CN113804887B - 一种具有多检测尺度的免疫检测试剂盒的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有多检测尺度的免疫检测试剂盒及其应用。它包括层析试纸条和二氧化锰纳米材料标记的识别待检测物的单克隆抗体反应试剂，其中：所述的层析试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫上分别喷涂横向质控线和检测线，所述质控线上包被有可与识别待检测物的单克隆抗体结合的多克隆抗体；所述检测线上包被有待检测物抗原。该免疫检测试剂盒用于检测，能呈现多级检测范围，成本低廉、操作方便，快速灵敏。

Description

一种具有多检测尺度的免疫检测试剂盒的应用
技术领域
本发明属生物检测领域，具体涉及一种具有多检测尺度的免疫检测试剂盒及其应用。
背景技术
真菌毒素是一类由菌侵染农产品及食品产生的有毒次生代谢产物，真菌毒素中黄曲霉毒素B1具有强致癌、致畸、致突变等作用，极大危害人类健康。现有的黄曲霉毒素B1检测技术有薄层色谱法、微柱筛选法、免疫亲和-高效液相色谱法、免疫亲和-液相色谱-串联质谱法、免疫亲和-荧光光度法、酶联免疫吸附法和免疫层析法等。免疫层析法比酶联免疫吸附法所需时间更短，操作步骤更少，对操作人员的专业要求更低，因此，在真菌毒素等微量残留物的定性定量、快速检测上已经得到了广泛应用。目前，市面上已经有许多针对黄曲霉毒素B1的免疫层析快速检测产品，但是相关产品均只有一种检测范围，一旦超出检测范围的产品就需要稀释或富集以适应检测范围再重新检测，且灵敏度不高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有多检测尺度的免疫检测试剂盒，其制备方法以及用途。
为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种具有多检测尺度的免疫检测试剂盒，它包括层析试纸条和二氧化锰纳米材料标记的识别待检测物的单克隆抗体反应试剂，其中：所述的层析试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫上分别喷涂横向质控线和检测线，所述质控线上包被有可与识别待检测物的单克隆抗体结合的多克隆抗体；所述检测线上包被有待检测物抗原。
按上述方案，所述吸水垫为吸水纸，检测垫为硝酸纤维素膜。
按上述方案，所述的吸水垫长40-45mm，宽3-5mm；检测垫长22-28mm，宽3-5mm；样品垫长10-15mm，宽3-5mm，相邻各垫的交叠长度为1-3mm；所述检测垫上的检测线与样品垫上沿的间距为4-6mm，质控线和检测线的间距为6-10mm。
按上述方案，所述的待检测物为真菌毒素小分子化合物，具体可为黄曲霉毒素B1,识别待检测物的单克隆抗体为黄曲霉毒素B1的单克隆抗体，具体可采用保藏编号为CCTCCNO.C201013的杂交瘤细胞株1C11分泌产生的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体，所述的待检测物抗原为黄曲霉毒素B1抗原，具体为黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)。
按上述方案，所述的识别待检测物的单克隆抗体为鼠源单克隆抗体，可与识别待检测物的单克隆抗体结合的多克隆抗体为兔抗鼠多克隆抗体。
按上述方案，所述的免疫检测试剂盒还包括二次检测试剂，所述的二次检测试剂为TMB溶液。二次检测试剂滴加到检测线上，进行第二次读取结果。
按上述方案，TMB溶液的pH为3-6。
按上述方案，TMB溶液的浓度5-20mmol/L，将TMB分散在pH为3-6的酸性缓冲溶液中得到。
按上述方案，所述3-6的酸性缓冲溶液包括但不限于pH＝4.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液。
如上所述的层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
