CN113278684B

CN113278684B - 基于适配体和铂修饰金纳米粒子的妥布霉素检测试纸

Info

Publication number: CN113278684B
Application number: CN202110357701.0A
Authority: CN
Inventors: 周楠迪; 金鑫; 张雨婷; 王晓丽
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-04-01
Filing date: 2021-04-01
Publication date: 2022-11-25
Anticipated expiration: 2041-04-01
Also published as: CN113278684A

Abstract

本发明涉及一种基于适配体和铂修饰金纳米粒子的妥布霉素检测试纸，试纸包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、PVC底板、检测线和质控线。利用铂修饰金纳米粒子(Au@PtNPs)负载核酸适配体(Apt)与互补探针(cDNA)杂交双链作为信号放大标签。Au@Pt NPs独特的双功能性质(等离子体光学性质和纳米模拟酶催化性质)提供了两种不同的检测方案：一种仅由AuNPs的本征颜色所产生的红色，另一种由催化底物所产生的更敏感的深蓝色，实现了按需调整的检测模式。本发明提供的试纸条使用简便快捷，灵敏高效，在食品和环境妥布霉素残留的现场点检测中有巨大的应用潜力。

Description

基于适配体和铂修饰金纳米粒子的妥布霉素检测试纸

技术领域

本发明涉及分析化学及医药、环境和食品检测领域，尤其涉及一种基于适配体和铂修饰金纳米粒子的妥布霉素检测试纸。

背景技术

妥布霉素(Tobramycin)是黑暗链霉菌发酵产生的次级代谢产物，分子式：C18H37N5O9，分子量467.51，属于氨基糖苷类的抗生素，具有水溶性好、性质稳定、抗菌谱广等特点，在临床和动物医疗中被广泛用于治疗革兰氏阴性菌等微生物所致的感染。然而，在农业、畜牧业、水产业等领域中过度使用妥布霉素，会导致其在动物源性食品以及生态环境中广泛残留最终通过食物链在人体内累积。这可能对人类健康产生严重影响，如胃肠道功能紊乱、肾脏毒害、近曲小管上皮细胞损坏，此外，滥用妥布霉素可能会使体内细菌产生耐受性，破坏人体内生态环境平衡，造成非致病菌死亡，致病菌或耐药菌大量繁殖，进而引发人和动物局部或全身感染。因此，建立一种检测食源性妥布霉素残留的方法进一步加强食品安全监管，是一项十分重要和紧迫的任务。

目前，检测妥布霉素残留的方法主要包括：微生物学方法，免疫学分析，表面等离子体共振(SPR)，高效液相色谱(HPLC)和电化学传感器方法等。尽管这些传统方法可以准确地检测妥布霉素，但由于其检测复杂，耗时长，设备昂贵且需要操作专业技术人员，因此其应用受到很大限制。因此，有必要建立一种快速，高效，灵敏的方法来现场检测妥布霉素残留。检测试纸的研制为现场点快速检测提供了新的希望。

农永玲等(基于AuNPs/PANI/TNTs纳米复合材料的电化学检测妥布霉素的适配体传感器，电化学，2019，25(06):720-730)提出了一种新型的检测妥布霉素的电化学适配体传感器，以差分脉冲伏安法(DPV)作为检测技术，亚甲基蓝作为电化学响应信号，构建了以纳米复合材料金纳米粒子/聚苯胺/二氧化钛纳米管(AuNPs/PANI/TNTs)修饰玻碳电极的电极支架，但检测妥布霉素的范围仅为0.5-70μmol·L^-1，灵敏度低且成本较高。

李满秀等(基于加替沙星和金纳米粒子间的荧光共振能量转移检测妥布霉素，分析科学学报，2019，35(03):362-366)以加替沙星为供体，金纳米粒子(AuNPs)为受体，建立了荧光共振能量转移(FRET)的新体系。该体系中加替沙星以非共价的方式吸附在AuNPs上，两者之间发生了有效的能量转移，导致加替沙星荧光猝灭。妥布霉素可以和AuNPs作用，使加替沙星从AuNPs表面释放，进而使体系的荧光恢复。据此建立了检测妥布霉素的荧光分析新方法。妥布霉素的检出限为6.5×10^-9mol/L，但荧光的使用使妥布霉素的可视化检测受到限制。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种基于核酸适配体和铂修饰金纳米粒子的妥布霉素检测试纸，将新型纳米生物材料、胶体金标记层析试纸条技术及核酸适配体等诸多技术的优势联合起来，制备一种简便快捷、灵敏高效、经济的妥布霉素残留的检测试纸并应用于实际样品检测。

