CN106645679A - 基于核酸适配体的胶体金层析试纸条检测四环素 - Google Patents

基于核酸适配体的胶体金层析试纸条检测四环素 Download PDF

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Abstract

基于核酸适配体的胶体金层析试纸条检测四环素，利用胶体金与核酸适配体的特异性结合以及四环素与DNA间与核酸适配体竞争结合能力的强弱，包括以下步骤：适于标记aptamer的胶体金纳米粒子的合成；胶体金与适配体的组装与偶联；链霉亲和素和DNA链的组装；样品垫与金标垫的前处理；NC膜划线；试纸条的组装；四环素标准品的检测；选择性和特异性实验；运用所建立的基于核酸适配体胶体金试纸条测定实际样品中的四环素。本方法提供了一种既有较好选择性和灵敏度，又简便、经济、易于操作，更适于现场快速检测的四环素检测方法。

Description

基于核酸适配体的胶体金层析试纸条检测四环素
技术领域
基于核酸适配体(aptamer)的胶体金(AuNPs)层析试纸条检测四环素(TET)，属于分析化学技术领域。
背景技术
四环素类抗生素作为一种广谱抗生素被广泛地用来控制细菌感染，在动物疾病的治疗中发挥着举足轻重的作用。其中，四环素因高效性、广谱性和低成本性等特点，已成为应用最为普遍的一类抗生素。四环素不仅作为药物广泛地应用于人类与动物疾病的预防与治疗，同时也作为饲料添加剂被大量地使用，用于提高饲料利用效率和促进动物生长。
然而，四环素化学性质相对稳定，且具有一定的持久性，造成了其在环境中的残留，大量研究证实了四环素广泛存在于土壤和生态水中。不仅如此，在动物饲料中过度和不适当的添加会造成四环素或其降解产物高水平的残留与累积在动物源性食品中，如牛奶、肉类、鱼类和鸡蛋。
当人们摄入带有四环素残留的这些食物，可能会造成牙齿发黄，机体耐药性增强、过敏反应、胃肠道紊乱以及肝损伤，严重威胁人体健康。
因此，为保障人体健康，许多国际组织规定了四环素在食品中的最大残留限量(MRL)，如美国食品药品管理局、欧盟和联合国食品法典委员会限定牛奶中四环素的MRL分别为900nM、225nM和100μg/Kg。而我国农业部允许四环素在牛奶中的MRL为100ng/mL。
目前，四环素的常用检测方法是色谱分析方法，如毛细管电泳法、高效液相色谱法、液相色谱—质谱联用法等，这些方法大多需要漫长而复杂的分析过程、昂贵的仪器以及专业人员的操作，并不适合于现场快速检测。另一种常用的检测方法是酶联免疫吸附法，虽然其检测灵敏度较高，但是选择性差，且费用较为昂贵。因此有必要研发出既有较好选择性和灵敏度，又简便、经济、易于操作，更适于现场快速检测的四环素检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于核酸适配体的胶体金层析试纸条检测四环素的方法，以快速、简单、灵敏地检测四环素的残留量。
技术问题：基于核酸适配体的胶体金试纸条检测四环素基于以下原理：
基于aptamer的试纸条设计方法的原理是基于DNA探针1(测试线)及目标TET与aptamer结合的竞争反应。如果检测液中存在TET，将与aptamer-AuNPS探针结合，减少了与DNA探针1杂交的aptamer-AuNPS，使检测线上红色的颜色强度变弱。换句话说，溶液中的目标TET越多，测试线的强度较弱；无论目标TET的在检测溶液中是否存在，aptamer-AuNPs探针一定会在控制线与DNA探针2杂交，以确保检测的效度。评估此方法的灵敏度是根据试纸条的视觉检测限，即最小目标浓度在测试线上的颜色与不用靶分析的阴性对照条带的测试线有显著不同的颜色。
本发明的技术方案：
包括以下步骤：适于标记aptamer的胶体金纳米粒子的合成；胶体金与核酸适配体的组装与偶联；链霉亲和素和DNA链的组装；样品垫与金标垫的前处理；NC膜划线；试纸条的组装；四环素标准品的检测；选择性和特异性实验；实际样品的检测。
(1)适于标记aptamer的胶体金纳米粒子的合成
①样品制备
对于所有制样的玻璃器皿彻底用王水(盐酸/HNO3，体积比3:1)清洗然后烘干备用。100mL的0.01％氯金酸溶液彻底煮沸，并在不断搅拌下迅速加入2.5mL的1％的柠檬酸三钠溶液。将溶液再煮沸10min时，溶液的颜色在1min内从蓝色变为酒红色。目测所制备的胶体金溶液，颜色呈鲜亮的酒红色，分布均 匀，无明显颗粒沉淀物或漂浮物。在室温搅拌下冷却后，将溶液贮存于4℃黑暗中做进一步研究。所制备AuNPs的尺寸分布是由紫外分光光度计检测吸光度确认。
②参数
紫外分光光度计型号为UV-2550；光谱值范围为400nm到800nm；扫描速度为60nm/分钟；带宽为100nm；数据间隔为1nm。将测得的OD值利用Origin软件进行处理并作出OD色谱图。
