WO2007061098A1

WO2007061098A1 - 分析方法及び分析装置

Info

Publication number: WO2007061098A1
Application number: PCT/JP2006/323617
Authority: WO
Inventors: Eiichi Tamiya; Naoki Nagatani; Teruko Yui; Tatsurou Endou; Ryou Tanaka
Original assignee: Japan Science And Technology Agency; Japan Advanced Institute Of Science And Technology; Bio Device Techologies Co. Ltd.
Priority date: 2005-11-25
Filing date: 2006-11-27
Publication date: 2007-05-31
Also published as: JPWO2007061098A1; EP1962093A4; EP1962093A1; EP1962093B1; US20090047746A1; JP4993749B2; US8110406B2

Abstract

【課題】　検出感度の低下を招くことなく例えば捕捉抗体等の使用量の低減を図るとともに、標識抗体の集積量が少量であっても判定部において強い発色又は発光を得ることを可能とし、サンドイッチ法においては検出限界を下げ、競合法においてはダイナミックレンジの拡大を図る。【解決手段】　被検物質、被検物質に特異的に結合する捕捉抗体、被検物質に特異的に結合する捕捉抗原から選ばれる１種を固定化した判定部を有する支持体と、被検物質に特異的に結合する標識抗体とを用いた免疫分析法による被検物質の分析法であって、前記支持体の前記判定部に増感作用を有する標識物質を固定化しておく。

Description

明細書

分析方法及び分析装置

技術分野

[0001] 本発明は、免疫分析法による被検物質の分析方法及び分析装置に関する。

背景技術

[0002] 従来から、試料中の被検物質を微量検出する方法として免疫分析法が知られている。中でも ELIS A (enzyme- linked immunosorbent assay)法は、高感度検出が可能であることから広く普及している力 ELISA法は操作時間や反応時間に長時間を要し、また、測定操作が煩雑等の問題がある。

[0003] そこで近年、 ELISA法に代わる免疫分析法として、抗体を固定化した支持体 (メンプレン)の一端に試験溶液を吸収させ、毛細管現象を利用して横方向に試験溶液を展開させていくィムノクロマトグラフィー法や、抗体を固定ィ匕した支持体の膜厚方向に試験溶液を通過させるフロースルー法を利用した分析法が注目されて、る。中でもィムノクロマトグラフィー法は、装置 (ストリップ）が小型で可搬性に優れ、 ELISA法に比ベて保存安定性、迅速測定、判定の容易さ、特別な付属装置が不要等の様々な点においても優れている。このため、ィムノクロマトグラフィー法は、例えばインフルェンザ検査、 HCV検査、妊娠検査、アレルギー検査、食中毒検査の診断薬の分野において汎用されている。

[0004] サンドイッチ法を利用したィムノクロマトグラフィー法は例えば以下のように行われる。先ず、被検物質の異なる部位を認識する 2種類の抗体とストリップ状のメンブレンとを用意し、一方の抗体 (捕捉抗体）はメンブレンのテストラインと呼ばれる領域に固定化しておき、他方の抗体は例えば金コロイド粒子を標識して金コロイド標識抗体とする。そして、試験溶液を金コロイド標識抗体と混合した後、ストリップの一端に吸収させ、展開する。試験溶液中に被検物質が含まれる場合、被検物質と金コロイド標識抗体とが反応して被検物質金コロイド標識抗体複合体が形成され、この複合体がテストライン上を通過する際に捕捉抗体に捕捉され、捕捉抗体ー被検物質金コロイド標識抗体複合体が形成される。その結果、テストラインにおいて、金コロイド標識抗体の赤色の発色が観察される。

[0005] 前述のィムノクロマトグラフィー法においては、金コロイド粒子に代えてアルカリフォスファターゼゃペルォキシダーゼ等の酵素で抗体を標識し、発色剤を後から展開する方法が広く知られており、例えば特許文献 1においては、ペルォキシダーゼを使用する酵素免疫測定において塩基の存在下に酵素免疫測定を行う方法が提案されている。また、特許文献 2においては、分析対象物と特異的に結合可能な抗体を固定化した抗体固定ィ匕部と、任意の色素を固定ィ匕した色素固定ィ匕部とが同一位置に存在するクロマトグラフィー分析装置が提案されて、る。

特許文献 1：特開 2001— 0074740号公報

特許文献 2：特開 2001— 004613号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] し力しながら、金コロイド標識抗体等を用いたィムノクロマトグラフィー法では、極めて低濃度の被検物質の検出が困難となることがある。試験溶液中の被検物質濃度が極めて低いと、テストラインに集積する金コロイド標識抗体量も少なくなるため、捕捉抗体が固定化された領域における金コロイド標識抗体由来のシグナル (発色)強度が例えば肉眼で認識可能なレベルに到達しないからである。

[0007] このため、ィムノクロマトグラフィー法の検出感度を高めることを目的とした研究が各方面で進められており、前記特許文献 1に記載されるように、検出用抗体を酵素標識し、酵素基質を展開して発色させる技術が前記改善策として実用化されている。しかしながら、この技術では検出のために発色剤を後から展開する必要があるため、分析が煩雑となる欠点がある。

[0008] また、テストラインには捕捉抗体等を固定ィ匕しておく必要があるが、抗体は高価であり、ィムノクロマトグラフィー用ストリップの部材コストを引き上げる要因の一つとなっている。したがって、ィムノクロマトグラフィー用ストリップの捕捉抗体の使用量の低減に対しては高、ニーズがあるものの、単に捕捉抗体の量を減らすと検出感度が低下するという不都合が生じる。

[0009] 一方、競合法による免疫分析法では、被検物質濃度が高くなるにつれて捕捉抗体等を固定ィ匕した領域における金コロイド標識抗体の集積量が減少するため、高濃度領域のダイナミックレンジの確保が難しいことが問題となる。

[0010] なお、特許文献 2において、色素と抗体とが混合された状態で固定化されたクロマトグラフィー分析装置が開示されているが、ここでの色素は抗体固定ィ匕部の位置を目視等により認識させ、組立作業時の判定部の位置ずれを防止する目的で用いられており、増感効果を得ることは想定外である。

[0011] そこで本発明は前述の実情に鑑みて提案されたものであり、検出感度の低下を招くことなく例えば捕捉抗体等の使用量の低減を図るとともに、標識抗体の集積量が少量であっても判定部にお!、て強、発色又は発光を得ることを可能とし、サンドイッチ法においては検出限界を下げることが可能であり、競合法においてはダイナミックレンジの拡大を図ることが可能な分析方法及び分析装置を提供することを目的とする。課題を解決するための手段

