包括巯基丁二酸、巯基丙酸或巯基乙酸。
二氧化硅微球表面官能为氨基。在一个实施例中，采用带氨基的硅烷偶联剂对二氧化硅微球进行表面修饰。所述带氨基的硅烷偶联剂包括3-氨基丙基三甲氧基硅烷、N-氨乙基-γ-氨丙基三乙氧基硅烷、3-氨基丙基二甲基乙氧基硅烷或氨基丙基三乙氧基硅烷。
本发明的另一个目的是提供一种胶体金-二氧化硅复合微球的制备方法，通过Au-S配位键得到表面含有羧基的金纳米颗粒，通过偶联剂活化表面羧基进一步与表面带有氨基的二氧化硅球偶联，得到胶体金-二氧化硅复合微球。
具体地，胶体金-二氧化硅复合微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)胶体金表面修饰：以小粒径的纳米金颗粒为种子金，滴加氯金酸和含巯基的羧酸还原剂，通过逐步生长的方法制备表面带羧基的胶体金颗粒，即羧基胶体金颗粒；
(2)二氧化硅微球表面修饰：二氧化硅微球在碱性条件下使用带有氨基的硅烷偶联剂进行修饰得到表面带有氨基的二氧化硅微球；
(3)胶体金-二氧化硅复合微球制备：将羧基胶体金颗粒经偶联剂活化后，与带有氨基的二氧化硅微球进行偶联，离心分离，复溶，得到纳米胶体金-二氧化硅复合微球。
所述步骤(1)中，所述含巯基的羧酸还原剂采用巯基丁二酸、巯基丙酸和巯基乙酸。
所述步骤(1)中，所述小粒径的纳米胶体金粒径为10～20nm。
所述步骤(1)中，大粒径的胶体金颗粒的粒径在40～60nm之间。优选地，所述大粒径的胶体金颗粒的粒径为40nm。
所述步骤(1)中，小粒径的纳米金颗粒采用柠檬酸钠还原法制备。具体地，所述小粒径的纳米胶体金粒径为10～20nm，其采用传统的柠檬酸钠还原法方法制备而成：加热0.01％(w/v)氯金酸溶液至沸腾，在搅拌下快速加入还原剂柠檬酸三钠溶液，待溶液颜色变为大红直至不再发生变化，继续加热沸腾5～20分钟后，冷却至室温备用。
所述步骤(2)中，所述使用带有氨基的硅烷偶联剂采用3-氨基丙基三甲氧基硅烷，N-氨乙基-γ-氨丙基三乙氧基硅烷，3-氨基丙基二甲基乙氧基硅烷或氨基丙基三乙氧基硅烷中任意一种。
所述步骤(2)中，二氧化硅微球的粒径在100～300nm之间。
所述步骤(3)中，偶联剂为EDC[1-乙基-3-(3-二甲基氨丙烷)碳二亚胺]和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的混合液。
其中，EDC的浓度为1.0×10-4mol/L～2.0×10-4mol/L，NHS的浓度2.0×10-4mol/L～4.0×10-4mol/L。
优选地，EDC的用量为100μL 1.0×10-4mol/L，NHS的用量为100μL2.0×10-4mol/L。
有益效果：
1.本发明提供的胶体金-二氧化硅复合微球的制备方法，同时通过与传统方法制备的胶体金颗粒做对比，胶体金-二氧化硅复合微球明显提高了金标复合物在复杂介质中的稳定性，对目标蛋白的选择性识别显著增强，从而相对提高了金标试纸条的灵敏度。
附图说明
图1是本发明的实施例一至三中，胶体金-二氧化硅复合微球的制备过程示意图。
图2是本发明的实施例一至三中，胶体金-二氧化硅复合微球与抗体或蛋白偶联过程示意图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例一
1.用二次去离子纯化水将1％(w/v)氯金酸稀释成100mL 0.01％的溶液，加热氯金酸至沸腾，快速加入4.0mL 1％(w/v)柠檬酸三钠溶液，待溶液颜色变为大红直至不再变化后，继续加热沸腾5分钟，冷却至室温加纯化水定容到100mL，即得到小粒径的胶体金颗粒。