(1)吸水垫的制备：
将吸水纸剪裁即得吸水垫；
(2)检测垫的制备：
硝酸纤维素膜粘贴到纸板相应位置再分别喷涂检测线和质控线得到，检测垫用硝酸纤维素膜的种类：可选用美国公司Bedford Millipore Corporation生产的CN95膜或日本公司ToyoRoshiKaisha生产的IAB120或IAB135膜，优选CN95膜。
检测线的包被：
将待检测物抗原配成包被液，可用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)配制成浓度为0.5mg/mL的包被液；于距样品垫上沿4-6mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上得到检测线，每毫米检测线上所需抗原的包被量为12-60ng，优选30ng，然后于37℃条件下干燥，干燥时间可为2h；
质控线的包被：
将多克隆抗体配成包被液，可用含0.02％(m/v)叠氮化钠的0.01mol/L的PBS溶液配制成浓度为0.2mg/mL的包被液；于距检测线6-10mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到质控线，每毫米质控线上所需兔抗鼠多克隆抗体的包被量为6-30ng，优选12ng，然后于37℃条件下干燥，干燥时间可为2h；
(3)样品垫的制备
将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37℃条件下干燥2-4h，得样品垫，然后置干燥器中室温保存。
(4)试纸条的组装
在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1-3mm，即得层析试纸条。
按上述方案，0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)为每1L中含有氯化钠8g，氯化钾0.2g，十二水磷酸氢二钠2.9g，磷酸二氢钾0.24g，盐酸调节pH值为7.4。
按上述方案，含0.02％(m/v)叠氮化钠的0.01mol/L的PBS溶液为每100mL0.01mol/L的PBS溶液中含有叠氮化钠0.02g。
按上述方案，所述样品垫的制备中使用的封闭液为每100mL0.01mol/L的PBS溶液中含有牛血清白蛋白2g，蔗糖2.5g，叠氮化钠0.02g。
按上述方案，所述的二氧化锰纳米材料标记的识别待检测物的单克隆抗体反应试剂由二氧化锰纳米片或纳米颗粒与抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体经过静电力吸附后封闭制得，制备方法：将二氧化锰纳米材料和识别待检测物的单克隆抗体的溶液混合振摇，使二氧化锰纳米材料和识别待检测物的单克隆抗体充分结合，然后封闭多余活性位点，后处理，得到二氧化锰纳米材料标记的识别待检测物的单克隆抗体反应试剂。
按上述方案，上述混合振摇时间1-3h，静置1-4h。
按上述方案，以牛血清蛋白封闭多余活性位点，离心弃去上清液，将离心的沉淀用含叠氮化钠的磷酸盐缓冲液复溶备用。具体可加入牛血清白蛋白水溶液封闭多余活性位点，所述牛血清白蛋白水溶液为牛血清白蛋白溶解于超纯水中，浓度为50-100mg/mL。
按上述方案，所述二氧化锰纳米材料配制成溶液使用，浓度为0.1-2.0mg/mL。
按上述方案，所述二氧化锰纳米材料为二氧化锰纳米片或二氧化锰纳米颗粒，优选地，二氧化锰纳米片的尺寸为20-100nm，二氧化锰纳米颗粒的尺寸为2-10nm。
按上述方案，二氧化锰纳米片水溶液可采用如下方法制备得到：一定量KMnO4加入2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)溶液中，振荡混匀3min，超声处理30min，室温10000rpm离心10min，然后将沉淀用超纯水洗涤至上清溶液无色透明，用超纯水稀释3倍定容，即得；其中，KMnO4和2-(N-吗啉)乙磺酸摩尔比为10:1，2-(N-吗啉)乙磺酸在反应溶液中的浓度为0.01mol/L。