[0012] 前述の課題を解決するために、本発明に係る分析方法は、被検物質、被検物質に特異的に結合する捕捉抗体、被検物質に特異的に結合する捕捉抗原から選ばれる 1種を固定化した判定部を有する支持体と、被検物質に特異的に結合する標識抗体とを用いた免疫分析法による被検物質の分析法であって、前記支持体の前記判定部に増感作用を有する標識物質を固定ィ匕しておくことを特徴とする。

[0013] また、本発明に係る分析装置は、免疫分析法による被検物質の分析装置であって、被検物質、被検物質に特異的に結合する捕捉抗体、被検物質に特異的に結合する捕捉抗原から選ばれる 1種が固定化された判定部を有する支持体を含み、前記支持体の前記判定部に増感作用を有する標識物質が固定化されていることを特徴とする。

[0014] 例えば支持体に捕捉抗体を固定ィ匕したサンドイッチ法による従来の免疫分析法の場合、捕捉抗体が固定化された領域 (判定部）においては、捕捉抗体と被検物質と標識抗体とがサンドイッチ状の複合体を形成することで、標識抗体が判定部に集積する。そして、判定部に集積する標識抗体が一定量を超えた場合、発色又は発光を肉眼で認識可能又は機器で検出可能となり、被検物質の存在を知ることができる。ただし、被検物質が極めて低濃度である場合、標識抗体の集積も不十分となるため、発色又は発光が弱くなり、肉眼で認識できないことや、機器分析で検出できないことがある。

[0015] これに対し本発明においては、増感作用を有する標識物質が判定部に予め固定化されているため、判定部における発色又は発光は、判定部に集積した標識抗体由来の標識物質と予め固定化されていた増感作用を有する標識物質との和となる。すなわち、判定部における発色強度又は発光強度が底上げされる。したがって、発色強度又は発光強度を肉眼又は機器で検出可能なレベルに到達させるために必要な標識抗体 (標識物質)は、従来に比較して少量で済むので、より低濃度の被検物質の検出が実現される。例えば、支持体に捕捉抗体のみを固定ィ匕した従来の分析方法において標識抗体が 100個以上集積することでその発色が検知可能となる場合、例えば 80個の標識物質を捕捉抗体とともに支持体に固定ィ匕しておけば、標識抗体が 20個以上集積すれば目視により発色を検知できることになる。サンドイッチ法による免疫分析において、捕捉抗体に代えて捕捉抗原を支持体に固定ィ匕した場合においても同様の効果が得られる。このとき、酵素等の取扱いに注意を要する材料は不要であるため、分析操作の煩雑化は抑えられる。

[0016] また、サンドイッチ法の場合、前述したように感度が向上することから、所定の感度を実現するために必要な捕捉抗体量又は捕捉抗原量を従来より低減することができる。したがって、例えば捕捉抗体を判定部に固定ィ匕する場合には、コスト削減効果が得られる。

[0017] 一方、競合法による免疫分析法においては、被検物質が高濃度であるほど判定部に集積する標識抗体の集積量が減り、発色又は発光が弱くなる。本発明においては、増感作用を有する標識物質を被検物質とともに支持体に固定化しておくことで、発色強度又は発光強度の底上げを図り、発色又は発光が検知可能なレベルに到達するために必要な標識抗体 (標識物質)の量を減らしている。この結果、競合法においては、より高濃度領域の被検物質の検出が実現され、ダイナミックレンジの広い定量分析が実現される。

発明の効果

[0018] 本発明によれば、判定部への標識抗体の集積が不十分な場合であっても、充分に強い発色強度又は発光強度が得られ、目視ゃ機器等による検出が容易なものとなる。その結果、サンドイッチ法による免疫分析法の場合には高感度化を実現し、競合法による免疫分析法の場合にはダイナミックレンジの広い定量分析を実現することができる。さらには、検出感度の低下を招くことなく支持体に固定ィ匕する捕捉抗体等の量を低減することも可能であり、分析装置の低コスト化も実現することができる。

図面の簡単な説明

[図 1]本発明の分析方法の一例を示す要部概略斜視図である。

[図 2]従来の分析方法の一例を示す要部概略斜視図である。

[図 3]本発明の分析装置の一例であり、ィムノクロマトグラフィー用ストリップを示す概略斜視図である。

[図 4]メンブレンに対する金コロイド粒子 (40nm)の塗布量を検討した結果を示す写真である。

[図 5] (a)は本発明のィムノクロマトテストストリップ (実施例）を用いて hCGを検出した結果を示す写真であり、 (b)は従来のィムノクロマトテストストリップ (比較例）を用いて hCGを検出した結果を示す写真である。図中の数字は試験溶液中の hCG濃度を表す。図中の矢印は判定部を示す。

[図 6]ィムノクロマトテストストリップに固定ィ匕する金コロイド粒子の粒径を変化させ、リン酸緩衝液中の hCGを検出した結果を示す写真である。 (a)は従来のィムノクロマトテストストリップ (比較例）を用いた結果、（b)は粒径 15nmの金コロイド粒子を固定ィ匕した結果、（c)は粒径 40nmの金コロイド粒子を固定ィ匕した結果、（d)は粒径 60nm の金コロイド粒子を固定ィ匕した結果、（_e)は粒径 80nmの金コロイド粒子を固定ィ匕した結果である。図中の矢印は判定部を示す。

[図 7]ィムノクロマトテストストリップに固定ィ匕する金コロイド粒子の粒径を変化させ、男性の血清中の hCGを検出した結果を示す写真である。 (a)は従来のィムノクロマトテストストリップ (比較例）を用いた結果、（b)は粒径 15nmの金コロイド粒子を固定ィ匕した結果、（c)は粒径 40nmの金コロイド粒子を固定ィ匕した結果、（d)は粒径 60nmの金コロイド粒子を固定ィ匕した結果である。図中の矢印は判定部を示す。

[図 8]PSA検出用ィムノクロマトテストストリップを用いて PSA検出を行った結果を示す写真である。（_a)は 1^八濃度111₈71111、（b)は PSA濃度 0. IngZmlの検出結果である。図中、 Sは本発明のィムノクロマトテストストリップを、 Cは従来のィムノクロマトテストストリップを示す。図中の矢印は判定部を示す。

[図 9]実施例 3の検討結果を示す写真である。 (a)は従来のィムノクロマトテストストリツプ (比較例）を用いた結果、（b)は捕捉抗体量を (a)の 66%としたときの結果、（c)は捕捉抗体量を (a)の 50%としたときの結果、（c)は捕捉抗体量を (a)の 33%としたときの結果を示す。図中の矢印は判定部を示す。