2.取30mL小粒径胶体金用去离子纯化水稀释至100mL于三口烧瓶中，通过一个加料管滴加2.0mL1％(w/v)氯金酸，控制滴加速度0.8mL/min；另一个加料管滴加2.0mL的巯基丁二酸，控制滴加速度0.5mL/min,待颜色稳定后，通过紫外可见分光光度计扫描粒径分布和大小，得到50nm左右的胶体金颗粒，即大粒径的胶体金颗粒。
3.取适量市面上购买的1mg/ml二氧化硅微球浊液30ml，加入0.6vol.％的3-氨基丙基三甲氧基硅烷，充分搅拌使其混匀；控制温度95℃加热回流12h，加热过程中持续通入氮气进行保护。回收样品，使用无水乙醇离心洗涤，并分散在30ml无水乙醇中储存，得到表面修饰氨基的二氧化硅微球。
4.取5ml表面带羧基的大粒径纳米金胶体金溶液与5ml表面修饰氨基的二氧化硅微球进行混匀后，加入100μL 1.0×10-4mol/L的EDC和100μL 2.0×10-4mol/L的NHS混合液，37℃条件下摇床上混匀反应4小时，将反应产物离心，用去离子纯化水重悬洗涤2次，最后使用10ml纯化水复溶得到一种胶体金-二氧化硅复合微球。
5.取5.0mL 50nm胶体金-二氧化硅复合微球溶液，加入已确定量的最佳待标记抗体蛋白，摇匀，并加入5％的BSA，封闭非特异性结合，4℃下5000rpm离心，吸掉上清液，将沉淀重悬于含有1％BSA和0.05％NaN3的pH7.4的PBS缓冲溶液，得到共价结合的复合微球抗体蛋白复合物。
6.将共价结合的复合微球抗体蛋白复合物涂匀在玻璃纤维纸上，12小时过夜烘干后，裁成合适长度大小组装成试剂条。
实施例二
1.用二次去离子纯化水将1％(w/v)氯金酸稀释成100mL 0.01％的溶液，加热氯金酸至沸腾，快速加入4.0mL 1％(w/v)柠檬酸三钠溶液，待溶液颜色变为大红直至不再变化后，继续加热沸腾5分钟，冷却至室温加纯化水定容到100mL，即得到小粒径的胶体金颗粒。
2.取30mL小粒径胶体金用去离子纯化水稀释至100mL于三口烧瓶中，通过一个加料管滴加2.0mL1％(w/v)氯金酸，控制滴加速度0.8mL/min；另一个加料管滴加2.0mL的巯基丙酸，控制滴加速度0.5mL/min,待颜色稳定后，通过紫外可见分光光度计扫描粒径分布和大小，得到50nm左右的胶体金颗粒，即大粒径的胶体金颗粒。
3.取适量市面上购买的1mg/ml二氧化硅微球浊液30ml，加入0.6vol.％的N-氨乙基-γ-氨丙基三乙氧基硅烷，充分搅拌使其混匀；控制温度95℃加热回流12h，加热过程中持续通入氮气进行保护。回收样品，使用无水乙醇离心洗涤，并分散在30ml无水乙醇中储存，得到表面修饰氨基的二氧化硅微球。
4.取5ml表面带羧基的大粒径纳米金胶体金溶液与5ml表面修饰氨基的二氧化硅微球进行混匀后，加入100μL 1.0×10-4mol/L的EDC和100μL 2.0×10-4mol/L的NHS混合液，37℃条件下摇床上混匀反应4小时，将反应产物离心，用去离子纯化水重悬洗涤2次，最后使用10ml纯化水复溶得到一种胶体金-二氧化硅复合微球。
5.取5.0mL50nm胶体金-二氧化硅复合微球溶液，加入已确定量的最佳待标记抗体蛋白，摇匀，并加入5％的BSA，封闭非特异性结合，4℃下5000rpm离心，吸掉上清液，将沉淀重悬于含有1％BSA和0.05％NaN3的pH7.4的PBS缓冲溶液，得到共价结合的复合微球抗体蛋白复合物。
6.将共价结合的复合微球抗体蛋白复合物涂匀在玻璃纤维纸上，12小时过夜烘干后，裁成合适长度大小组装成试剂条。
实施例三
