CN115595146A - 一种比色荧光双信号纳米微球及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种比色荧光双信号纳米微球及其制备方法与应用。本发明比色荧光双信号纳米微球包括内核和由内至外依次包裹在内核外的第一正电夹层、第一壳层、第二正电夹层和第二壳层；所述内核为SiO2纳米颗粒；所述第一壳层为金纳米粒子和羧基化量子点的复合层；所述第二壳层为羧基化量子点层。本发明比色荧光双信号纳米微球具有分散性好、粒径大小可调、比色及荧光性能强且易于批量制备等优点，量子点外壳表面的羧基位点易于抗体修饰，可用于新型冠状病毒的定性及高灵敏现场快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及新型纳米材料制备及病原微生物快速检测领域，具体涉及一种比色荧光双信号纳米微球及其制备方法与在新型冠状病毒检测中的应用。
背景技术
新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)是一种具有高度传染性，潜伏期长，发病率高且易在人与人之间传播的病毒。及时准确的诊断新型冠状病毒是限制其进一步传播、控制疫情的有效手段。目前，基于核酸的检测方法，包括实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和测序，是临床诊新型冠状病毒感染的首选。尽管RT-PCR和基因测序具有良好的准确性，但它们需要较长的检测时间(>2小时)、避免污染的特殊房间、昂贵的设备和训练有素的操作人员，阻碍了其在现场检测(POCT)中的应用。
免疫层析作为一种POCT检测工具，具有成本低廉、操作简单、检测快速等优点。其中，胶体金免疫层析应用最为广泛。胶体金作为免疫层析标签具有成本低廉、信号读取简单、易于批量制备等优点。但是胶体金诊断法也存在一些缺点，包括检测灵敏度低、稳定性差等缺点，且一般只能用于定性检测。近年来，基于量子点的荧光免疫层析也被用于生物检测领域。但是，由于量子点本身粒径小（5-20 nm），易团聚，回收困难，限制了量子点在免疫层析快速检测领域的应用。有研究表明，将量子点单体嵌入载体（如上转换颗粒，磁珠，二氧化硅）中而制备的粒径较大的量子点微球，已被用作免疫层析系统中的荧光标签。与单纯的量子点颗粒相比，量子点微球具有更强的荧光性能及更好的分散性，从而进一步提高了免疫层析的检测灵敏度和稳定性。
SiO2纳米粒子制备简单、分散性良好、粒径大小可控且具有良好的生物相容性，可通过离心分离回收，适用于免疫层析标签载体。目前，只有硅球量子点的核壳结构，尚无可调节的双信号硅核量子点的纳米材料。
发明内容
针对传统胶体金免疫层析灵敏度低，只能定性检测等缺点，本发明提出了一种比色-荧光双模式免疫层析，既可用于检测靶标的现场定性筛查，又适用于目标物的定量检测。本发明的目的是提供一种比色荧光双信号纳米微球及其制备方法与应用，通过将量子点和不同粒径（3-50 nm）的胶体金颗粒吸附在SiO2材料表面组成一个复合纳米微球，该微球同时具有胶体金的肉眼比色性能以及量子点优异的荧光性能，是一种双信号且分散性良好的新型纳米材料，通过调节胶体金颗粒和量子点的比例可以得到不同比色-荧光性能的双信号纳米微球。该微球应用在免疫层析中，既可实现疑似患者大规模的定性筛查，也可用于小规模的超敏定量筛查。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种比色荧光双信号纳米微球，其特征在于：它包括内核和由内至外依次包裹在内核外的第一正电夹层、第一壳层、第二正电夹层和第二壳层；
所述内核为SiO2纳米颗粒；
所述第一壳层为金纳米粒子和羧基化量子点的复合层；
所述第二壳层为羧基化量子点层。
上述比色荧光双信号纳米微球中，所述比色荧光双信号纳米微球的粒径可为150～400 nm，如250 nm；
所述SiO2纳米颗粒的粒径可为100~350 nm，优选150～300 nm，如200 nm；