本发明的第一个目的是提供一种基于适配体和铂修饰金纳米粒子的妥布霉素检测试纸，其特征在于：包括Au@PtNPs-cDNA-Apt偶联物、检测线和质控线；Au@PtNPs-cDNA-Apt偶联物包括铂修饰金纳米粒子、cDNA和特异性识别妥布霉素的适配体Apt，其中，cDNA和适配体Apt部分互补形成cDNA-Apt杂交双链体；cDNA的5’端或3’端有巯基修饰，铂修饰金纳米粒子和cDNA-Apt杂交双链体通过Au-S共价键偶联；

检测线包括DNA1，DNA1与cDNA部分互补；质控线包括DNA2；DNA2与cDNA完全互补。

本发明的妥布霉素检测试纸中，Au@PtNPs具有等离子体光学性质和酶催化性质，可作为信号放大标签。cDNA与适配体Apt部分互补，便于适配体Apt、cDNA后续分别与不同物质发生更强的结合。cDNA与检测线上的DNA1部分互补，与质控线上的DNA2全互补，适配体Apt与妥布霉素可以优先特异性结合并与cDNA脱离，通过cDNA与DNA1和DNA2的结合和分离来检测妥布霉素是否存在。

进一步地，cDNA的5’端或3’端修饰-(CH₂)₆-SH，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：

5’-AAAAAAGACTAGTGCCTAGT-3’。

进一步地，适配体Apt的序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：

5’-GACTAGGCACTAGTC-3’。

进一步地，DNA1的序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：

5’-AAAAAATCTAGGCACT-3’。

进一步地，DNA2的序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：

5’-ACTAGGCACTAGTCTTTTTT-3’。

进一步地，Au@PtNPs-cDNA-Apt偶联物由以下步骤制备得到：

(1)合成粒径为13-15nm的金纳米粒子：将氯金酸溶液搅拌加热至沸腾，加入柠檬酸钠水溶液，保持溶液沸腾并搅拌，直至颜色变为红色，冷却后，得到粒径为13-15nm的金纳米粒子溶液；

(2)以步骤(1)的金纳米粒子为种子，得到粒径为38-41nm的纳米金AuNPs：将步骤(1)的金纳米粒子溶液稀释，加入氯金酸溶液、L-抗坏血酸溶液和柠檬酸钠溶液，继续沸腾，得到粒径为38-41nm的纳米金溶液；

(3)以步骤(2)的AuNPs为核，合成核壳结构的铂修饰金纳米粒子Au@PtNPs：将步骤(2)粒径为38-41nm的纳米金溶液预热至90℃，加入六氯铂酸钠溶液和L-抗坏血酸溶液，充分反应得到核壳结构的铂修饰金纳米粒子Au@PtNPs；

(4)cDNA和适配体Apt于95℃下热变性后缓慢退火降温，形成cDNA-Apt杂交双链体，与硫醇类还原剂进行巯基化反应，然后加入到步骤(3)的Au@PtNPs中，室温振荡孵育，再加入dATP振荡孵育，得到Au@PtNPs-cDNA-Apt偶联物。

进一步地，在步骤(4)中，加入dATP振荡孵育后还包括稳定的步骤，具体为：加入NaCl溶液，先室温静置，再在3-5℃下保存。加NaCl的目的是调整最终体系中的盐浓度为一定的值来维持稳定性。

进一步地，稳定后还包括去除多余溶剂和重悬的步骤。采用离心的方式去除多余溶剂，再重悬于含5％蔗糖、5％BSA、0.5％Tween-20、0.5％Triton X-100的Na₃PO₄缓冲液中。