(2)aptamer-胶体金的组装与偶联
AuNPs-aptamer探针的制备是基于硫醇-金键的形成。AuNPs溶液在8000r/min离心15min，并分散到胶体金复溶液中形成特定的浓度。30μL硫醇改性aptamer溶液(10μM)加入到5备浓缩后的1mLAuNPs溶液中并在室温下反应12小时。然后，加入300μL20mM的NaCl溶液到2ml混匀后室温反应8小时。再加入1ml80mMNaCl，混匀后室温静置反应8h。该混合物通过离心在4℃，13000r/min纯化20min，弃去上清液，用偶联物复溶液溶解至1mL，4℃保存待用。探针偶联的结果通过紫外可见分光光度计进一步扫描确认。(3)建立核酸适配体的胶体金试纸条检测四环素
DNA1/2都用链霉亲和素修饰；样品垫用前处理液浸泡、金标垫用特制处理液浸泡后铺设金标适配子、DNA1/2划线于NC膜的检测线与控制线位置；上述三者37℃烘干后拼贴到试纸条底板上并切割成小条，与卡壳组装成型；配制四环素标准溶液500μg/mL滴至样品垫部位，在迁移过程中控制线出现明显红色，检测线颜色变浅或消失，说明有四环素检出。
(4)选择性测定
选择实际样品中易出现残留的与四环素结构相似的抗生素进行了选择性实验，分别为洛美沙星、恩诺沙星、土霉素和氯霉素；首先，分别配制等浓度四环素、土霉素、氯霉素、洛美沙星、恩诺沙星的标准溶液；其次，将上述10μg/mL抗生素溶液各吸取50μL分别滴入试纸条的加样孔中，样液完全扩散至吸水板上，反应大约15min；结果显示只有加入四环素的体系中出现检测线颜色明显变浅，即该基于核酸适配体的胶体金层析试纸条对于实际样品中四环素的检测具有较好的选择性。
(5)实际样品检测：选择牛奶作为实际样品进行检测。
吸取4mL的牛奶加入到15mL的离心管中，加入6mL的三重蒸馏水进行稀释后加入2mL 10％的三氯乙酸和2mL氯仿，涡旋混合1min后，在温度为20℃的条件下超声15min；然后，将上述溶液以13000转/分钟的转速离心10min，吸取上清液转移至另一个15mL的离心管中，再以10000转/分钟的转速离心10min，吸取上清液备用。分析中，将提取的上清液稀释20倍，等分为5份，加入不同浓度的四环素标准溶液进行测定。根据检测线颜色深浅，牛奶中四环素的视觉检出限为1.0×10-3μg/mL。
本发明的有益效果：
本发明建立了一种新型、高效的检测技术，适于对四环素的进行现场筛查和快速检测，对预防和控制食品安全事件具有一定的意义。
附图说明
图1适于标记核酸适配体的胶体金的紫外可见吸收光谱图
图2不同稀释倍数的金标适配子偶联物紫外可见光谱对比图
具体实施方式
(1)适于标记aptamer的胶体金纳米粒子的合成
材料/试剂：氯金酸(HAuCl4·3H2O)(阿拉丁)、柠檬酸三钠，均购买于生工生物工程股份有限公司(中国上海)。
方法：AuNPs的制备是根据稍作修改的经典Frens方法。首先，对于所有制样的玻璃器皿彻底用王水(盐酸/HNO3，体积比3:1)清洗然后烘干备用。100mL的0.01％氯金酸溶液彻底煮沸，并在不断搅拌下迅速加入1.8毫升的1％的柠檬酸三钠溶液。将溶液再煮沸5min时，溶液的颜色在1min内从蓝色变为酒红色。目测所制备的胶体金溶液，颜色呈鲜亮的酒红色，分布均匀，无明显颗粒沉淀物或漂浮物。在室温和搅拌下冷却后，将溶液贮存于4℃黑暗中做进一步研究。所制备AuNPs的尺寸分布是由紫外分光光度计检测吸光度确认。
结果：胶体金溶液在400～800nm波长范围内有一单吸收峰，最大吸收波长520nm，根据最大吸收波长(Y)与胶体金颗粒粒径(X)之间的回归方程：Y＝0.4271X+514.56(R＝0.974,P<0.01)可知本次制备的胶体金粒径大约为13nm。并且最大吸收峰峰宽较小，说明金粒子分布较均匀。
(2)AuNPs-aptamer探针的制备
材料/试剂：四环素核酸适配体、磷酸三氯乙基酯(TCEP)购买于生工生物工程股份有限公司(中国上海)
方法：①取TET适配子干粉，开盖前离心(5000rpm,5min)。缓慢加入适量适配子溶解液使终溶度为100μM，水平摇床上摇晃10min使充分溶解。取最低稳定量的100μM适配子溶液，加入等体积的5mg/mLTCEP溶液，充分混合，4℃反应2h；
②取5mL胶体金溶液，用0.1mol/L K2CO3溶液调节胶体金溶液pH值；
③将上述3所得溶液高速离心(13000rpm)15min；
④弃上清，浓缩胶体金至1mL，加蒸馏水至1.7mL；
⑤混合1和4两种溶液，手动振摇1min后，室温避光静置12h；
⑥加入300μL20mMNaCl溶液至2mL，振摇1min，继续静置8h