按上述方案，二氧化锰纳米颗粒水溶液可采用如下方法制备得到，在0.5％(m/v)的BSA水溶液中加入一定质量的高锰酸钾，使得高锰酸钾在反应终体积中的浓度为0.001mol/L，室温下搅拌，直到溶液最终变成棕色，然后将获得的溶液在4℃下13000rpm离心20min，收集上清液，纯水透析48小时，即得。
按上述方案，所述识别待检测物的单克隆抗体配制成水溶液使用，浓度为0.1-1.0mg/mL。具体可将识别待检测物的单克隆抗体用0.01mol/L PBS配制得到水溶液。
按上述方案，识别待检测物的单克隆抗体在标记体系中的终浓度为12-120μg/mL，优选24μg/mL，牛血清白蛋白在标记体系中的终浓度不低于5mg/mL。
按上述方案，二氧化锰纳米材料：识别待检测物的单克隆抗体的质量比为380:12-120。
按上述方案，样品垫用玻璃纤维素膜选择中国公司Jieyi BiotechnologyCorporation生产的Fusion3或Fusion5，优选Fusion5。
如上所述的具有多检测尺度的免疫检测试剂盒的应用，应用方法如下：
提供待测样品溶液，提供二氧化锰纳米材料标记的识别待检测物的单克隆抗体溶液，将待测样品溶液加到二氧化锰纳米材料标记的识别待检测物的单克隆抗体溶液中，孵育一段时间；
将免疫层析试纸条的样品垫插入到前述混合溶液中，同时提供阴性对照，一段时间后进行第一次读取结果，进行结果分析。
按上述方案，37±2℃孵育7-15min后第一次读取结果。
按上述方案，上述应用方法包括第一次读取结果结束后，滴加二次检测试剂于检测线上，静置，第二次读取结果，进行结果分析。
按上述方案，将待测样品加提取剂处理，进行待检测物的提取，制备待测样品溶液。如对于待检测物黄曲霉毒素B1，用60-80％的甲醇水溶液超声提取，制备待测样品溶液；用提取剂如等体积的甲醇水溶液替代样品溶液作阴性对照。
按上述方案，所述的待测样品为玉米、大米或花生的磨细样品。
按上述方案，上述孵育过程为：二氧化锰纳米材料标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体反应试剂缓释液稀释定容，加到酶标孔中，取待测样品溶液加入到含检测液的酶标孔进行孵育。
按上述方案，上述缓释液为：每1mL缓释液中含50μL吐温-20，1mg蔗糖，5mgBSA，550μL0.01mol/L的磷酸盐缓冲液和400μL超纯水。
按上述方案，所述的结果分析为：
第一次读取结果即试纸条没有进行信号二次放大之前：(1)当检测试纸条的质控线显示出棕色线条，而检测线不显色时，表明待测样品溶液中待检测物的含量高于没有进行信号二次放大前的消线值；
(2)质控线显示出棕色线条，而检测线棕色颜色比对照试纸条检测线颜色浅时，表明待测样品中的黄曲霉毒素B1的含量介于没有进行信号二次放大前的可视检出限和消线值之间；
(3)当检测试纸条的质控线显示出棕色线条，并且检测线棕色颜色与对照试纸条检测线颜色接近时，表明待测样品溶液中的待检测物的含量低于没有进行信号二次放大前的可视检出限；
(4)无效：当质控线不显色时，无论检测试纸条的检测线显示或不显示棕色时，该试纸条判为无效；
当加入二次检测试剂进行二次读取结果，即试纸条放大信号之后：
对于一次读取结果中的结果(1)：当检测试纸条的质控线显示出棕色线条，检测线不显色，检测试纸条的检测线在滴加TMB后仍不显色时，表明待测样品溶液中的待检测物的含量高于信号二次放大的消线值；或者质控线显示出棕色线条，而在检测线上滴加TMB后产生蓝色且比对照试纸条检测线颜色浅时，表明待测样品中的黄曲霉毒素B1的含量高于或等于待检测物的含量高于没有进行信号二次放大前的消线值并低于信号二次放大的消线值。
对于一次读取结果中的结果(3)：试纸条的质控线显示出棕色线条，并且检测线棕色颜色与对照试纸条检测线颜色接近时，然后在检测线上滴加TMB后，如产生蓝色且与对照试纸条检测线颜色接近时，表明待测样品溶液中的黄曲霉毒素B1的含量低于信号二次放大后的可视检出限，如产生蓝色，比对照试纸条颜色浅，表明待测样品溶液中的黄曲霉毒素B1的含量信号二次放大后的可视检出限和没有进行信号二次放大前的可视检出限。