所述第一正电夹层和所述第二正电夹层的厚度均可为1～10 nm，如10 nm；
所述金纳米粒子的粒径可为3～50 nm，如20 nm；
所述第一壳层和所述第二壳层中的羧基化量子点的粒径可为10～15 nm，如10nm；
所述羧基化量子点为CdSe/ZnS-COOH颗粒；
所述第一壳层的厚度为10～50 nm，如10nm；
所述第二壳层的厚度为5～15 nm，如10nm。
上述的比色荧光双信号纳米微球中，所述比色荧光双信号纳米微球的激发光为紫外光，激发波长优选365 nm；
所述比色荧光双信号纳米微球的荧光发射波长可为450～750 nm。
第二方面，本发明提供所述的比色荧光双信号纳米微球的制备方法，包括：
使正电性的聚乙烯亚胺、负电性的所述金纳米粒子、负电性的所述羧基化量子点、正电性的聚乙烯亚胺、负电性的所述羧基化量子点在负电性的所述SiO2纳米颗粒的表面依次进行静电层层自组装，得到所述比色荧光双信号纳米微球。
进一步地，所述SiO2纳米颗粒按照包括如下步骤的方法制备：在溶剂中依次加入还原剂和硅源进行Stöber合成反应，反应结束后离心收集沉淀，将所述沉淀洗涤后干燥，得到所述SiO2纳米颗粒。
所述硅源为正硅酸乙酯（TEOS）；
所述还原剂为28wt%氨水；
所述溶剂为无水乙醇和水；
所述无水乙醇、水、28wt%氨水和正硅酸乙酯的体积比具体可为100:6:3.5:4。
所述Stöber合成反应的温度为室温，如25℃，时间为3～6 h，如5 h。
所述离心的转速具体可为6000 rpm，时间具体可为6 min。
所述干燥为真空干燥，温度为60℃，时间为6 h。
进一步地，所述金纳米粒子（AuNP）可通过商业途径购买得到，也可通过柠檬酸钠还原法制备得到。
进一步地，所述静电层层自组装包括如下步骤：
（1）将所述SiO2纳米颗粒加入所述聚乙烯亚胺的水溶液中进行超声反应，经第一次自组装，得到SiO2@PEI颗粒；
（2）将所述金纳米粒子的水溶液和所述SiO2@PEI颗粒的水溶液混合进行超声反应，经第二次自组装，得到SiO2@Au颗粒；
（3）将所述羧基化量子点的水溶液和所述SiO2@Au颗粒的水溶液混合进行超声反应，经第三次自组装，得到SiO2@Au/QD颗粒；
（4）将所述SiO2@Au/QD颗粒的水溶液加入所述聚乙烯亚胺的水溶液中进行超声反应，经第四次自组装，得到SiO2@Au/QD@PEI颗粒；
（5）将所述SiO2@Au/QD@PEI颗粒的水溶液和所述羧基化量子点的水溶液混合进行超声反应，经第五次自组装，得到所述比色荧光双信号纳米微球。
更进一步地，步骤（1）中，每1~20 mg的所述SiO2纳米颗粒加入20~100 mL所述聚乙烯亚胺的水溶液中，如每10 mg的所述SiO2纳米颗粒加入20~100 mL所述聚乙烯亚胺的水溶液中，再如每10 mg的所述SiO2纳米颗粒加入50 mL所述聚乙烯亚胺的水溶液中；
所述聚乙烯亚胺的水溶液的浓度可为0.2 mg/mL～5 mg/mL，优选1 mg/mL；
所述聚乙烯亚胺的分子量可为5000～80000，具体可为25000；
所述第一次自组装中的超声时间可为20～60 min，优选40 min；
步骤（1）还包括在所述超声反应后在6000 rpm下离心6 min，收集沉淀的步骤。
步骤（2）中，所述金纳米粒子的水溶液与所述SiO2@PEI颗粒的水溶液的体积比可为（5～10）：1，具体可为10：1；
所述金纳米粒子的水溶液的浓度为10～50 nM，具体可为10 nM；
所述SiO2@PEI颗粒的水溶液的浓度为0.2～1 mg/mL；
所述第二次自组装中的超声时间可为20～50 min，优选30 min；
步骤（2）还包括在所述超声反应后在5500 rpm下离心6 min，收集沉淀的步骤。
步骤（3）中，所述羧基化量子点的水溶液与所述SiO2@Au颗粒的水溶液的体积比为（5～10）：1，具体可为10：1；
所述羧基化量子点的水溶液的浓度为0.1 nmol/L～10 nmol/L，具体可为0.1nmol/L；
所述SiO2@Au颗粒的水溶液的浓度为0.2～1 mg/mL；