[図 10]PSA濃度とィムノクロマトテストストリップの判定部における発色強度との関係を示す図であり、従来法と本発明を適用した方法とで比較した結果を示す図である。符号の説明

[0020] 1 被検物質、 2 捕捉抗体、 3 抗体、 4 支持体、 5 標識物質、 6 標識抗体、 7 標識物質、 11 ィムノクロマトグラフィー用ストリップ、 12 支持体、 13 コンジュゲートノッド、 14 吸収パッド、 15 判定部、 16 コントロール部、 21捕捉抗体、 22 標識物質、 23 標識抗体、 24 コントロール用抗体

発明を実施するための最良の形態

[0021] 以下、本発明を適用した分析方法及び分析装置について、図面を参照しながら詳細に説明する。

[0022] 本発明の分析方法は、被検物質、被検物質に特異的に結合する捕捉抗体、被検物質に特異的に結合する捕捉抗原から選ばれる 1種を固定化した判定部を有する支持体と、被検物質に特異的に結合する標識抗体とを用い、免疫分析法により試験溶液中の被検物質を分析するものであり、支持体の判定部に増感作用を有する標識物質を固定ィ匕しておく。

[0023] 以下では、本発明の分析方法として、支持体に捕捉抗体を固定ィ匕し、標識抗体と捕捉抗体とでサンドイッチ状に被検物質に対して結合することにより被検物質を定性分析又は定量分析するサンドイッチ法による免疫分析法を例に挙げ、図 1及び図 2を参照しながら説明する。なお、図 1〜図 3は、発明の理解を容易とするため、実際とは異なる寸法比率で描かれて、る。

[0024] サンドイッチ法による免疫分析法にぉ、ては、被検物質 (抗原） 1上の異なる部位をそれぞれ認識する 2種類の抗体 2, 3を用いる。 2種類の抗体のうち一方の抗体 (捕捉抗体) 2は、支持体 4に固定化する。捕捉抗体 2が固定化された領域が、判定部となる。他方の抗体 3は、支持体 4に固定化せず、標識物質 5で標識して標識抗体 6を形成する。本発明では、前記判定部に、増感作用を有する標識物質 7を予め固定化しておく。

[0025] 試験溶液中の被検物質 1を検出するには、例えば先ず、試験溶液と標識抗体 6を混合し、被検物質 1と標識抗体 6との複合体を形成させた後、支持体 4に供給する。ィムノクロマトグラフィー法を利用する場合には、支持体 4の一端に試験溶液 (混合液 )を吸収させ、毛細管現象を利用して横方向に試験溶液を展開させる。フロースルー法を利用する場合には、支持体 4の表面に試験溶液を滴下し、支持体 4の反対側の面へ試験溶液を通過させる。なお、試験溶液と標識抗体 6を含む溶液とをこの順に個別に支持体 4に供給してもよい。試験溶液中に被検物質 1が存在する場合、支持体 4に固定化された捕捉抗体 2と標識抗体 6とがサンドイッチ状に被検物質 1に対して結合し、結果として被検物質 1に応じた量の標識抗体 6が判定部に集積する。

[0026] 従来の方法の場合、図 2に示すように、被検物質濃度が極めて低い場合、判定部に集積する標識抗体 6の量も少ない。このため、標識抗体 6を構成する標識物質 5由来のシグナル (発色又は発光）強度が例えば目視で認識可能なレベルに到達しな、、又は機器分析の検出限界以下である場合には、被検物質 1を検出できないことがある。

[0027] これに対し本発明では、捕捉抗体 2と増感作用を有する標識物質 7とを判定部に共存させることで、判定部における発色強度又は発光強度が底上げされる。また、固定化した標識物質 7が存在することにより標識物質の間隔が密になる。このため、判定部への標識抗体 6の集積量が少量であっても判定部にお、て強、発色強度又は発光強度が得られ、高感度分析が実現される。

[0028] ここで、増感作用を有する標識物質とは、当該標識物質が固定化された判定部に標識抗体が捕捉されて集積したときに、判定部における発色又は発光を強める方向にシフトさせる効果を示す標識物質のことを！、う。

[0029] 増感作用を有する標識物質 7としては、発色物質又は発光物質を標識物質として用いることでき、迅速且つ簡便な検出が可能であるため、発色物質を用いることが好ましい。

[0030] 具体的な発色物質としては、金属微粒子、ラテックス微粒子、有機高分子微粒子、無機微粒子、発色剤を包含したリボソーム等の発色微粒子を用いることができる。金属微粒子としては、金微粒子、銀微粒子、白金微粒子等の貴金属微粒子、チタン微粒子、鉄微粒子、ニッケル微粒子等が例示される。金属微粒子は、粒径 Inn！〜 100 n_mのコロイド状の金属微粒子であってもよい。すなわち、金コロイド粒子、銀コロイド粒子、白金コロイド粒子等の貴金属コロイド粒子や、チタンコロイド粒子、鉄コロイド粒子、ニッケルコロイド粒子を用いてもよい。ラテックス微粒子としては、ポリスチレン、スチレンスチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、ァクリロ-トリル—ブタジエン—スチレン共重合体、塩ィ匕ビュル—アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビュルアクリル酸エステル共重合体等力選ばれる少なくとも 1種を含む微粒子が例示される。有機高分子微粒子としては、不溶性ァガロース、セルロース、不溶性デキストラン等カゝら選ばれる少なくとも 1種を含む微粒子が例示される。無機微粒子としては、シリカ、アルミナ等が例示される。これらの中でも、汎用性の高い貴金属コロイド粒子、ラテックス微粒子等を用いることが好ましぐ特に、明瞭な発色が得られるため金コロイド粒子を用いることが好まし、。

[0031] これら標識物質の表面に、ポリエチレングリコール、アルキルチオール、ピオチン、アビジン、核酸等を吸着させ、保護層を形成してもよい。例えば標識物質が金属コロイド粒子等の場合、その凝集が防止されるため、支持体に固定ィ匕したときにバックグラウンドとして認識されるおそれが小さくなる。