⑦将上述溶液分至2管，各加入500μL 80mM NaCl溶液，振摇1min，室温继续静置8h；
偶联物稀释不同浓度，用紫外分光光度计测定吸收光谱。
纯化：将结合好的金标适配子溶液于4℃、13000rpm冷冻高速离心20min，弃去上清液，将管底的暗红色胶状物合并；加入事先配制好的金标适配子偶联物复溶液重悬至1mL。4℃保存待用。
结果：结果表明，此法制得的金标适配子偶联状况较好。
(3)检测线和质控线的制备
材料/试剂：链霉亲和素、测试线的DNA探针1、控制线的DNA探针2购买于生工生物工程股份有限公司(中国上海)。
方法：取Probe1(DNA1)干粉，开盖前离心(5000rpm，5min)后加入工作液使终浓度为100μM，再稀释成25μM，Probe2(DNA2)配制成15μM；取40μL Probe1/2溶液分别与40μL链霉亲和素溶液在4℃下反应2h，再加入20μL 0.01mol/LPBS缓冲液；取划膜套装，将上述制备好的检测线/控制线溶液加入划线笔中，均匀划线于NC膜上，不要有间断；检测线和质控线分别划线成功后，将NC膜于37℃烘箱烘烤30min后放入密封袋中保存待用。
结果：成功将两条探针链固定在NC膜上。
(4)试纸条的组装
材料/试剂：快速检测部件套装、手动划膜套装购买于杰一生物技术有限公司(中国上海)；PBS、Tris、PEG20000、蔗糖、卵白蛋白OVA、氯化镁(MgCl2)、Na2HPO4、磷酸氢二钾(KH2PO4)、硫酸镁(MgSO4)均购买于生工生物工程股份有限公司(中国上海)
方法：4％蔗糖、1％OVA、0.25％Tween20的0.01mol/L PBS配制金标垫预处理液；2％蔗糖、0.25％Tween20、pH 7.4的0.01mol/LPBS为样品垫预处理液；将两种耗材裁剪为1cm×4cm的条分别浸泡于两种预处理液后37℃烘干；用金标适配子溶液浸润金标垫，再次烘干呈干脆状。将处理后的NC膜、吸水板、金标垫、样品垫分别层叠2mm粘贴于底板上，装于卡套内。
结果：制成四环素的基于核酸适配体的胶体金快速检测卡
(5)方法的选择性测定
材料/试剂：四环素核酸适配体、四环素、土霉素和氯霉素均购买于生工生物工程股份有限公司(中国上海)；洛美沙星、恩诺沙星均购买于美国西格玛奥德里奇公司(美国圣路易斯)。
方法：选择实际样品中易出现残留的与四环素结构相似的抗生素进行了选择性实验，分别为洛美沙星、恩诺沙星、土霉素和氯霉素。首先，分别将四环素、土霉素、氯霉素、洛美沙星、恩诺沙星的标准溶液稀释到500μg/mL；其次，将上述10μg/mL抗生素溶液各吸取50μL分别滴入试纸条的加样孔中，样液完全扩散至吸水板上，反应大约15min。
结果：结果显示只有加入四环素的体系中出现检测线颜色明显变浅，即该基于核酸适配体的胶体金层 析试纸条对于实际样品中四环素的检测具有较好的选择性。
(6)实际样品检测：选择牛奶作为实际样品进行检测
材料/试剂：四环素核酸适配体、四环素均购买于生工生物工程股份有限公司(中国上海)；牛奶购买于当地农场。
方法：吸取4mL的牛奶加入到15mL的离心管中，加入6mL的三重蒸馏水进行稀释后加入2mL 10％的三氯乙酸和2mL氯仿，涡旋混合1min后，在温度为20℃的条件下超声15min；然后，将上述溶液以13000转/分钟的转速离心10min，吸取上清液转移至另一个15mL的离心管中，再以10000转/分钟的转速离心10min，吸取上清液备用。分析中，将提取的上清液稀释20倍，等分为5份，如权利要求5所述的方法，加入不同浓度的四环素标准溶液进行测定。
结果：根据检测线颜色深浅，肉眼可检出牛奶中四环素的浓度为1.0×10-3μg/mL。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林大学
<120>基于核酸适配体的胶体金层析试纸条检测四环素
<160> 3
<210> 1
<211>54
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
gggtgggtgg gtgggtgggt cgctggtgac ccacccaaaa aaaaaaaaaa aaaa 54
<210>2
<211>54
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 2
cccacccacc cacccaccca gcgaccactg ggtggg 36
<210>3
<211> 54
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 2
tttttttttt tttttttt 18