所述第三次自组装中的超声时间为20～60 min，优选40 min；
步骤（3）还包括在所述超声反应后在5200 rpm下离心6min，收集沉淀的步骤。
步骤（4）中，所述SiO2@Au/QD的水溶液与所述聚乙烯亚胺的水溶液的体积比可为1：（5～10），具体可为1：10；
所述SiO2@Au/QD颗粒的水溶液的浓度为0.2～1 mg/mL；
所述聚乙烯亚胺的水溶液的浓度为0.2 mg/mL～5mg/mL，优选1 mg/mL；
所述聚乙烯亚胺的分子量可为5000～80000，具体可为25000；
所述第四次自组装中的超声时间可为30～60 min，优选40 min；
步骤（4）还包括在所述超声反应后在5200 rpm下离心6min，收集沉淀的步骤。
步骤（5）中，所述羧基化量子点的水溶液与所述SiO2@Au/QD@PEI颗粒的水溶液的体积比为（5～10）：1，具体可为10：1；
所述SiO2@Au/QD@PEI颗粒的水溶液的浓度为0.2～1 mg/mL；
所述羧基化量子点的水溶液的浓度为0.1 nmol/L～10 nmol/L；
所述第五次自组装中的超声时间可为20～60 min，优选40 min；
步骤（5）还包括在所述超声反应后在5000 rpm下离心6min，收集沉淀的步骤。
第三方面，本发明提供所述的比色荧光双信号纳米微球作为示踪物荧光标签在检测新型冠状病毒或制备用于检测新型冠状病毒的产品中的应用。
上述的应用中，所述产品具体可为免疫层析试纸条。
第四方面，本发明提供一种用于检测新型冠状病毒的免疫层析试纸条，包括底板和所述底板上依次搭接的样品垫、结合垫、层析膜和吸收垫；所述结合垫喷涂新型冠状病毒特异性抗体与上述任一项所述的比色荧光双信号纳米微球偶联的复合物。
上述的免疫层析试纸条中，新型冠状病毒待测目标物可为新型冠状病毒的重组NP蛋白或新型冠状病毒的灭活病毒；
所述新型冠状病毒可为咽拭子样本；
所述复合物通过所述比色荧光双信号纳米微球外壳的羧基基团与所述新型冠状病毒特异性抗体的氨基端形成肽键偶联。
具体地，所述结合垫喷涂有新型冠状病毒检测抗体与上述比色荧光双信号纳米微球偶联的复合物，所述新型冠状病毒检测抗体能与新型冠状病毒待测目标物发生特异性结合，形成抗原-抗体-纳米微球的免疫复合物；
所述层析膜上设有检测线和质控线，所述检测线包被能与新型冠状病毒待测目标物特异性结合的新型冠状病毒捕获抗体，所述质控线包被能与所述新型冠状病毒检测抗体特异性结合的抗体。
更具体地，所述质控线包被抗体为羊抗鼠IgG。
利用上述免疫层析试纸条检测新型冠状病毒的方法包括如下步骤：取100微升咽拭子保存液（上样液）加入到试纸条加样口处，15分钟后读取免疫层析试纸条检测线处的比色或荧光信号。
本发明检测方法既可利用胶体金的比色法实现快速定性检测，也可以利用量子点荧光信号实现超敏检测。
第五方面，本发明进一步保护一种用于检测新型冠状病毒的免疫层析试剂盒，包括检测试纸条，所述检测试纸条为上述任一项所述的试纸条。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
（1）本发明提出的双信号纳米微球材料性能优越，从结构组成上看，同时具有胶体金和量子点双信号外壳，可提供直接读取的比色信号及365 nm激发下的荧光信号；具有粒径可调的SiO2核心，可控制复合纳米微球的大小；此外该材料的分散性好、稳定性强、制备可控，具有较强的比色信号以及优异的荧光信号。羧基化量子点组成的外壳可提供大量抗体偶联的位点，是目前综合性能最优异的硅核量子点复合微球。
（2）本发明提出采用PEI层层自组装法制备双信号纳米微球，制备方法简单、高效、可控，重复性好，可实现大批量生产，可制备不同粒径大小的复合量子点纳米微球。
（3）本发明提出的PEI层层自组装法是一种通用的硅核量子点微球的制备方法。通过更换不同粒径的SiO2颗粒（100～350 nm）可以制备不同粒径大小的双信号硅球量子点（150～400 nm）。