1.用二次去离子纯化水将1％(w/v)氯金酸稀释成100mL 0.01％的溶液，加热氯金酸至沸腾，快速加入4.0mL 1％(w/v)柠檬酸三钠溶液，待溶液颜色变为大红直至不再变化后，继续加热沸腾5分钟，冷却至室温加纯化水定容到100mL，即得到小粒径的胶体金颗粒。
2.取30mL小粒径胶体金用去离子纯化水稀释至100mL于三口烧瓶中，通过一个加料管滴加2.0mL1％(w/v)氯金酸，控制滴加速度0.8mL/min；另一个加料管滴加2.0mL的巯基乙酸，控制滴加速度0.5mL/min，待颜色稳定后，通过紫外可见分光光度计扫描粒径分布和大小，得到50nm左右的胶体金颗粒，即大粒径的胶体金颗粒。
3.取适量市面上购买的1mg/ml二氧化硅微球浊液30ml，加入0.6vol.％的3-氨基丙基二甲基乙氧基硅烷，充分搅拌使其混匀；控制温度95℃加热回流12h，加热过程中持续通入氮气进行保护；回收样品，使用无水乙醇离心洗涤，并分散在30ml无水乙醇中储存，得到表面修饰氨基的二氧化硅微球。
4.取5ml表面带羧基的大粒径纳米金胶体金溶液与5ml表面修饰氨基的二氧化硅微球进行混匀后，加入100μL 1.0×10-4mol/L的EDC和100μL 2.0×10-4mol/L的NHS混合液，37℃条件下摇床上混匀反应4小时，将反应产物离心，用去离子纯化水重悬洗涤2次，最后使用10ml纯化水复溶得到一种胶体金-二氧化硅复合微球。
5.取5.0mL50nm胶体金-二氧化硅复合微球溶液，加入已确定量的最佳待标记抗体蛋白，摇匀，并加入5％的BSA，封闭非特异性结合，4℃下5000rpm离心，吸掉上清液，将沉淀重悬于含有1％BSA和0.05％NaN3的pH7.4的PBS缓冲溶液，得到共价结合的复合微球抗体蛋白复合物。
6.将共价结合的复合微球抗体蛋白复合物涂匀在玻璃纤维纸上，12小时过夜烘干后，裁成合适长度大小组装成试剂条。
对比例传统的纳米金颗粒通过以下技术方案实现：
1、用二次去离子纯化水将1％(w/v)氯金酸稀释成100mL 0.01％的溶液，加热氯金酸至沸腾,快速加入4.0mL 1％(w/v)柠檬酸三钠溶液，待溶液颜色变为大红直至不再变化后，继续加热沸腾5分钟，冷却至室温加纯化水定容到100mL，即得到小粒径的胶体金颗粒；
2、取30mL小粒径胶体金用去离子纯化水稀释至100mL于三口烧瓶中，通过一个加料管滴加2.0mL 1％(w/v)氯金酸，控制滴加速度0.8mL/min；另一个加料管滴加2.0mL的巯基丁二酸，控制滴加速度0.5mL/min,待颜色稳定后，通过紫外可见分光光度计扫描粒径分布和大小，得到50nm左右的胶体金颗粒，即大粒径的胶体金颗粒；
实验例：胶体金试纸条的组装
将样品垫、共价结合的复合微球抗体蛋白复合物涂匀的玻璃纤维纸、包被硝酸纤维素NC膜及吸水纸依次搭接粘贴成试纸带，用切割机将试纸带切割成合适宽度的试纸条，即可用于临床样本的快速检测。
将三种不同标记方法金标试纸条用HCG参考品检测，进行灵敏度和稳定性对比，对比数据如下：
表1灵敏度的比较：
表2稳定性的比较
备注：“－”阴性；“+”阳性，越多“+”表示显色程度越深，阳性越强；“±”弱阳性，肉眼隐约可见。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术用户员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.胶体金-二氧化硅复合微球，其特征是，包括表面官能化的胶体金纳米微球与表面官能化的二氧化硅微球，所述表面官能化的胶体金纳米微球与表面官能化的二氧化硅微球之间的表面官能团共价偶联组装成复合微球，其中所述表面官能化的胶体金纳米微球位于所述表面官能化的二氧化硅微球的表面。