以检测黄曲霉毒素B1含量为例，所述的结果分析为：
第一次读取结果即试纸条没有放大信号之前：(1)当检测试纸条的质控线显示出棕色线条，而检测线不显色时，表明待测样品溶液中黄曲霉毒素B1的含量高于2.5ng/mL；
(2)质控线显示出棕色线条，而检测线棕色颜色比对照试纸条检测线颜色浅时，表明待测样品中的黄曲霉毒素B1的含量高于或等于0.2ng/mL并低于2.5ng/mL。
(3)当检测试纸条的质控线显示出棕色线条，并且检测线棕色颜色与对照试纸条检测线颜色接近时，表明待测样品溶液中的黄曲霉毒素B1的含量低于0.2ng/mL；
(4)无效：当质控线不显色时，无论检测试纸条的检测线显示或不显示棕色时，该试纸条判为无效；
当加入二次检测试剂进行二次读取结果，即试纸条信号二次放大之后：
对于一次读取结果中的结果(1)：当检测试纸条的质控线显示出棕色线条，检测线不显色，检测试纸条的检测线在滴加TMB后仍不显色时，表明待测样品溶液中的黄曲霉毒素B1的含量高于150ng/mL；或者质控线显示出棕色线条，而在检测线上滴加TMB后产生蓝色且比对照试纸条检测线颜色浅时，表明待测样品中的黄曲霉毒素B1的含量高于或等于2.5ng/mL并低于150ng/mL。
对于一次读取结果中的结果(3)：试纸条的质控线显示出棕色线条，并且检测线棕色颜色与对照试纸条检测线颜色接近时，然后在检测线上滴加TMB后，如产生蓝色且与对照试纸条检测线颜色接近时，表明待测样品溶液中的黄曲霉毒素B1的含量低于0.05ng/mL，如产生蓝色，比对照试纸条颜色浅，表明待测样品溶液中的黄曲霉毒素B1的含量0.05-0.2ng/mL。
进一步地，上述方法还包括，将待测样品溶液的结果经换算得到待测样品结果。
以待检测物为黄曲霉毒素B1为例，具体检测方法为：称取待测样品，加入体积浓度为70％的甲醇水溶液，超声提取20min，室温离心取上层清液，0.22μm滤膜过滤得到待测样品溶液；取二氧化锰纳米材料标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体反应试剂20-80μL，优选40μL，加入到酶标孔中，用缓释液定容，优选150μL，轻轻混匀；取待测样品溶液100μL加入到含二氧化锰纳米材料标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体反应试剂的酶标孔中，37℃孵育10min，然后将免疫层析试纸条的样品垫插入到酶标孔中，同时取100μL相同体积浓度的甲醇水替代样品溶液作为阴性对照液，加入另一含二氧化锰纳米材料标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体反应试剂的酶标孔内，同步也加入另一免疫层析试纸条的样品垫，其作为对照试纸条，一段时间后读取结果。
以待检测物为黄曲霉毒素B1为例，该具有多检测尺度的免疫检测试剂盒的工作原理：首先将二氧化锰纳米材料标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体溶液和缓释液混合，然后加入待检测样品提取液，当样品中含有黄曲霉毒素B1时，黄曲霉毒素B1和检测液中二氧化锰纳米材料标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体先结合，然后将免疫层析试纸条的样品垫插入到上述体系中，溶液通过毛细作用沿样品垫向吸水垫方向移动，二氧化锰纳米材料标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体与黄曲霉毒素B1的复合物和反应剩余的二氧化锰纳米材料标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体一同向上泳动，其到达固定着抗原的检测线时，抗原将和反应剩余的二氧化锰纳米材料标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体结合，样品中黄曲霉毒素B1含量越高，检测线上的抗原能够结合的二氧化锰纳米材料标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体将越少，形成的显色带颜色越浅。当抗原所结合的二氧化锰纳米材料标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体复合物少于一定数量时，检测线处将不会有色带出现。当加入二次检测试剂TMB溶液后，无色的色带可能会出现蓝色条带，形成一个试纸条具有棕色和蓝色两种色差梯度，从而形成多个检测范围。