（4）本发明提出的双信号纳米微球具有广阔的应用前景，包括在生物传感器、POCT等领域的应用。在双信号纳米微球表面修饰上检测抗体，即可作为高性能的双信号硅核量子点免疫标签用于生物样本中目标物的快速及超敏检测。
（5）本发明提出的双信号纳米微球作为硅核量子点标签用于免疫层析检测，具有肉眼可读的比色信号及紫外激发的荧光信号。它既可以作为基层群众自检快速筛查工具，又可借助荧光仪器进行荧光信号检测，尤其是低浓度样本的快速定量检测。
综上，本发明的PEI层层自组装法，实现了双信号纳米微球的可控制备，制备程序简单可控。制备出的双信号纳米微球具有良好的分散性、比色及荧光性能，且粒径均一可控，量子点外壳表面的羧基位点易于抗体修饰，在新型冠状病毒检测中具有明显的优势。
附图说明
图1为本发明的比色荧光双信号纳米微球SiO2@Au@DQDs的制备方法示意图。
图2为本发明实施例1中比色荧光双信号纳米微球制备过程中各组分的透射电子显微镜图（TEM）图，图2a为SiO2颗粒透射电镜图，图2b为SiO2@Au颗粒透射电镜图，图2c为SiO2@Au/QDs颗粒透射电镜图，图2d为SiO2@Au@DQDs颗粒透射电镜图，图2e、图2f、图2g、图2h分别为SiO2、SiO2@Au、SiO2@Au/QDs、SiO2@Au@DQDs颗粒的高清透射电子显微图，图2i图为SiO2@Au@DQDs的元素面扫描图，从元素扫描图中可以看出胶体金颗粒和量子点颗粒均匀的分布在SiO2表面。
图3为本发明实施例1中比色荧光双信号纳米微球制备过程中的表征图，图3a为各组分的Zeta电位图，图3b为各组分在日光及紫外光激发下的图片（上-日光；下-紫外光）和荧光光谱图（激发波长365nm），由图可知，合成的比色荧光双信号纳米微球具有明显的比色信号和强荧光信号。
图4为本发明实施例1中的比色荧光双信号纳米微球的时间稳定性图。
图5为本发明实施例2中的比色荧光双信号纳米微球修饰抗体的原理图。
图6为本发明实施例3的比色荧光双信号纳米微球作为免疫层析系标签检测新型冠状病毒的实验流程图。
图7为本发明实施例3的基于比色荧光双信号纳米微球的免疫层析系统检测新型冠状病毒重组NP蛋白的测试分析结果，图7a为检测新型冠状病毒重组NP蛋白的试纸条比色结果，图7b为检测新型冠状病毒重组NP蛋白的试纸条荧光结果（365nm波长紫外激发），图7c为根据新型冠状病毒重组NP蛋白浓度和T线处荧光信号强度构建的校准曲线。
图8为本发明实施例3的基于比色荧光双信号纳米微球的免疫层析系统检测灭活病毒的实验结果图，图8a为检测灭活病毒的试纸条比色结果图，图8b为检测灭活病毒的试纸条荧光结果图，图8c为根据荧光模式下T线处的荧光信号构建的柱状图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
新型冠状病毒重组NP蛋白购自北京义翘神州有限公司，货号为40588-V08B。
新型冠状病毒灭活病毒由中国人民解放军军事科学院军事医学研究院秦成峰实验室提供，在文献“Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2，doi：10.1126/science.abc1932”中公开，公众可从申请人处获得该生物材料，所得生物材料仅可用于验证本发明所述实验，不可用作其他用途。
实施例1
按照图1所示流程图制备比色荧光双信号纳米微球，具体步骤如下：
（1）制备分散性良好的200 nm SiO2核心：
将100 mL无水乙醇、6 mL去离子水、3.5 mL 28%氨水依次加入到250mL锥形瓶中，加入洗净的搅拌子，磁力搅拌20 min。快速一次性加入4 mL正硅酸乙酯溶液，室温搅拌5 h。反应结束后，6000 rpm/6 min离心得到SiO2颗粒沉淀，使用无水乙醇清洗3次，将洗涤后的产物置于真空烘箱中60℃真空干燥6 h，获得200 nm SiO2颗粒干粉备用。
（2）制备SiO2@PEI颗粒：
称取10 mg的200 nm SiO2颗粒溶解于50 mL新鲜配置的PEI溶液中(1 mg/mL；PEI分子量为25000)，剧烈超声反应40分钟。6000 rpm/6 min离心，使用去离子水洗2遍，重悬于5 mL去离子水中待用。