进一步地，在步骤(4)中，硫醇类还原剂包括三(2-羧乙基)膦。

本发明的一种基于适配体和铂修饰金纳米粒子的妥布霉素检测试纸，包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、PVC底板、检测线和质控线；PVC底板上依次设置有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫上设置有加样孔，硝酸纤维素膜上依次设置有检测线和质控线，金标垫包括上述Au@PtNPs-cDNA-Apt偶联物。

进一步地，样品垫和金标垫、金标垫和硝酸纤维素膜、硝酸纤维素膜和吸水垫均部分重叠；硝酸纤维素膜粘贴于PVC底板上，靠近样品垫的一端连接有金标垫，另一端连接有吸水垫。重叠的作用是保证试纸组装后的完整性，保证液体在毛细管虹吸作用下的迁移流通。

进一步地，检测线还包括链霉亲和素和生物素，生物素修饰DNA1。

进一步地，链霉亲和素和生物素修饰的DNA1的摩尔比为1:4。

进一步地，质控线还包括链霉亲和素和生物素，生物素修饰DNA2。链霉亲和素是大分子蛋白，可以被吸附在硝酸纤维素膜上，利用链霉亲和素-生物素偶联体系，可以把核酸探针DNA1和DNA2固定在硝酸纤维素膜上。

进一步地，链霉亲和素和生物素修饰的DNA2的摩尔比为1:4。

本发明的第二个目的是提供一种使用上述妥布霉素检测试纸检测妥布霉素的方法，包括低灵敏模式和高灵敏模式，具体包括以下步骤：

(1)将待测溶液加到试纸上，溶液依次经过Au@PtNPs-cDNA-Apt偶联物和检测线向质控线移动；

(2)当待测溶液中不存在妥布霉素时，Au@PtNPs-cDNA-Apt偶联物中的cDNA与质控线中全互补的DNA2优先互补结合，Au@PtNPs在质控线上聚集；

当待测溶液中存在妥布霉素时，Au@PtNPs-cDNA-Apt偶联物中的适配体Apt与妥布霉素特异性结合，游离的cDNA分别与DNA1和DNA2结合，Au@PtNPs在检测线和质控线上聚集；

(3)低灵敏模式：当仅有质控线呈红色，待测溶液中不存在目标物妥布霉素；当检测线和质控线均呈红色，待测溶液中存在目标物妥布霉素；

高灵敏模式：取TMB底物缓冲液滴加至检测线上，若显色，待测溶液中存在目标物妥布霉素；若不显色，待测溶液中不存在目标物妥布霉素。

进一步地，TMB底物缓冲液包括TMB和H₂O₂。TMB和H₂O₂反应后呈蓝色，Au@PtNPs可催化此反应，提高妥布霉素检测的灵敏度和准确度。

进一步地，低灵敏模式下使用胶体金定量仪对检测线进行光密度测定，或高灵敏模式下对检测线进行灰度测定，计算出待测溶液中妥布霉素的含量。

本发明检测试纸的原理为：在毛细管虹吸作用下，待测溶液由样品垫向吸水垫移动，通过在检测线和质控线位置聚集Au@PtNPs从而形成红色条带。当检测液中不存在妥布霉素时，Apt与cDNA在金标垫Au@PtNPs表面形成杂交双链体，随液体移动过程中，cDNA不能和检测线的固定探针(cDNA的部分互补探针)杂交结合，但是可以和质控线的固定探针(cDNA的全互补探针)优先互补结合。因此，只能在质控线上捕获到Au@PtNPs进而显色，试纸条上只能观察到一条红色条带。当检测液中存在妥布霉素时，Apt会优先特异性地与妥布霉素结合，从而与cDNA去杂交脱离下来，在随液体继续移动的过程中，Au@PtNPs表面游离的cDNA可进一步被检测线和质控线上的固定探针捕获从而显色，在低灵敏模式下，可以在试纸上观察到两条红色条带；显色完全后，对于高灵敏模式，将TMB底物缓冲液滴加到检测线上后可以观察到在T线上产生颜色更加敏感的深蓝色产物沉积。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