无论样品中是否含有黄曲霉毒素B1，未被检测线上抗原截获的二氧化锰纳米材料标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体或二氧化锰纳米材料标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体与黄曲霉毒素B1的复合物将继续移动到质控线并与质控线上的兔抗鼠多克隆抗体结合而富集显色，因此，试纸条的质控线一定会有色带。检测结果情况如下：1、只出现一条棕色质控线，检测线经过TMB催化二次检测后也不显色(＞150ng/mL)；2、在经过TMB催化显色前，只出现一条棕色质控线，经过TMB催化二次检测后，出现一条棕色质控线和一条较浅的蓝色检测线(2.5-150ng/mL)；3、在经过TMB催化显色前，出现一条棕色质控线和一条较浅的棕色检测线(0.2-2.5ng/mL)；4、在经过TMB催化显色前，出现一条棕色质控线和一条与对照一样的棕色检测线，经过TMB催化后，出现一条棕色质控线和一条较浅的蓝色检测线(0.05-0.2ng/mL)；5、在经过TMB催化显色前，出现一条棕色质控线和一条与对照一样的棕色检测线，经过TMB催化后，出现一条棕色质控线和一条与对照一样的蓝色检测线(低于0.05ng/mL)。
而质控线没有色带出现则表明试纸条失效。
本发明利用二氧化锰纳米材料对TMB的氧化酶催化活性和催化显色功能，以及其自身聚集呈棕色的特性，巧妙将二氧化锰纳米材料与待检测物的单克隆抗体结合，形成反应试剂，再构建免疫层析试纸条，进一步配合TMB溶液二次检测试剂的使用，获得了多检测尺度的免疫试剂盒，可实现快速定性检测，提高检测灵敏度和检测范围。
本发明的有益效果在于：
(1)检测成本低廉，标记材料来源丰富。本发明提供的具有多检测尺度的免疫检测试剂盒，采用二氧化锰纳米材料做标记和信号放大材料，比纳米金成本低廉，制备简单，实际应用价值大。
(2)检测范围广，多级显色，呈现梯度的多级检测范围。本发明提供的具有多检测尺度的免疫检测试剂盒，可以通过二氧化锰纳米材料催化TMB显蓝色，和二氧化锰自身聚集呈棕色，提供两种检出限，多个梯度检测范围。
(3)检测灵敏度高。本发明提供的具有多检测尺度的免疫检测试剂盒可用于待检测物的多级定性测定，进一步提高肉眼检测灵敏度，以黄曲霉毒素B1为例，检测灵敏度通过催化反应将信号放大到肉眼可达0.05ng/mL。
附图说明
图1为1#检测试纸条的结果判定图，左边：阴性对照组，右边：试验组。
图2为2#检测试纸条的结果判定图，左边：阴性对照组，右边：试验组。
图3为3#检测试纸条的结果判定图，左边：未加TMB显色液，右边：加TMB显色液。
图4为4#检测试纸条的结果判定图，左边：未加TMB显色液，右边：加TMB显色液。
图5为本发明的具有多检测尺度的黄曲霉毒素B1免疫检测试剂盒中免疫层析试纸条的示意图。
图中：1样品垫；2硝酸纤维膜；3吸水垫；4背衬板。
具体实施方式
实施例1
一种具有多检测尺度的黄曲霉毒素B1免疫检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1.层析试纸条的制备：
(1)吸水垫的制备
将吸水纸剪裁成长45mm宽3mm的规格，即得吸水垫；
(2)检测垫的制备
将规格长25mm，宽3mm的CN95硝酸纤维素膜粘贴到纸板相应位置再分别喷涂检测线和质控线。
检测线的包被：