Claims (4)

1.基于核酸适配体的胶体金层析试纸条检测四环素，其特征在于利用胶体金与核酸适配体的特异性结合以及四环素与DNA间与核酸适配体结合能力的强弱，包括以下步骤：建立基于核酸适配体的胶体金层析试纸条检测四环素；测定所建立的胶体金层析试纸条对四环素的选择性；运用所建立的胶体金层析试纸条测定实际样品中的四环素。
2.如权利要求1所述的方法，其中建立基于核酸适配体的胶体金层析试纸条检测四环素的步骤如下：用改进的Frens方法制备胶体金纳米粒子，并用UV-2550紫外分光光度计测吸光度推测其粒径，约13nm；胶体金纳米粒子与核酸适配体组装偶联；DNA1/2都用链霉亲和素修饰；样品垫用前处理液浸泡、金标垫用特制处理液浸泡后铺设金标适配子、DNA1/2划线于NC膜的检测线与控制线位置；上述三者37℃烘干后拼贴到试纸条底板上并切割成小条，与卡壳组装成型；四环素标准溶液500μg/mL滴至样品垫部位，在迁移过程中控制线出现明显红色，检测线颜色变浅或消失，说明有四环素检出。
3.如权利要求1所述的方法，其中测定所建立的基于核酸适配体的胶体金试纸条对四环素的选择性的实验步骤如下：选择实际样品中易出现残留的与四环素结构相似的抗生素进行了选择性实验，分别为洛美沙星、恩诺沙星、土霉素和氯霉素；首先，分别配制等浓度四环素、土霉素、氯霉素、洛美沙星、恩诺沙星的标准溶液；其次，将上述10μg/mL抗生素溶液各吸取50μL分别滴入试纸条的加样孔中，样液完全扩散至吸水板上，反应大约15min；结果显示只有加入四环素的体系中出现检测线颜色明显变浅，即该基于核酸适配体的胶体金层析试纸条对于实际样品中四环素的检测具有较好的选择性。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述运用所建立的基于核酸适配体的胶体金试纸条对实际样品中四环素的测定步骤如下：首先，进行牛奶样品前处理，吸取4mL的牛奶加入到15mL的离心管中，加入6mL的三重蒸馏水进行稀释后加入2mL 10％的三氯乙酸和2mL氯仿，涡旋混合1min后，在温度为20℃的条件下超声15min；然后，将上述溶液以13000转/分钟的转速离心10min，吸取上清液转移至另一个15mL的离心管中，再以10000转/分钟的转速离心10min，收集上清液，稀释20倍后分为若干份；然后，加入不同浓度的四环素标准溶液，按照权利要求2所述的方法，进行测定；根据检测线颜色深浅，牛奶中有四环素的视觉检测限为1.0×10-3μg/mL。
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