[0032] ところで、増感作用を有する標識物質 7が支持体 4の判定部に高濃度に固定化されていると、この標識物質 7由来の発色又は発光力バックグラウンドとなり、正確な検出が難しくなることがある。このため、判定部の発色又は発光を肉眼で認識することにより被検物質の検出や定量を行う場合、判定部における標識物質 7の固定化量を目視で認識不可能な量とすることが好ましい。判定部における標識物質の発色又は発光が目視で認識不可能であれば、固定化された標識物質由来の発色又は発光が検出時に妨げにならないので、正確な分析が実現される。 [0033] また、判定部の発色又は発光をデンシトメーター等の機器を用いて検出することにより被検物質の検出や定量を行う場合には、判定部における標識物質 7の固定ィ匕量は、当該機器の検出限界以下とされていることが好ましい。判定部における標識物質の発色又は発光が分析に使用する機器の検出限界以下であれば、固定化された標識物質 7由来の発色又は発光が検出時に妨げにならないので、正確な分析が実現される。

[0034] 増感作用を有する標識物質 7として金コロイド粒子を用いる場合、高精度かつ高感度な測定を行う観点から、金コロイド粒子の粒径は 10nm〜80nmであることが好ましい。前記範囲以外の金コロイド粒子を用いると、感度の向上効果が不十分となるおそれがある。また、粒径 15nm〜40nmの金コロイド粒子を用いることで、より高感度な検出が可能となる。

[0035] 増感作用を有する標識物質 7としては、標識抗体 6を構成する標識物質 5と同種材料を用いることができる。同種材料とした場合、増感作用を有する標識物質 7と標識抗体 6を構成する標識物質 5とからそれぞれほぼ同一のシグナルが発せられるため、増感効果を確実に得ることができる。また、増感作用を有する標識物質 7と標識抗体 6を構成する標識物質 5とを同種材料とすることは、材料の入手が容易である点にお V、ても好まヽ。固定化した標識物質 7と標識抗体 6を構成する標識物質 5とで同種材料を用いる場合、それぞれの寸法 (粒径）は同じでもよぐ異なっていてもよい。発色微粒子の互いに粒径を異ならせた場合には、発色波長の変化 (ピークシフト)あるいは発色波長強度の変化が観察されるが、本明細書においてはこのような場合、同種材料を用いたものとする。

[0036] また、増感作用を有する標識物質 7と、標識抗体 6を構成する標識物質 5とは、異種材料でもよい。この場合の組合せは、増感効果を得ることが可能であれば、任意に選択することができる。例えば銀微粒子金微粒子、金微粒子ラテックス粒子、金微粒子蛍光粒子、異種蛍光粒子、金コロイド粒子銀粒子包含リボソーム、タンパク質発色剤銀粒子包含リボソーム等が挙げられる。

[0037] 増感作用を有する標識物質 7を支持体 4に固定化する方法は、用いる材料に応じて適宜変わってくるが、標識物質 7で捕捉抗体 2を修飾して標識物質 7と捕捉抗体 2 との複合体である標識捕捉抗体を調製した後、標識捕捉抗体を含む溶液を支持体 4 に塗布することにより行うことが好ましい。このとき、標識捕捉抗体とともに、標識物質 7で標識しな!、捕捉抗体 2 (非標識捕捉抗体)を溶液中に含ませ、標識捕捉抗体と非標識捕捉抗体との割合を変えることで、支持体 4への標識物質 7の固定化量を制御できる。標識捕捉抗体の状態で支持体 4に塗布すると、捕捉抗体 2が標識物質 7と支持体 4とを接着させるような役割を果たし、標識物質 7が強固に固定化される。この結果、標識物質 7と捕捉抗体 2とを個別に塗布する場合に比べて、試験溶液によって標識物質 7が支持体 4力脱落して例えば下流へ流されることが防止され、被検物質 1 の検出を確実に行うことができる。

[0038] 増感作用を有する標識物質 7を支持体 4に固定化する方法としては、標識物質 7をタンパク質溶液と混合し、標識物質 7にタンパク質を結合させた後、この溶液を支持体 4に塗布する方法でもよい。標識物質 7に結合させるタンパク質としては、例えばゥシ血清アルブミン (BSA)等が挙げられる。この方法は、標識物質 7とともに、抗原や分子量の小さい被検物質などを支持体 4の判定部に固定ィ匕する際に有用である。

[0039] 標識抗体 6を構成する標識物質 5としては、支持体 4に固定ィ匕する標識物質 7として使用可能な前述の物質をいずれも使用可能である。標識物質 5と抗体 3とから標識抗体 6を調製する方法は、常法に従えばよぐ例えば緩衝液中で標識抗体 6を構成する標識物質 5と抗体 3とを混合すればよい。また、ピオチン一アビジン、チオール基を用、た結合も利用できる。

[0040] 本発明では、生体物質、合成物質等あらゆる物質を被検物質 1とすることができる。

被検物質 1を含む試験溶液としても、例えば血液、血清、尿等の生体由来の溶液、自然環境力採取した水や土壌等を含む溶液、これらを用いて調製して得た溶液等、任意のものを用いることができる。

[0041] 次に、以上のような分析を行うための分析装置について説明する。図 3は、本発明を適用したィムノクロマトグラフィー用ストリップの一例である。図 3に示すィムノクロマトグラフィー用ストリップ 11は、短冊状とされた支持体 12と、支持体 12の上流側に配されたコンジュゲートパッド 13と下流側に配された吸収パッド 14とを備えている。

[0042] 支持体 12としては、この種のィムノクロマトグラフィー法に用いられるメンブレンを制限無く使用することができ、例えば-トロセルロース等を用いることができる。支持体 1 2の途中には、捕捉抗体 21が固定化された領域である判定部 15が設けられる。判定部 15の形状は図 1に示すように例えば展開方向に略直交する帯状として!/、るが、これに限定されるものではなぐ例えばスポット状等、任意の形状とすることができる。本発明ィムノクロマトグラフィー用ストリップ 11の判定部 15には、捕捉抗体 21とともに、増感作用を有する標識物質 22が固定化されている。

[0043] 支持体 4の判定部 15の上流側に設けられたコンジュゲートパッド 13は、標識抗体 2 3を移動（展開）可能な状態で保持している。コンジュゲートパッド 13は、例えば、標識抗体 23を保持したグラスウール等の上面に吸水性に優れたろ紙等が積層された構成とされる。判定部 15の上流側に標識抗体 23を展開可能に保持しておくことで、試験溶液を展開する 1つの工程で分析操作を完了することができる。すなわち、試験溶液の展開後に標識抗体 23を別途展開する工程や試験溶液と標識抗体 23とを展開前に混合する工程が不要となり、操作を簡略ィ匕できる。

[0044] なお、本発明のィムノクロマトグラフィー用ストリップ 11においては、標識抗体 23を保持したコンジュゲートパッド 13は必須ではない。コンジュゲートパッド 13を備えない場合、試験溶液と標識抗体 23との混合液を支持体 12に供給するか、又は、試験溶液、標識抗体 23を含む溶液をこの順に支持体 12に供給すればょ、。