称量氯化钠8g，氯化钾0.2g，十二水磷酸氢二钠2.9g，磷酸二氢钾0.24g，加800mL水溶解后，用盐酸调节pH值到7.4，再用超纯水定容到1L，0.22μm滤膜过滤，配成0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)。
称取黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白的偶联物(AFB1-BSA)1.0mg，用2mL0.01mol/L的磷酸缓冲液(PBS)配制成浓度为0.5mg/mL的包被液；于距样品垫上沿5mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上得到检测线，每毫米检测线上喷AFB1-BSA 30ng，然后于37℃条件下干燥2h；
质控线的包被：
称取叠氮化钠0.02g溶于100mL0.01mol/L的磷酸缓冲液(PBS)中，0.22μm滤膜过滤，配成含0.02％(m/v)叠氮化钠的0.01mol/L的PBS溶液。
称取兔抗鼠多克隆抗体1mg，溶于5mL含0.02％(m/v)叠氮化钠的0.01mol/L的PBS溶液配制成浓度为0.2mg/mL的包被液；于距检测线7mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到质控线，每毫米质控线上喷涂兔抗鼠多克隆抗体12ng，然后于37℃条件下干燥2h；
(3)样品垫的制备
称量牛清白蛋白(BSA)2g，蔗糖2.5g，叠氮化钠0.02g溶于100mL0.01mol/LPBS溶液，0.22μm滤膜过滤，配成封闭液。
将Fusion5玻璃纤维膜剪裁成长12mm宽3mm的规格,放入封闭液中浸湿，取出，于37℃条件下干燥4小时，得样品垫。
(4)试纸条的组装
在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为2mm，即得层析试纸条，如图5所示；
2.二氧化锰纳米材料标记的抗黄曲霉毒素B1的单克隆抗体反应试剂的制备：
(1)二氧化锰纳米片溶液的制备
称量2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)195.2mg，100mL超纯水定容，配制成0.01mol/LMES缓冲液；精确称取0.158g KMnO4加入10mL 0.01mol/LMES缓冲液中，振荡混匀3min，超声处理30min，室温离心10000rpm 10min，然后将沉淀用超纯水洗涤至上清溶液无色透明，加30mL超纯水定容，制得的二氧化锰纳米片溶液浓度为1.0mg/mL，纳米片的片层大小为20-100nm，溶液放置4℃冰箱备用。
(2)二氧化锰纳米颗粒溶液的制备
称取100mg BSA溶解20mL超纯水,然后加入3.16mg高锰酸钾溶解于上述溶液中，室温下搅拌，直到溶液最终变成棕色，然后将获得的溶液4℃下13000rpm离心20min取上清液，超纯水透析48小时，二氧化锰纳米颗粒溶液浓度约1mg/mL，4℃下保存备用。
(3)二氧化锰纳米材料标记的抗黄曲霉毒素B1的单克隆抗体反应试剂的制备：
取0.2mg抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体(中国专利CN 201310115849.9公开的保藏编号为CCTCC NO.C201015的杂交瘤细胞株AFB3G1分泌的单克隆抗体)用1mL 0.01mol/L PBS配制成抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体水溶液。
称取0.05g牛血清白蛋白溶解于1mL超纯水中，0.22μm滤膜过滤，得BSA水溶液。
取380μL 1.0mg/mL二氧化锰纳米溶液溶解在400μL 0.01mol/L的磷酸缓冲液(PBS)中，冰浴超声30min，进行分散均匀，然后逐滴加入120μL抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体水溶液，缓慢振摇2h，4℃静置2h；然后再加入100μL的BSA水溶液，缓慢振摇2h，4℃静置2h，以封闭多余活性位点；最后，4℃10000rpm离心20min，弃去上清液，保留沉淀，然后用4mL含0.02％(m/v)叠氮化钠的0.01mol/L的PBS溶液进行复溶，即得，置4℃冰箱冷藏备用。