(1)本发明利用铂修饰金纳米粒子独特的双功能性质(等离子体光学性质和酶催化性质)将检测信号放大以及适配体的构象变化实现检测线光学信号的强弱变化，可提供两种检测模式，实现“按需”调整的妥布霉素检测。

(2)试纸法检测妥布霉素简便快速，灵敏高效、结果可视化、可随时随地检测，整个过程可在10min内获得检测结果，提高了现场检测效率，同时可实现定量分析，对食源性妥布霉素残留的检测具有重要意义。

(3)该试纸条还可通过更换适配体Apt和cDNA序列用于其它靶标的检测。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。

图1为本发明试纸组装图、妥布霉素检测阳性原理图和阴性原理图；

图2为用试纸条在低灵敏模式下对不同浓度妥布霉素标准溶液的检测图和标准曲线图；

图3为用试纸条在高灵敏模式下对不同浓度妥布霉素标准溶液的检测图和标准曲线图；

图4为用试纸条对含不同浓度妥布霉素的牛奶样品的检测图。

附图标记说明：

1、样品垫；2、金标垫；3、硝酸纤维素膜；4、PVC底板；5、吸水垫；6、检测线；7、质控线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

基于核酸适配体和铂修饰金纳米粒子的妥布霉素检测试纸的制备，包括铂修饰金纳米粒子的制备及功能化、金标垫和样品垫的预处理、硝酸纤维素膜的预处理、试纸条的组装、试纸条检测。具体步骤为：

(1)铂修饰金纳米粒子的制备及功能化：

将使用的玻璃器皿均在王水中浸泡30min，然后蒸馏水彻底清洁后再用超纯水浸泡12h，烘干备用；

第一步，合成15nmAuNP的种子。将50mL质量浓度为0.01％的氯金酸添加至100mL的圆底烧瓶中，搅拌并加热至沸腾。随后，将2mL质量浓度1％的柠檬酸钠水溶液快速添加至沸腾溶液中。保持溶液沸腾并搅拌30min，直到其颜色变为红色。冷却后，得到粒径为15nm的金纳米粒子溶液；

第二步，用上述15nm的纳米金作为种子，合成粒径为40nm的纳米金。用去离子水将1700μL的15nm纳米金溶液稀释至20mL，并在室温搅拌下置于50mL圆底烧瓶中。然后，将10mL含370μL质量浓度为1％氯金酸的前体溶液和10mL分别含0.6mL质量浓度为1％的L-抗坏血酸溶液和0.3mL质量浓度为1％的柠檬酸钠溶液以12mL/h的速率分别注入到烧瓶中。两种溶液完全注入后，将混合物继续搅拌并加热，继续沸腾30min；

第三步，合成核壳结构的铂修饰金纳米粒子。取8.0mL约40nm的纳米金溶液和3653μL的去离子水混合置于25mL的圆底烧瓶中，预热至90℃并保持10min。然后，分别以1.2和2.4mL/h的速率将347μL，1.0mmol/L的六氯铂酸钠水溶液和4.0mL，4.0mmol/L的L-抗坏血酸水溶液注入到烧瓶中。两种溶液完全注入后，反应继续进行30min。最后，将所制备的铂修饰金纳米粒子冷却至室温，4℃避光保存备用。

功能化：首先，取30μL，100μmol/L的cDNA和30μL，100μmol/L的Apt，95℃热变性5min，然后在37℃孵育1h，形成稳定的cDNA-Apt杂交双链体。然后，将15μL，2mmol/L的三(2-羧乙基)膦TCEP与cDNA-apt杂交双链体混合，进行巯基化反应。然后加入到1mL浓缩的铂修饰金纳米粒子中，室温振荡孵育1h；接着将30μL，15mmol/L的三磷酸脱氧腺苷dATP加入到上述溶液中，室温振荡孵育35min；完成后再加入20μL，1mol/L的NaCl溶液(体系最终NaCl的浓度约为0.2M-0.5M)，先室温静置30min，再在4℃下保存12h以提高功能化纳米粒子的稳定性。最后，4℃，10000r/min离心10min去除多余的试剂，再重悬于1mL含5％蔗糖、5％BSA、0.5％Tween-20，0.5％Triton X-100的20mmol/L的Na₃PO₄缓冲液中。修饰好的功能化纳米粒子在4℃避光保存备用。