[0045] 支持体 12においては、判定部 15に捕捉されな力つた標識抗体 23を捕捉するためのコントロール部 16を判定部 15より下流側に備えている。コントロール部 16は、標識抗体 23を認識するコントロール用抗体 24を支持体 12に固定ィ匕することにより形成される。コントロール部 16に捕捉された標識抗体 23からの発色又は発光により、検査の終了が示される。

[0046] 吸収パット 14は、支持体 4の判定部 15やコントロール部 16の下流側に設けられることで、余剰の試験溶液等を吸収することができる。

[0047] 以上のようなィムノクロマトグラフィー用ストリップ 11を用いて分析を行うには、先ず、コンジュゲートパッド 13に試験溶液を吸収させる。試験溶液中に被検物質が存在する場合、試験溶液がコンジュゲートパッド 13を通過することで標識抗体 23が支持体 1 2側へ移動しながら被検物質と反応して被検物質と標識抗体 23との複合体を形成する。試験溶液は毛細管現象により矢印 Aに示すように横方向に展開されていき、前記複合体が判定部 15を通過する際に捕捉抗体 21に捕捉される。すなわち、捕捉抗体 21と被検物質と標識抗体 23との複合体が形成され、標識抗体 23を構成する標識物質が判定部 15に集積する。ここで、判定部 15には増感作用を有する標識物質 22が予め固定ィ匕されているため、判定部 15における発色又は発光は、判定部 15に集積した標識抗体 23を構成する標識物質と予め固定化されていた標識物質 22との両方の和となる。したがって、判定部 15に集積した標識抗体 23が少量であっても、判定部における発色又は発光が底上げされ、高感度化を実現することができる。また、増感作用を有する標識物質 22を判定部 15に固定ィ匕しておくことで、標識物質 22を固定ィ匕しない場合と同一の感度を得るために必要な捕捉抗体 21の固定ィ匕量を減らすことができる。このため、ィムノクロマトグラフィー用ストリップ 11の低コストィ匕という利点ち得られる。

[0048] 本発明のィムノクロマトグラフィー用ストリップ 11は、従来は ELISA法のみで達成可能であったような高感度分析が可能なため、 ELIS A法が汎用されている分野への適用が可能となる。また、本発明のィムノクロマトグラフィー用ストリップ 11の分析時間は例えば数分程度であり、分析に数時間を必要とする ELISA法に比べて、分析時間の短縮の面で有利である。

[0049] なお、本発明によれば、被検物質の定性分析だけでなぐ試験溶液中の被検物質の定量分析を行うことも可能である。定量分析を行う場合、例えば被検物質濃度と発色強度又は発光強度との対応を予め求めておき、分析後に判定部の発色強度又は発光強度と比較すればよい。

[0050] ところで、捕捉抗体に代えて被検物質 (抗体)に特異的に結合する捕捉抗原を支持体に固定ィ匕し、サンドイッチ法により被検物質として抗体を検出する場合も、前述の捕捉抗体を固定化した場合と同様の効果を得ることができる。なお、捕捉抗原を支持体へ固定化する場合、増感作用を有する標識物質をタンパク質溶液と混合し、標識物質にタンパク質を結合させた後、この溶液を支持体に塗布することにより行うことが好ましい。これにより、増感作用を有する標識物質を支持体に対し強固に固定ィ匕することができる。標識物質に結合させるタンパク質としては、例えばゥシ血清アルブミン等が挙げられる。

[0051] 以上、免疫分析法としてィムノクロマトグラフィー法に適用した例について説明した力本発明は、いわゆるフロースルー法に適用することも可能である。フロースルー法とは、支持体の膜厚方向に試験溶液を通過させ、その後標識抗体を通過させることで、判定部における発色又は発光を観察する方法である。試験溶液と標識抗体とは、予め混合し、被検物質標識抗体複合体を形成させた後に支持体に供給してもよい。フロースルー法による免疫分析法に適用する場合も、増感作用を有する標識物質を捕捉抗体又は捕捉抗原とともに判定部に固定ィ匕することで、判定部において強い発色又は発光が得られ、高感度分析を実現することができる。また、フロースル一法を採用することにより、ィムノクロマトグラフィー法に比べてさらなる迅速分析が可能となる。

[0052] また、以上の説明では、サンドイッチ法を例に挙げたが、本発明は競合法による免疫分析法に適用することも可能である。

[0053] 競合法では、先ず、予め支持体に被検物質及び標識物質を共存させて固定化して判定部としておく。被検物質を支持体へ固定化する場合、標識物質をタンパク質溶液と混合し、標識物質にタンパク質を結合させた後、この溶液を支持体に塗布することにより行うことが好ましい。これにより、増感作用を有する標識物質を支持体に対し強固に固定ィ匕することができる。標識物質に結合させるタンパク質としては、例えばゥシ血清アルブミン等が挙げられる。

[0054] 次に、未知濃度の被検物質を含む試験溶液と被検物質に特異的に結合する標識抗体とを支持体に供給する。試験溶液及び標識抗体は、これらを混合して被検物質と標識抗体との複合体を形成させた後に支持体に供給してもよ、し、試験溶液と標識抗体を含む溶液とをこの順に個別に支持体に供給してもよい。試料溶液中の被検物質が低濃度の場合、被検物質と複合体を形成しなかった標識抗体が多く集積する一方、試料溶液中の被検物質が高濃度の場合、標識抗体は判定部に集積せずに下流へ移動する。結果として、被検物質の濃度が低くなるほど、判定部への標識抗体の集積量が増加し、判定部において強く発色又は発光するので、固定化する固定化被検物質の濃度や試験溶液と混合する標識抗体濃度等の条件を一定にしておけば、判定部の発色強度又は発光強度を指標として定量分析が可能となる。

[0055] このような競合法による免疫分析法において、支持体の判定部に固定ィ匕被検物質とともに増感作用を有する標識物質を固定ィ匕しているので、判定部における標識抗体 (標識物質）による発色強度又は発光強度が底上げされ、発色又は発光が検知可能となるために必要な標識抗体 (標識物質)の量が減ることになる。また、固定化した標識物質が存在することにより標識物質の間隔が密になり、標識抗体が高濃度に集積した状態が擬似的に実現される。このため、判定部への標識抗体の集積が少量であっても判定部において強い発色強度又は発光強度が得られる。その結果、競合法による免疫分析法において、高濃度側の定量範囲が広がり、ダイナミックレンジの拡大を図ることができる。