实施例2一种具有多检测尺度的黄曲霉毒素B1免疫检测试剂盒的应用，方法如下：
称量5gBSA，溶于100mL水中，配成5％(m/v)BSA。
称量1g蔗糖，溶于100mL水中，配成1％(m/v)蔗糖溶液。
取20mLTween-20，用水定容到100mL，混匀，配成20％(v/v)Tween-20溶液。
取6.6mL 0.01mol/L PBS溶液，3mL 20％(v/v)Tween-20,1.2mL 1％(m/v)蔗糖溶液和1.2mL 5％(m/v)BSA溶液，混匀，过0.22μm滤膜过滤，配成缓释液。
称取96.2mgTMB，然后用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液进行定容到10mL，配成TMB溶液，然后加10mL 10mmol/L pH＝4.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液体系，形成20mmol/LTMB显色液。
分别称取1#、2#、3#与4#玉米待测样品各5g，加入20mL体积浓度为70％(v/v)的甲醇水溶液，混匀，涡旋提取10s，然后超声20min，在室温4000rpm离心10min，取上层清液，0.22μm滤膜过滤，取3ml氮吹到1ml，再过0.22μm滤膜，得到待测样品溶液；以二氧化锰纳米片为例，取二氧化锰纳米材料标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体反应试剂40μL，加入到含缓释液110μL的酶标孔中，轻轻混匀；取制备好的待测样品溶液100μL加入到含二氧化锰纳米材料标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体反应试剂的酶标孔中，37℃孵育10min，然后将免疫层析试纸条的样品垫插入到酶标孔中，同时取100μL相同体积的10％甲醇水，加入到含40μL二氧化锰纳米材料标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体反应试剂和110μL缓释液的混匀后的检测液中，同步加入另一免疫层析试纸条的样品垫，作为对照试纸条，9min后读取结果，然后直接滴加2μL TMB显色液于检测线上，静置30s后，检测线的颜色可从浅棕色或无色变为蓝色，再次读取结果。
检测结果：1#检测试纸条的质控线显示出棕色线条，而检测线显棕色且与阴性对照组的颜色相接近，如图1，则说明1#待测样品溶液中的黄曲霉毒素B1含量低于0.2ng/mL(0.667ng/g)。经液相色谱质谱(LC-MS/MS)检测，1#待测样品中黄曲霉毒素B1的含量0.041ng/g，与试纸条检测结果一致。
2#检测试纸条的质控线显示出棕色线条，而检测线显棕色且比阴性对照组的颜色浅，如图2，则说明2#待测样品溶液中的黄曲霉毒素B1含量高于0.2ng/mL(0.667ng/g)，但不高于2.5ng/mL(8.333ng/g)。经液相色谱质谱(LC-MS/MS)检测，2#待测样品中黄曲霉毒素B1的含量0.73ng/g。
3#检测试纸条的质控线显示出棕色线条，而检测线无色，但在检测线上滴加TMB显色液，检测线变蓝，如图3，则说明3#待测样品溶液中的黄曲霉毒素B1含量高于2.5ng/mL(8.333ng/g)，但是小于150ng/mL(500ng/g)。经液相色谱质谱(LC-MS/MS)检测，3#待测样品中黄曲霉毒素B1的含量9.27ng/g。
4#检测试纸条的质控线显示出棕色线条，而检测线无色，但在检测线上滴加TMB显色液，检测线仍然无色，如图4，则说明4#待测样品溶液中的黄曲霉毒素B1含量高于150ng/mL(500ng/g)。经液相色谱质谱(LC-MS/MS)检测，4#待测样品中黄曲霉毒素B1的含量6μg/g。

Claims (6)

