JPH06167497A - 固相アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 孔性支持相中の試薬および／または試料の毛
管流により分析物を固相アッセイするための装置および
方法を提供する。 【構成】 本発明の装置は、水平位置で使用するために
デザインされ、そして、トレーサーと分析物を混合する
ための部分、およびアッセイが完了したことを示すため
の手段を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、分析物の固相アッセイ
に関し、特定すれば、孔性固相支持体中の試薬および／
または試料の毛管流を用いた特異的結合アッセイに関す
る。

【０００２】

【従来技術】特異的結合アッセイ、例えばイムノアッセ
イはリガンドとリセプターの間の結合の特異性のために
さまざまな臨床的応用およおび研究的応用において偉大
な価値があることが見いだされてきた。したがって、こ
のようなアッセイのための多くの異なるプロトコルおよ
びフォーマットが開発され、そのひとつは、通常、スト
リップの形態の１片の孔性材料上で結合アッセイを実施
することを含む。この種のアッセイは上記孔性材料の毛
細管特性により引き続いて反応成分が互いに接触すると
いう利益をもたらす。これはしばしば、ストリップに沿
って予め決定された位置に反応成分を配置して一方の端
に適用される液体が該ストリップに沿って毛細管移動す
るようにし、そして所望の配置で他の反応成分を接触さ
せることにより達成される。分析物の存在は、リガンド
とリセプターの間の結合反応に含まれる検出可能な標識
からのシグナルを検出することにより測定される。

【０００３】これらの原理を用いるイムノアッセイの例
は、しばしばイムノキャピラリーまたはイムノクロマト
グラフィーアッセイと呼ばれ、国際公開番号８７／０２
７７４、ＥＰ ０ ３０６ ７７２、米国特許第４，０
９４，６４７号、米国特許第４，９９９，２８５号、米
国特許第４，１６８，１４６号、ＧＢ ２ ２０４３９
８、米国特許第４，９４３，５２２号、米国特許第５，
０３７，７３６号、米国特許第５，０７５，０７８号、
米国特許第５，０９６，８３７号およびグランド（Ｃ．
Ｇｌａｎｄ）とグルブ（Ａ．Ｏ．Ｇｒｕｂｂ）、アナリ
ティカルバイオケミストリー、８５：１８０−１８７
（１９７８）の開示において見いだすことができる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、孔性支持相
中の試薬および／または試料の毛管流により分析物を固
相アッセイするための装置および方法を提供することを
目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、検出されるべ
き分析物を含む疑いのある試料に接触した第１部分を有
する孔性固相支持体を提供する。上記試料中に存在する
分析物は上記固相支持体の毛管を通って流れ、そして可
逆的に上記固相支持体に結合したトレーサーと混合され
る。分析物とトレーサーの混合物は上記固相支持体の材
料を通って毛管流により第２部分へ輸送されるが、その
際、それらは（１）分析物に特異的に結合するかまたは
（２）分析物とトレーサーに特異的に結合する固定バイ
ンダーに接触して結合する。未結合のトレーサーは連続
する毛管流により上記固相支持体の第３部分へ、上記第
２部分を通って移動する。上記第３部分は物質を受ける
ためだけに使用され、上記第２部分には結合しておらず
（例えば、サンドイッチアッセイの場合）、あるいは未
結合のトレーサーの検出のための付加的試薬を含んでよ
い（例えば、競争アッセイの場合）。

【０００６】本発明の現在好ましい態様において、試料
は固相支持体の第１部分に適用され、そして第１部分を
通って、トレーサーを含む分離部分へ流れることによ
り、上記試料中に存在するかもしれない分析物をトレー
サーと混合させる。必要であれば、第２部分を含む固相
支持体の領域へ毛管流により輸送される前に、混合され
た分析物とトレーサーを次にトレーサー部分から固相支
持体の付加的混合部分へ流してよい。この任意の付加的
部分により分析物とトレーサーがさらに混合され、そし
て結合のためのインキュベート時間を与える。この好ま
しい態様の第３部分は、アッセイが完了したことを視覚
的に示すことができる上記固相支持体上の位置に液体の
先端を進めることにより輸送される染料を含むインディ
ケーターゾーンを含む。

【０００７】本発明は、米国特許出願第０７／８１８，
０００号の継続出願に開示された発明の一態様であり、
その開示内容は引用により本明細書の一部をなす。本発
明は、前に開示された固相支持体の特定の構造的および
機能的特徴の特定の組み合わせを表す好ましい態様を提
供する。簡単に言えば、試料を固相支持体の第１部分に
適用するが、該固相支持体は本質的に水平位置にある。
第１部分に適用された液体が上記第１部分を通って垂直
に流れ、そして上記トレーサー部分に入り、その後トレ
ーサーと分析物が毛管流により上記第２部分へ横に輸送
されるように、トレーサー部分は上記第１部分から離れ
ており、上記第１部分に相対して配置される。この好ま
しい態様の第３部分は、液体の毛管流（即ち、液体の先
端）が、固相支持体上の予め決定された完了ゾーンに進
んでアッセイの完了を知らせるための付加的特徴を有す
る。