実施例

[0056] 以下、本発明の実施例について、詳細に説明する。

[0057] (実験 1 hCG (ヒトゴナドトロピン)の検出）

先ず、ィムノクロマトグラフィー法の高感度化を目的として、妊娠検査のマーカーである hCGの検出をモデルとして検討を行った。

[0058] 〈判定部に塗布する金コロイド粒子量の検討〉

先ず、判定部 (テストライン）に固定ィ匕する標識物質の量を検討した。標識物質として、各種粒径（10nm、 15nm、 40nm、 60nm、 80nm、 150nm)の金コロイド粒子（ BBI社製)を用意した。また、捕捉抗体として、 hCGの oc—サブユニットを認識するモノクローナル抗体である抗 h a S抗体を用意した。前記金コロイド粒子に抗 h a S抗体を修飾して金コロイド標識抗 h a S抗体を作製した。 O. D.値（520nm)が 6となるように金コロイド標識抗 h a S抗体を含む溶液を調製し、各粒径の溶液の赤色の濃さを同一にした。

[0059] 次に、金コロイド標識抗 h a S抗体を含む溶液と、金コロイド粒子で修飾して、なヽ非標識抗 h a S抗体を含む溶液とを混合し、混合溶液を得た。この混合溶液をスポッター（武蔵エンジニアリング社製、商品名 ShotMaster3000)を用いてメンブレンに塗布し、判定部を形成した。前記混合溶液を調整する際には、非標識抗 h a S抗体溶液に対して 1 %、 3%、 5%、 10%、 20%、 50%又は 80%の金コロイド標識抗 h a S抗体溶液を混合した。混合溶液のメンブレンへの塗布量は、 1スポットあたり 0. 2 μ \ とした。この場合、判定部における金コロイド粒子の濃度は、収率 100%で塗布されたと仮定した場合、それぞれ概ね 8ng/mm²、 24ng/mm²、 40ng/mm², 80ng / 160ngZmm²、 400ngZmm²、 6400ng/mm²と見積もられた。なお、非標識抗 h a S抗体溶液に対して金コロイド標識抗 h a S抗体溶液を 5%混合するとは、非標識抗 h a S抗体溶液 100mlに対して金コロイド標識抗 h a S抗体溶液を 5ml添加することを意味する。

[0060] その後、メンブレンの判定部を目視で観察した。図 4に、標識物質として粒径 40nm の金コロイド粒子を用いたメンブレンの写真を示す。図 4から、金コロイド標識抗 h a S 抗体量を 5%以下とした場合、予めメンブレンに金コロイドが塗布されていたとしても、金コロイド粒子の発色は目視で認識できないことが確認された。また、他の粒径においても、 40nmの場合と同様に、金コロイド標識抗 h a S抗体量を 5%以下、すなわち金コロイド粒子の濃度を 40ngZmm²以下とした場合、目視で認識できな、ことが確認された。したがって、判定部における金コロイド粒子の固定ィ匕量が 5%以下、すなわち 40ngZmm²以下力目視で認識できない量であることが明ら力となった。さらに、後述する方法にて hCGの検出を行った結果、金コロイド標識抗 h a S抗体量を 3% 以下、すなわち 24ngZmm²以下とした場合、抗体間の非特異的吸着に起因する呈色を確実に抑えられることが確認された。

[0061] く hCG検出用ィムノクロマトストリップの作製〉

次に、 hCGを検出するためのィムノクロマトグラフィー用ストリップを作製した。

粒径 60nmの金コロイド粒子で抗 h a S抗体を修飾して金コロイド標識抗 h a S抗体を作製した。金コロイド標識抗 h a S抗体を含む溶液は、 O. D. 力 ½となるように調

520

製し、非標識抗 h a S抗体を含む溶液を混合して混合溶液を得た。非標識抗 h a S抗体溶液に対する金コロイド標識抗 h a S抗体溶液の混合割合は、 3%とした。

[0062] 前記混合溶液を、 BioDot社製の商品名 BioJetQuanti300を用いてメンブレンの判定部となる位置に塗布した。前記混合溶液の塗布量は、 1cmあたり 0. 7 1とした。混合溶液を塗布し、乾燥させた後、ブロッキング、ゥォッシングを施した。得られたメンブレンをバッキングシートに貼り付け、端部に吸収パッドを付けた後、幅 4mmのストリップ状に切断し、 hCG検出用ィムノクロマトテストストリップを得た。

[0063] く hCGの測定〉

濃度 0. lng/mU 0. 05ng/mU 0. 025ng/mU 0. 0125ng/mU 0. 00625 ngZml、又は 0. 00315ng/mlとなるようにリコンビナント hCG (ロート製薬社製）をリン酸緩衝液で希釈し、得られた hCG希釈液を試験溶液として実験に用いた。

[0064] hCG検出用の標識抗体としては、金コロイド標識抗 hCG抗体を用いた。抗 hCG抗体は、 hCGの |8—サブユニットを認識するモノクローナル抗体である。金コロイド標識抗 hCG抗体を含む溶液は O. D. 力となるように調製した。

520

[0065] hCG希釈液 (試験溶液) 40 μ 1に対して金コロイド標識抗 hCG抗体 (標識抗体)を含む前記溶液を 4 1添加し、混合した後、前記 hCG検出用ィムノクロマトテストストリップの一端に吸収させ、 hCGの検出を行った。結果を図 5 (a)に示す。

[0066] また、比較のため、通常の方法でィムノクロマトテストストリップを作製した。すなわち、テストラインに標識物質である金コロイド粒子を塗布せず、捕捉抗体である抗 h a S 抗体のみを塗布し、固定ィ匕した。これを用いて、先の説明と同様に、 hCGの検出を行つた。結果を図 5 (b)に示す。

[0067] 従来のィムノクロマトテストストリップでは、 0. 025ng/mlの段階で判定部の発色が認識し難くなつており、それ以下の濃度では目視で認識することができな力つた。これに対し、本発明のィムノクロマトテストストリップを用いた場合、 0. 00315ngZmlの低濃度であっても、判定部の発色をはっきりと目視で認識することができた。

[0068] 〈固定ィ匕金コロイド粒子の粒径の検討〉

メンブレンに固定ィ匕する金コロイド粒子の最適な粒径について検討した。先ず、粒径 5nm、 15nm、 40nm、 60nm、 80nmの金コロイド粒子を用意し、各粒径の金コロイド粒子で抗 h a S抗体を修飾して金コロイド標識抗 h a S抗体を作製した。金コロイド標識抗 h a S抗体を含む溶液は、 O. D. が 6となるように調製し、非標