1.一种黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于：步骤如下：
提供待测样品溶液，提供二氧化锰纳米材料标记的识别黄曲霉毒素B1的单克隆抗体溶液，所述二氧化锰纳米材料为二氧化锰纳米片，将待测样品溶液加到二氧化锰纳米材料标记的识别黄曲霉毒素B1的单克隆抗体溶液中，孵育一段时间，二氧化锰纳米材料标记的识别黄曲霉毒素B1的单克隆抗体中二氧化锰纳米材料：识别黄曲霉毒素B1的单克隆抗体的质量比为380:12-120；
将免疫层析试纸条的样品垫插入到前述混合溶液中，同时提供阴性对照，一段时间后进行第一次读取结果，然后加入二次检测试剂进行二次读取结果，所述的二次检测试剂为TMB溶液，pH为3-6，进行结果分析，其中：所述的层析试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫上分别喷涂横向质控线和检测线，所述质控线上包被有可与识别黄曲霉毒素B1的单克隆抗体结合的多克隆抗体，每毫米质控线上所需多克隆抗体的包被量为6-30ng；所述检测线上包被有黄曲霉毒素B1抗原，每毫米检测线上所需抗原的包被量为12-60ng，
所述的结果分析为：（1）只出现一条棕色质控线，检测线经过TMB催化二次检测后也不显色，表明待测样品溶液中黄曲霉毒素B1的含量＞150 ng/mL；（2）在经过TMB催化显色前，只出现一条棕色质控线，经过TMB催化二次检测后，出现一条棕色质控线和一条较浅的蓝色检测线，表明待测样品溶液中黄曲霉毒素B1的含量为2.5-150 ng/mL；（3）在经过TMB催化显色前，出现一条棕色质控线和一条较浅的棕色检测线，表明待测样品溶液中黄曲霉毒素B1的含量为0.2-2.5 ng/mL；（4）在经过TMB催化显色前，出现一条棕色质控线和一条与对照一样的棕色检测线，经过TMB催化后，出现一条棕色质控线和一条较浅的蓝色检测线，表明表明待测样品溶液中黄曲霉毒素B1的含量为0.05-0.2 ng/mL；（5）在经过TMB催化显色前，出现一条棕色质控线和一条与对照一样的棕色检测线，经过TMB催化后，出现一条棕色质控线和一条与对照一样的蓝色检测线，表明待测样品溶液中黄曲霉毒素B1的含量低于0.05 ng/mL。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述的待测样品为玉米、大米或花生的磨细样品；
将待测样品加提取剂处理，进行黄曲霉毒素B1的提取，制备待测样品溶液。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述吸水垫为吸水纸，检测垫为硝酸纤维素膜，所述的吸水垫长40-45mm，宽3-5mm；检测垫长22-28mm，宽3-5mm；样品垫长10-15mm，宽3-5mm，相邻各垫的交叠长度为1-3mm；所述检测垫上的检测线与样品垫上沿的间距为4-6mm，质控线和检测线的间距为6-10mm。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述的识别黄曲霉毒素B1的单克隆抗体为鼠源单克隆抗体；可与识别黄曲霉毒素B1的单克隆抗体结合的多克隆抗体为兔抗鼠多克隆抗体。
5. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：TMB溶液浓度5-20 mmol/L，将TMB分散在pH=4.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述二氧化锰纳米材料标记的识别黄曲霉毒素B1的单克隆抗体反应试剂由二氧化锰纳米片与识别黄曲霉毒素B1的单克隆抗体经过静电力吸附后封闭制得，制备方法：将二氧化锰纳米材料和识别黄曲霉毒素B1的单克隆抗体的溶液混合振摇，使二氧化锰纳米材料和识别黄曲霉毒素B1的单克隆抗体充分结合，然后封闭多余活性位点，后处理，得到二氧化锰纳米材料标记的识别黄曲霉毒素B1的单克隆抗体反应试剂。
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