2.根据权利要求1所述的胶体金-二氧化硅复合微球，其特征是，所述胶体金纳米微球表面官能团为羧基和巯基。
3.根据权利要求2所述的胶体金-二氧化硅复合微球，其特征是，采用含巯基的羧酸还原剂对胶体金纳米微球进行表面修饰；所述含巯基的羧酸还原剂包括巯基丁二酸、巯基丙酸或巯基乙酸。
4.根据权利要求1所述的胶体金-二氧化硅复合微球，其特征是，二氧化硅微球表面官能为氨基。
5.根据权利要求1所述的胶体金-二氧化硅复合微球，其特征是，采用带氨基的硅烷偶联剂对二氧化硅微球进行表面修饰；所述带氨基的硅烷偶联剂包括3-氨基丙基三甲氧基硅烷、N-氨乙基-γ-氨丙基三乙氧基硅烷、3-氨基丙基二甲基乙氧基硅烷或氨基丙基三乙氧基硅烷。
6.一种胶体金-二氧化硅复合微球的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)胶体金表面修饰：以小粒径的纳米金颗粒为种子金，滴加氯金酸和含巯基的羧酸还原剂，通过逐步生长的方法制备表面带羧基的胶体金颗粒，即羧基胶体金颗粒；
(2)二氧化硅微球表面修饰：二氧化硅微球在碱性条件下使用带有氨基的硅烷偶联剂进行修饰得到表面带有氨基的二氧化硅微球；
(3)胶体金-二氧化硅复合微球制备：将羧基胶体金颗粒经偶联剂活化后，与带有氨基的二氧化硅微球进行偶联，离心分离，复溶，得到纳米胶体金-二氧化硅复合微球。
7.根据权利要求1所述的胶体金-二氧化硅复合微球的制备方法，其特征是，所述步骤(1)中，所述含巯基的羧酸还原剂采用巯基丁二酸、巯基丙酸和巯基乙酸；所述小粒径的纳米胶体金粒径为10～20nm所述大粒径的胶体金颗粒的粒径在40～60nm之间。
8.根据权利要求1所述的胶体金-二氧化硅复合微球的制备方法，其特征是，所述步骤(2)中，所述使用带有氨基的硅烷偶联剂采用3-氨基丙基三甲氧基硅烷，N-氨乙基-γ-氨丙基三乙氧基硅烷，3-氨基丙基二甲基乙氧基硅烷或氨基丙基三乙氧基硅烷；所述二氧化硅微球的粒径在100～300nm之间。
9.根据权利要求1所述的胶体金-二氧化硅复合微球的制备方法，其特征是，所述步骤(3)中，偶联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙烷)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合液。
10.根据权利要求9所述的胶体金-二氧化硅复合微球的制备方法，其特征是，所述的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙烷)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合液中，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙烷)碳二亚胺的浓度为1.0×10-4mol/L～2.0×10-4mol/L，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度2.0×10-4mol/L～4.0×10-4mol/L。
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| CN116643049B (zh) * | 2023-07-27 | 2023-09-29 | 云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所 | 基于改性纳米金材料的丙溴磷农药胶体金标记物及其应用 |
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