520

識抗 h a S抗体を含む溶液を混合して混合溶液を得た。非標識抗 h a S抗体溶液に対する金コロイド標識抗 h a S抗体溶液の混合割合は、コントロールラインでの呈色が目視で認識できな力つた 3%とした。次に、 hCG検出用ィムノクロマトストリップの作製にっ、ての説明に準じ、得られた混合溶液を用いて hCG検出用ィムノクロマトストリップを作製した。

[0069] 次に、リン酸緩衝液を用いて hCG抗原希釈液を作製し、これを試験溶液として hC Gの検出を行った。結果を図 6に示す。なお、同図中、 1、 2、 3、 4及び Cは、ストリップに展開した試験溶液の hCG濃度を表すための符号であり、それぞれ lngZml、 0. 1 ng/ml、 0. Olng/mU 0. 001ng/ml、 0 (hCGを含まな!、。 )に対応してヽる。

[0070] 図 6から明らかなように、いずれの粒径においても、判定部に金コロイド粒子を予め固定化しておくことで検出感度が向上している。中でも、粒径 15ηπ！〜 40nmの金コロイド粒子を固定ィ匕した場合、 hCGが極めて低濃度であっても判定部における呈色力り明瞭に観察され、さらなる高感度検出が実現された。特に粒径 15nmの金コロイド粒子を固定ィ匕した場合に、最も高い感度が得られた。なお、粒径 5nmの金コロイド粒子を固定ィ匕したときの検出感度の向上効果は不十分なものであった。

[0071] 〈血清を使用した固定化金コロイド粒子の粒径の検討〉

先ず、リン酸緩衝液を用いて試験溶液を調製した場合と同様に、 hCG検出用ィムノクロマトストリップを作製した。テストラインには、粒径 15nm、 40nm、 60nmの金コロイド粒子を固定ィ匕した。

[0072] 次に、男性の血清を用いて hCG抗原希釈液を作製し、これを試験溶液として hCG の検出を行った。結果を図 7に示す。同図中、 1、 2、 3、 4は、ストリップに展開した試験溶液の hCG濃度を表すための符号であり、それぞれ lngZml、 0. lng/ml, 0. Olng/mU 0. OOlng/ml【こ対応して!/ヽる。

[0073] 図 7の結果から、試験溶液として血清を用いた場合も、リン酸緩衝液を用いた場合と同様、高感度検出が実現され、中でも粒径 15ηπ！〜 40nmの金コロイド粒子を固定化した場合、さらなる高感度検出が実現された。また、粒径 15nmの金コロイド粒子を固定ィ匕した場合に最も良い結果が得られた。

[0074] (実験 2 PSA (前立腺特異抗原)の検出）

前立腺癌の指標である PSAは、健康な男性にもわずかながら存在し、年齢とともにその値は上昇する。 PSA値力 ngZml以上の場合、初期の前立腺癌を疑い、健康診断では 2次検査の対象となる。このため、ィムノクロマトグラフィー用ストリップに対しては、血清測定において 4ngZml以下の PSAを正確に検出可能であることが望まれる。したがって、以下の実験では、 PSAの高感度検出を目的として検討を行った。

[0075] く PS A検出用ィムノクロマトテストストリップの作製〉

先ず、標識物質として金コロイド粒子 (40nm)を用いるとともに、捕捉抗体として抗 P SA抗体を用いて PSAを検出するためのィムノクロマトグラフィー用ストリップを作製した。

[0076] メンブレンへ標識物質を固定ィ匕するため、金コロイド粒子 (粒径 15nm)で抗 PSA抗体 (捕捉抗体)を修飾し、金コロイド（15nm)標識抗 PSA抗体を作製した。作製した金コロイド（15nm)標識抗 PSA抗体を含む溶液を O. D. 力 ½となるように調製した

520

。次に、未標識抗 PSA抗体を含む溶液に対して前記金コロイド（15nm)標識抗 PSA 抗体を含む溶液を 3%の割合で混合して混合溶液を得た。この混合溶液を、実験 1と同様にしてメンブレンに塗布し、 PSA検出用ィムノクロマトテストストリップを得た。

[0077] く PSAの検出〉

次に、血液中の PSA検出を試みた。前立腺癌は男性特有の疾患であるため、女性の血液力 PSAは通常検出されない。そこで、女性の血液に濃度 IngZml又は 0. IngZmlとなるよう〖こ PSAを添加し、これを試験溶液とした。

[0078] PSA検出用の標識抗体として、抗 PS A抗体を金コロイド粒子 (40nm)で修飾し、金コロイド (40nm)標識抗 PSA抗体を得た。ここで用いた抗 PS A抗体は、前記捕捉抗体としての抗 PSA抗体（15nm)とは異なる認識部位で PSAと結合するものである。金コロイド (40nm)標識抗 PS A抗体を含む溶液を O. D. 力となるように調製し

520

た。

[0079] その後、 PSAを混合した女性の血液 40 μ 1〖こ対して金コロイド (40nm)標識抗 PS A抗体を含む溶液を 4 1添加し、混合した後、 PSA検出用ィムノクロマトテストストリツプの一端に吸収させ、 PSAの検出を行った。

[0080] また、比較のため、従来の方法でィムノクロマトテストストリップを作製した。すなわち、判定部に標識物質である金コロイド粒子を塗布せず、捕捉抗体である抗 PSA抗体のみを塗布し、固定ィ匕した。これを用いて、先の説明と同様に、 PSAの検出を行った。結果を図 8に示す。図 8中、 Sは本発明のィムノクロマトテストストリップ、 Cは従来のィムノクロマトテストストリップを表す。 [0081] 図 8から、従来の方法で作製したィムノクロマトテストストリップにおいては、 PSA濃度 IngZmlのときには判定部の発色が目視で認識されたが、 PSA濃度 0. lng/ml のときには判定部を認識できな力つた。一方、本発明のィムノクロマトテストストリップを用いた場合、 PSA濃度 0. IngZmlのときにも判定部を認識できた。よって、実験 2 の結果から、本発明のィムノクロマトテストリップは、 PSAの高感度検出が可能であり、初期段階の前立腺癌の簡便且つより正確な診断に有用であることがわかる。

[0082] 以上、実験 1及び実験 2の結果から、捕捉抗体とともに標識物質を予め固定化しておくことで、ィムノクロマトグラフィー用ストリップの高感度化が実現されることが確認された。