（3）制备硅核金壳SiO2@Au颗粒：
将上述制备的SiO2@PEI溶液（5 mL）加入到50 mL 粒径为20 nm的AuNP溶液（浓度10 nM）中，剧烈超声30分钟，带强正电的SiO2@PEI大量吸附带负电荷的AuNP，形成SiO2@Au颗粒。5500 rpm/6 min离心，重悬于5 mL去离子水中待用。
（4）制备SiO2@Au/QD颗粒：
将上述制备的SiO2@Au溶液（5 mL）加入到50 mL CdSe/ZnS-COOH溶液（0.1 nmol/L，苏州星烁纳米科技有限公司，量子点粒径为10 nm）中，剧烈超声40分钟，硅核表面未反应的带强正电的SiO2@PEI吸附带负电荷的CdSe/ZnS-COOH，形成SiO2@Au/QD颗粒。5200 rpm/6min离心，去离子水清洗一遍后重悬于5 mL去离子水中待用。
（5）制备SiO2@Au/QD@PEI颗粒：
将上述制备的SiO2@Au/QD溶液（5 mL）加入到50 mL新鲜配置的PEI溶液中(1 mg/mL；PEI分子量为25000)，剧烈超声反应40分钟。5200 rpm/6 min离心，去离子水清洗2遍后重悬于5 mL去离子水中待用。
（6）制备双信号纳米微球SiO2@Au@DQDs颗粒：
将上述制备的SiO2@Au/QD@PEI溶液（5 mL）加入到50 mL CdSe/ZnS-COOH溶液中（浓度为0.1 nmol/L，苏州星烁纳米科技有限公司，量子点粒径为10nm），剧烈超声40分钟，表面带强正电的SiO2@QDs@PEI大量吸附带负电荷的CdSe/ZnS-COOH，形成SiO2@Au@DQDs量子点颗粒。5000 rpm/6 min离心，使用去离子水清洗一遍后重悬于10 mL去离子水中待用。
本实施例制备的比色荧光双信号纳米微球，包括SiO2纳米颗粒内核和由内至外依次包裹在内核外的PEI第一正电夹层、金纳米粒子和羧基化量子点CdSe/ZnS-COOH的复合的第一壳层、PEI第二正电夹层和羧基化量子点第二壳层；其中，SiO2纳米颗粒的粒径大小为200 nm，PEI第一正电夹层和PEI第二正电夹层的厚度为10 nm，金纳米粒子即胶体金颗粒的粒径为20 nm，羧基化量子点CdSe/ZnS-COOH的粒径为10 nm，第一壳层厚度为10 nm，第二壳层的厚度为10 nm，合成的比色荧光双信号纳米微球的最终粒径约为250 nm，同时具有比色信号与强荧光信号，分散性与稳定性良好。
图2a为本实施例步骤（1）制得的SiO2内核颗粒，图2b为步骤（3）制得的SiO2@Au颗粒，图2c为步骤（4）制得的SiO2@Au/QDs颗粒，图2d为步骤（6）制得的SiO2@Au@DQDs颗粒的透射电子显微镜图（TEM）。图2e、图2f、图2g、图2h分别为SiO2、SiO2@Au、SiO2@Au/QDs、SiO2@Au@DQDs颗粒的高清透射电子显微图，图2i图为SiO2@Au@DQDs的元素面扫描图。由图可知，制备的双信号量子点微球粒径均一，胶体金壳和双层量子点壳吸附在SiO2颗粒表面，使得产物同时具有比色信号和强荧光信号。
本实施例所制得的双信号纳米微球的表征结果如图3所示。本发明提出的双信号量子点微球采用PEI介导的层层自组装法制备而来，由图3a各组分的Zeta电位变化可知，利用PEI的静电吸附作用将负电性的胶体金和量子点吸附在硅核表面；图3b为各组分在日光及紫外光激发下的照片及荧光光谱图。由图可知，合成的双模式量子点微球具有明显的比色信号和强荧光信号。图4为双信号量子点微球的时间稳定性信号图，由图可知，本发明制备的双信号量子点微球荧光性能稳定，在两个月内荧光信号基本不变。
实施例2
本发明提出的双信号纳米微球的表面为MPA修饰的羧基化量子点，表面的羧基可以用于偶联抗体，提供了纳米材料的表面功能化的位点。本发明提出的双信号纳米微球表面抗体修饰的步骤如图5所示，包括以下步骤：