(2)金标垫和样品垫的预处理

将样品垫和金标垫剪切成合适的尺寸，再0.1mol/L Tris-HCl处理缓冲液(含1％NaCl，0.5％Tween-20，1％BSA，2％蔗糖和1％Triton X-100，pH 8.2)中浸泡30min，然后在45℃恒温干燥箱中烘干，保存备用；

在处理好的金标垫上滴加功能化的铂修饰金纳米粒子，即Au@PtNPs-cDNA-Apt偶联物。37℃恒温干燥箱中烘干，保存备用。

(3)硝酸纤维素膜的预处理

将链霉亲和素与生物素修饰的DNA1以1：4的摩尔比例混合均匀后4℃反应2h，使链霉亲和素与DNA1上修饰的生物素充分结合；DNA2与上述制备方法相似，其中DNA2代替了DNA1。取1uL制备好的SA-Bio-DNA1在硝酸纤维素膜上靠近金标垫一端划检测线T线。取1μL制备好的SA-Bio-DNA2在硝酸纤维素膜上靠近吸水垫一端划质控线C线。将划好T、C线的硝酸纤维素膜在37℃下烘干1h，保存备用。

(4)试纸条的组装

该试纸条由五个部分组成：样品垫，金标垫，硝酸纤维素膜，吸水垫和PVC底板。先将准备好的硝酸纤维素膜粘贴到PVC底板的对应位置上，轻轻按压使二者紧密结合，再将处理过的样品垫、金标垫，分别对应粘贴在PVC底板上，样品垫与金标垫，金标垫与硝酸纤维素膜分别重叠2mm，最后将吸水垫与硝酸纤维素膜重叠2mm粘贴到PVC底板上。各部分粘贴牢固后，组装好的检测试纸条在干燥条件下，4℃避光保存备用。

实施例2

用试纸条对妥布霉素标准溶液的测定

用0.5mL的离心管分别将妥布霉素稀释到不同的浓度，每管100μL。将按上述方法制备好的试纸条样品垫一端分别插入到不同浓度的妥布霉素标准溶液中，在室温下反应5min。

从图2低灵敏检测结果中可以看出，妥布霉素浓度在1～150nmol/L之间，T线颜色随妥布霉素浓度的增大而变深，当浓度为60nmol/L时肉眼明显可以观察到检测线条带，且浓度在150nmol/L以后检测线颜色基本不再发生变化。因而该试纸在低灵敏模式下对妥布霉素的肉眼检出限为60nmol/L。用胶体金定量仪扫描T、C线的显色情况，得到T线峰面积与妥布霉素浓度的变化关系曲线。在1～50nmol/L浓度范围内，T线显色强度与浓度存在线性关系，线性回归方程为y＝6.4368x+305.0566，R²＝0.9936，式中y为检测线峰面积，x为妥布霉素的浓度(nmol/L)。

显色完全后，对于高灵敏度模式，取额外的底物溶液(包含6μL TMB底物溶液，2μL，10mol/L H₂O₂，2μL 1.0mol/LNaAC/HAC，pH 4.0)滴加在检测线T线上，进行酶促底物反应5min后，如图3高灵敏检测结果所示，可以观察到在T线颜色变成更加敏感的深蓝色。在妥布霉素浓度0.1～10nmol/L之间，T线生成的蓝色随妥布霉素浓度的增大而变深，当浓度为5nmol/L时肉眼就可以明显观察到检测线的蓝色产生，且浓度在10nmol/L以后产生的蓝色强度基本不再发生变化。因而该试纸在高灵敏模式下对妥布霉素的肉眼检出限为5nmol/L。借助免费软件ImageJ对检测线的图像进行灰度测定，得到T线灰度比值与妥布霉素浓度的变化关系曲线。在0.1～4nmol/L浓度范围内，T线灰度比值与浓度存在线性关系，线性回归方程为y＝4.1739x-0.3948，R²＝0.9897，式中y为检测线灰度比值，x为妥布霉素的浓度(nmol/L)。