[0083] (実験 3 捕捉抗体固定化量の検討）

以下の実験では、本発明を適用したィムノクロマトテストストリップにおいて、判定部に固定ィ匕する捕捉抗体の量を減らすことが可能か否カゝ検討を行った。

[0084] く PS A検出用ィムノクロマトテストストリップの作製〉

標識物質として金コロイド粒子（15nm)を用いるとともに、捕捉抗体として抗 PSA抗体を用いて PSAを検出するためのィムノクロマトグラフィー用ストリップを作製した。

[0085] 濃度 650ngZmlの抗 PSA抗体溶液を用意し、これを判定部に塗布することにより、従来のィムノクロマトグラフィー用ストリップを作製した。また、抗 PSA抗体の濃度が 430ng/ml (濃度 650ng/ml抗 PSA抗体溶液を 100%としたとき、 66%) , 325ng Zml (50%)、又は 215ngZml (33%)である抗 PSA抗体溶液を用意した。これに金コロイド標識抗 h a S抗体を含む溶液 (O. D. )を 3%加えて混合溶液を得た。こ

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の混合溶液を実施例 2と同様にしてメンブレンに塗布し、 PSA検出用ィムノクロマトテストストリップを得た。

[0086] その後、実施例 2と同様にして PSAの検出を行った。濃度 5ngZml、 lng/ml, 0 . 5ng/mlの PSA溶液についてそれぞれ検討した。分析後のストリップの写真を図 9 に示す。また、判定部の色の濃さをデンシトメ一ターにより測定し、画像解析を行って比較した。結果を図 10に示す。

[0087] メンブレンの判定部に固定化する捕捉抗体量を従来の 66%に減らした場合であつても、判定部に金コロイド粒子を予め固定ィ匕しておくことで、判定部に金コロイド粒子を固定ィ匕していない従来例より強い発色強度を示した。また、メンブレンの判定部に固定ィ匕する捕捉抗体量を従来の 50%に減らした場合でも、判定部に金コロイド粒子を予め固定ィ匕しておくことで、捕捉抗体量 100%の場合と同等の発色強度が得られた。ィムノクロマトテストストリップにおいて抗体は最もコストの高い部材の 1つである。したがって、本発明によれば、必要な捕捉抗体量を従来の半分程度に減らした場合であっても従来と同一の感度を実現することができるため、ィムノクロマトテストストリツプの大幅なコスト削減が期待される。

Claims

請求の範囲

[I] 被検物質、被検物質に特異的に結合する捕捉抗体、被検物質に特異的に結合する捕捉抗原から選ばれる 1種を固定化した判定部を有する支持体と、被検物質に特異的に結合する標識抗体とを用いた免疫分析法による被検物質の分析法であって、前記支持体の前記判定部に増感作用を有する標識物質を固定化しておくことを特徴とする分析方法。

[2] 前記免疫分析法がサンドイッチ法による免疫分析法であることを特徴とする請求項 1記載の分析方法。

[3] 前記免疫分析法が競合法による免疫分析法であることを特徴とする請求項 1記載の分析方法。

[4] 前記捕捉抗体及び前記標識物質を含む溶液を前記支持体に塗布することにより前記固定ィ匕を行うことを特徴とする請求項 1〜3のいずれか 1項記載の分析方法。

[5] 前記標識物質が、発色物質又は発光物質であることを特徴とする請求項 1記載の分析方法。

[6] 前記発色物質として、貴金属コロイド粒子、ラテックス微粒子力選ばれる少なくとも

1種を用いることを特徴とする請求項 5記載の分析方法。

[7] 前記判定部において、固定化された前記標識物質の発色又は発光が目視で認識不可能であることを特徴とする請求項 1記載の分析方法。

[8] 前記判定部に前記発色物質として金コロイド粒子が固定化されており、前記判定部における前記金コロイド粒子の固定ィ匕量力 0ngZmm²以下であることを特徴とする請求項 7記載の分析方法。

[9] 前記判定部における発色又は発光を機器分析する場合において、前記判定部に固定化された前記標識物質の固定化量は、当該機器の検出限界以下とされていることを特徴とする請求項 1記載の分析方法。

[10] 前記標識物質と前記標識抗体を構成する標識物質とで同種材料を用いることを特徴とする請求項 1〜9のいずれ力 1項記載の分析方法。

[II] 前記標識物質と前記標識抗体を構成する標識物質とで異種材料を用いることを特徴とする請求項 1〜9のいずれ力 1項記載の分析方法。

[12] ィムノクロマトグラフィー法を利用することを特徴とする請求項 1〜： L Iのいずれか 1 項記載の分析方法。

[13] 免疫分析法による被検物質の分析装置であって、

被検物質、被検物質に特異的に結合する捕捉抗体、被検物質に特異的に結合する捕捉抗原から選ばれる 1種が固定化された判定部を有する支持体を含み、前記支持体の前記判定部に増感作用を有する標識物質が固定化されていることを特徴とする分析装置。

[14] 前記捕捉抗体及び前記標識物質は、これらを含む溶液を前記支持体に塗布することにより前記支持体に固定化されることを特徴とする請求項 13記載の分析装置。

[15] 前記標識物質が、発色物質又は発光物質であることを特徴とする請求項 13又は 1 4記載の分析装置。

[16] 前記発色物質が、貴金属コロイド粒子、ラテックス微粒子力選ばれる少なくとも 1 種であることを特徴とする請求項 15記載の分析装置。

[17] 前記判定部において、固定化された前記標識物質の発色又は発光が目視で認識不可能であることを特徴とする請求項 13〜16のいずれか 1項記載の分析装置。

[18] 前記判定部に前記発色物質として金コロイド粒子が固定化されており、前記判定部における前記金コロイド粒子の固定ィ匕量力 0ngZmm²以下であることを特徴とする請求項 17記載の分析装置。

[19] 前記判定部における発色又は発光を機器分析する場合において、前記判定部に固定化された前記標識物質物質の固定化量は、当該機器の検出限界以下とされていることを特徴とする請求項 13〜16のいずれか 1項記載の分析装置。

[20] 前記被検物質に特異的に結合する標識抗体が、前記捕捉抗体が固定化された領域より上流側に移動可能な状態で保持されていることを特徴とする請求項 13〜19の

V、ずれか 1項記載の分析装置。

[21] 前記標識物質と前記標識抗体を構成する標識物質とが同種材料であることを特徴とする請求項 13〜20のいずれか 1項記載の分析装置。

[22] 前記標識物質と前記標識抗体を構成する標識物質とが異種材料であることを特徴とする請求項 13〜20のいずれか 1項記載の分析装置。ィムノクロマトグラフィー法を利用して被検物質を検出することを特徴とする請求項 1 〜22の、ずれか 1項記載の分析装置。