将1mg SiO2@Au@DQDs粉末溶解在1 mL 2-(N-吗啉)乙磺酸溶液（0.1 M，pH 5.5）中，然后加入100 μL碳二亚胺溶液（0.01M）和20 μL N-羟基琥珀酰亚胺溶液（0.1M），超声反应15 min活化SiO2@Au@DQDs表面的羧基；然后通过离心回收SiO2@Au@DQDs，重悬于200 μLPBST溶液中（0.01 M，pH7.4）；加入15 μg新型冠状病毒NP蛋白特异性抗体（COV19-PS-Mab1，菲鹏生物股份有限公司），室温震荡反应2 h后加入150 μL BSA（10%），继续封闭反应1 h后，离心回收产物并用PBST清洗1遍，重悬于100 μL PBST中，加入100 μL金标稀释液，混匀后铺在硝酸纤维膜上制作结合垫，组装成试纸条待用（质控线：羊抗鼠IgG,货号D111024-0010，生工生物工程股份有限公司。检测线包被抗体：货号COV19-PS-MAb2，菲鹏生物股份有限公司。）。灭活病毒的试纸条的制备过程同上，所用抗体同上述重组NP蛋白试纸条中的抗体。
实施例3
本发明提出的双信号纳米微球表面修饰抗体后可作为高性能比色及荧光纳米标签用于免疫层析系统。本实施例采用新型冠状病毒NP蛋白特异性抗体修饰的双信号量子点微球作为免疫层析标签，检测咽拭子样本中的新型冠状病毒的NP蛋白及新型冠状病毒的灭活病毒。图6为本实施例所示的双信号量子点微球标签作为荧光标签与免疫层析系统联用快速检测新型冠状病毒NP蛋白的实验流程图。图7为基于双信号量子点微球免疫层析系统检测新型冠状病毒重组NP蛋白的测试分析结果。图7a和b为检测新型冠状病毒重组NP蛋白的试纸条的比色及荧光结果（365nm波长紫外激发）。从图中可见，试纸条检测线（T线）上的比色及荧光强度在一定范围内随着新型冠状病毒重组NP蛋白浓度的降低而逐渐减弱，肉眼观察到的比色信号为0.1 ng/mL，荧光分析仪读值的检测限为0.005 ng/mL。图7c为根据新型冠状病毒重组NP蛋白浓度和T线处荧光信号强度，建立了基于双信号量子点微球标签的S型拟合曲线。误差线为测量五次所得。图8为本发明实施例3的基于双信号量子点微球标签的免疫层析系统检测灭活病毒的实验结果图，灭活病毒的原始浓度为109copies/mL。由图可知，肉眼观察到的比色信号为稀释1万倍，荧光分析仪读值的检测限为10万倍。因此，由实验结果可知，本发明提出的双信号量子点微球作为免疫层析标签可快速高灵敏的检出新型冠状病毒。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.一种比色荧光双信号纳米微球，其特征在于：它包括内核和由内至外依次包裹在内核外的第一正电夹层、第一壳层、第二正电夹层和第二壳层；
所述内核为SiO2纳米颗粒；
所述第一壳层为金纳米粒子和羧基化量子点的复合层；
所述第二壳层为羧基化量子点层。
2.根据权利要求1所述的比色荧光双信号纳米微球，其特征在于：所述比色荧光双信号纳米微球的粒径为150～400 nm；
所述SiO2纳米颗粒的粒径为100～350 nm；
所述第一正电夹层和所述第二正电夹层的厚度均为1～10 nm；
所述金纳米粒子的粒径为3～50 nm；
所述第一壳层和所述第二壳层中的羧基化量子点的粒径为10～15 nm；
所述羧基化量子点为CdSe/ZnS-COOH颗粒；
所述第一壳层的厚度为10～50 nm；
所述第二壳层的厚度为5～15 nm。
3.根据权利要求1或2所述的比色荧光双信号纳米微球，其特征在于：所述比色荧光双信号纳米微球的激发光为紫外光；
所述比色荧光双信号纳米微球的荧光发射波长为450～750 nm。
4.权利要求1-3中任一项所述的比色荧光双信号纳米微球的制备方法，包括：
使正电性的聚乙烯亚胺、负电性的所述金纳米粒子、负电性的所述羧基化量子点、正电性的聚乙烯亚胺、负电性的所述羧基化量子点在负电性的所述SiO2纳米颗粒的表面依次进行静电层层自组装，得到所述比色荧光双信号纳米微球。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述静电层层自组装包括如下步骤：