实施例3

牛奶样品中妥布霉素残留的检测

此处采用向牛奶中添加标准浓度妥布霉素制备人工污染牛奶的方式分别获得含0.5nmol/L、2.5nmol/L、20nmol/L、40nmol/L、100nmol/L、200nmol/L妥布霉素的牛奶样品。对于牛奶样品，用20％三氯乙酸将pH值调节到4.6，然后在45℃孵育10min，然后以10000r/min离心20min以除去凝结的蛋白质和脂肪。然后按上述高灵敏检测模式完整操作步骤来检测含不同浓度妥布霉素的牛奶样品。得到图4所示含不同浓度妥布霉素的牛奶样品的试纸条检测图。

在图4中可以看出随着妥布霉素浓度的增大，T线的颜色变深，当妥布霉素浓度达到40nmol/L后T线颜色基本不再变化，因此我们设定该试纸条高灵敏检测模式下对牛奶样品中妥布霉素的可视化检测限为20nmol/L。实验证明该检测方法可以检测到经过预处理后的牛奶样品中的妥布霉素。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 江南大学

<120> 基于适配体和铂修饰金纳米粒子的妥布霉素检测试纸

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaaaaagact agtgcctagt 20

<210> 2

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gactaggcac tagtc 15

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaaaaatcta ggcact 16

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

actaggcact agtctttttt 20

Claims

1.一种基于适配体和铂修饰金纳米粒子的妥布霉素检测试纸，其特征在于：包括Au@PtNPs-cDNA-Apt偶联物、检测线和质控线；所述Au@PtNPs-cDNA-Apt偶联物包括铂修饰金纳米粒子、cDNA和特异性识别妥布霉素的适配体Apt，其中，cDNA和适配体Apt部分互补形成cDNA-Apt杂交双链体；cDNA的5’端或3’端有巯基修饰，铂修饰金纳米粒子和cDNA-Apt杂交双链体通过Au-S共价键偶联；

所述检测线包括DNA1，DNA1与cDNA部分互补；所述质控线包括DNA2；DNA2与cDNA完全互补；

所述cDNA的核苷酸序列为5’-AAAAAAGACTAGTGCCTAGT-3’；

所述适配体Apt的序列为：5’-GACTAGGCACTAGTC-3’；

所述DNA1的序列为：5’-AAAAAATCTAGGCACT-3’；

所述DNA2的序列为：5’-ACTAGGCACTAGTCTTTTTT-3’。

2.根据权利要求1所述的妥布霉素检测试纸，其特征在于：所述cDNA的5’端或3’端修饰-(CH₂)₆-SH。

3.根据权利要求1所述的妥布霉素检测试纸，其特征在于：所述Au@PtNPs-cDNA-Apt偶联物由以下步骤制备得到：

(1)合成粒径为13-15nm的金纳米粒子；

(2)以步骤(1)的金纳米粒子为种子，得到粒径为38-41nm的纳米金；

(3)以步骤(2)的纳米金为核，合成核壳结构的铂修饰金纳米粒子Au@PtNPs；

(4)cDNA和适配体Apt热变性，形成cDNA-Apt杂交双链体，与硫醇类还原剂进行巯基化反应，然后加入到步骤(3)的铂修饰金纳米粒子Au@PtNPs中，振荡孵育，再加入dATP振荡孵育，得到所述Au@PtNPs-cDNA-Apt偶联物。

4.根据权利要求3所述的妥布霉素检测试纸，其特征在于：在步骤(4)中，加入dATP振荡孵育后还包括稳定的步骤，具体为：加入NaCl溶液，先20-25℃静置，再在3-5℃下保存。

5.根据权利要求3所述的妥布霉素检测试纸，其特征在于：在步骤(4)中，所述硫醇类还原剂包括三(2-羧乙基)膦。

6.一种使用权利要求1-5任一项所述的妥布霉素检测试纸检测妥布霉素的方法，包括低灵敏模式和高灵敏模式，其特征在于，具体包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：低灵敏模式下对检测线进行光密度测定，或高灵敏模式下对检测线进行灰度测定，计算出待测溶液中妥布霉素的含量。