（1）将所述SiO2纳米颗粒加入所述聚乙烯亚胺的水溶液中进行超声反应，经第一次自组装，得到SiO2@PEI颗粒；
（2）将所述金纳米粒子的水溶液和所述SiO2@PEI颗粒的水溶液混合进行超声反应，经第二次自组装，得到SiO2@Au颗粒；
（3）将所述羧基化量子点的水溶液和所述SiO2@Au颗粒的水溶液混合进行超声反应，经第三次自组装，得到SiO2@Au/QD颗粒；
（4）将所述SiO2@Au/QD颗粒的水溶液加入所述聚乙烯亚胺的水溶液中进行超声反应，经第四次自组装，得到SiO2@Au/QD@PEI颗粒；
（5）将所述SiO2@Au/QD@PEI颗粒的水溶液和所述羧基化量子点的水溶液混合进行超声反应，经第五次自组装，得到所述比色荧光双信号纳米微球。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，每1~20 mg的所述SiO2纳米颗粒加入20~100 mL所述聚乙烯亚胺的水溶液中；
所述聚乙烯亚胺的水溶液的浓度为0.2 mg/mL～5 mg/mL；
所述聚乙烯亚胺的分子量为5000～80000；
所述第一次自组装中的超声时间为20～60 min；
步骤（2）中，所述金纳米粒子的水溶液与所述SiO2@PEI颗粒的水溶液的体积比为（5～10）：1；
所述金纳米粒子的水溶液的浓度为10～50 nM；
所述SiO2@PEI颗粒的水溶液的浓度为0.2～1 mg/mL；
所述第二次自组装中的超声时间为20～50 min；
步骤（3）中，所述羧基化量子点的水溶液与所述SiO2@Au颗粒的水溶液的体积比为（5～10）：1；
所述羧基化量子点的水溶液的浓度为0.1 nmol/L～10 nmol/L；
所述SiO2@Au颗粒的水溶液的浓度为0.2～1 mg/mL；
所述第三次自组装中的超声时间为20～60 min；
步骤（4）中，所述SiO2@Au/QD颗粒的水溶液与所述聚乙烯亚胺的水溶液的体积比为1：（5～10）；
所述SiO2@Au/QD颗粒的水溶液的浓度为0.2～1 mg/mL；
所述聚乙烯亚胺的水溶液的浓度为0.2 mg/mL～5 mg/mL；
所述第四次自组装中的超声时间为30～60 min；
步骤（5）中，所述羧基化量子点的水溶液与所述SiO2@Au/QD@PEI颗粒的水溶液的体积比为（5～10）：1；
所述SiO2@Au/QD@PEI颗粒的水溶液的浓度为0.2～1 mg/mL；
所述羧基化量子点水溶液的浓度为0.1 nmol/L～10 nmol/L；
所述第五次自组装中的超声时间为20～60 min。
7.权利要求1-3中任一项所述的比色荧光双信号纳米微球作为示踪物荧光标签在检测新型冠状病毒或制备用于检测新型冠状病毒的产品中的应用。
8.一种用于检测新型冠状病毒的免疫层析试纸条，包括底板和所述底板上依次搭接的样品垫、结合垫、层析膜和吸收垫，其特征在于：所述结合垫包被新型冠状病毒特异性抗体与权利要求1-3中任一项所述的比色荧光双信号纳米微球偶联的复合物。
9.根据权利要求8所述的免疫层析试纸条，其特征在于：所述复合物通过所述比色荧光双信号纳米微球外壳的羧基基团与所述新型冠状病毒特异性抗体的氨基端形成肽键偶联。
10.一种用于检测新型冠状病毒的免疫层析试剂盒，包括检测试纸条，其特征在于：所述检测试纸条为权利要求8或9所述的试纸条。
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|---|---|---|---|---|
| CN116106284A (zh) * | 2023-04-11 | 2023-05-12 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种基于氧化石墨烯的比色荧光双模式复合纳米片及其制备方法与应用 |
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2022
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