【０００８】第１部分を含む固相支持体の領域は、その
表面に適用された液体を吸収することができる多孔性材
料からなる。試料は上記孔性第１部分の毛管チャンネル
を通って分離トレーサー部分へ通過するが、この通過は
液体伝達による。第１部分の使用に適した材料は、ポリ
エチレン［例えば、ＰＯＲＥＸ（Ｐｏｒｅｘ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｆａｉｒｂｕｒｎ，Ｇｅｏｒｇｉａ
より市販されている）］、グラスファイバー、レーヨ
ン、ナイロンおよびセルロース系材料、例えば紙を含
む。孔性ポリエチレンは特に好ましい。もっとも好まし
くは、第１部分が上部表面および下部表面を含む層から
なる。試料は第１部分の上部表面に適用され該表面を通
って上部表面の平面に対して実質的に垂直方向に通過
し、下部表面を通ってトレーサー部分へ出る。第１部分
は主として、生物学的試料中に存在するかもしれない細
胞および細胞破片のような粒状物質の物理的除去のため
のフィルターとして機能する。フィルターとしてのみ機
能する場合、第１部分は多孔性材料のみからなってよ
い。しかしながら、アッセイに必要なものとして試薬を
加えてもよい。これら試薬は第１部分の多孔性材料に浸
透し、例えば緩衝液および界面活性剤を含んでよい。

【０００９】トレーサー部分は同様に、ポリエチレン、
グラスファイバー、レーヨン、ナイロンまたはセルロー
ス系材料、例えば紙からなる。トレーサー部分は多孔性
材料からなることが好ましい。トレーサー部分は第１部
分との間で液体伝達を形成し、そして第１部分から出る
ときに試料を吸収する。好ましくは、第１部分の下部表
面に接触した上部表面を有する層も有し、かつ、トレー
サー部分の毛管チャンネルを通って液体の流れを上記上
部表面の平面に対して実質的に垂直方向にする。トレー
サー部分は、（１）分析物に対するリガンド、（２）分
析物、または（３）分析物類似体に結合した検出可能な
標識を含むトレーサーをさらに含む。分析物に対するリ
ガンドは、分析物を特異的に認識しかつ結合する分子で
あり、即ちリガンドと分析物は特異的結合ペアである。
このようなリガンドの多くは、当該技術分野において公
知であり、例えば、抗原と抗体、酵素とそれらの基質、
炭水化物とレクチン、およびアビジンあるいはストレプ
トアビジンとビオチンのペアである。本発明の現在好ま
しい態様における使用には抗原と抗体が好ましい。

【００１０】第１部分からの液体がトレーサー部分に接
触した場合にトレーサーと分析物がトレーサー部分から
毛管流により第２部分へ共に輸送されるように、トレー
サーは固相支持体のトレーサー部分上または内に支持さ
れる。即ち、トレーサーはトレーサー部分に固定される
が可逆的に結合されており、試料の液体によりトレーサ
ー部分が濡れると同時にトレーサーは放出される。トレ
ーサーの検出可能な標識成分は特異的結合アッセイ、特
にイムノアッセイに使用される当該技術分野において公
知のあらゆる検出可能な標識であってよい。これらに
は、ラジオアイソトープ、蛍光染料、発色生成物を生成
するために反応することができる酵素、可視染料等を含
む。これらの標識をリガンドに結合させ、そしてそれら
が生じるシグナルを検出する方法は当該技術分野におい
て公知である。

【００１１】本発明の現在好ましい態様には粒状の検出
可能な標識が好ましい。適切な粒子には、ポリマー（例
えば、ラテックスまたはポリスチレン）、嚢（ｓａ
ｃ）、リポソーム、金属ゾル（例えば、銀コロイドまた
は金コロイド）またはポリスチレン染料の粒子を含む。
トレーサーを形成するためには、このような粒子は検出
可能な標識を含むように誘導され、通常はこの目的のた
めに当該技術分野において知られている方法を用いて化
学結合を形成することにより誘導される。嚢およびリポ
ソームの場合、標識は小胞中に閉じ込めてもよい。粒子
およびそれに結合した標識はトレーサーのリガンド成分
に化学結合させてよい。別法として、ポリマー粒子、ポ
リマー染料および金属粒子は、トレーサーのリガンド成
分でコートされていてよく、その方法は例えば米国特許
第５，０９６，８３７号に記載されている。本発明の現
在好ましい態様において検出可能な標識として使用され
る最も好ましいものは、可視吸収染料で浸されたポリマ
ー粒子であり、特定すれば、０．４−０．５ミクロンの
ラテックスミクロ粒子、例えばバングスラボラトリーズ
（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、インディ
アナポリス、インディアナから市販されているブルーダ
イドラテックス（ＢＬＵＥ ＤＹＥＤ ＬＡＴＥＸ）で
ある。

【００１２】本発明の現在好ましい態様はさらに、トレ
ーサー部分と液体伝達された付加的混合部分を含む。該
混合部分は、上記第１部分およびトレーサー部分におい
て記載された多孔性材料も含み、孔性ポリエチレンが好
ましい。上記第１部分およびトレーサー部分を通過する
液体は、第２部分を含む固相支持体の部分に上記混合部
分から輸送される前に上記混合部分に流れる。該混合部
分は混合部分から第２部分への毛管流に先立って分析物
とトレーサーの混合を促進する。さらに、サンドイッチ
アッセイにおいては分析物／トレーサー複合体が第２部
分に接触する前に分析物とトレーサーの結合のためのイ
ンキュベート時間を提供する。好ましくは、混合部分は
トレーサー部分の下部表面に液体伝達されて上部表面と
層を形成してもよい。

【００１３】上記トレーサー部分を通って通過する液体
はその上部表面を通って上記混合部分へ入り、そして上
記混合部分の層の平面に本質的に垂直な方向に流れ、上
記下部表面を通って出る。上記混合部分は、上記第２部
分を含む固相支持体部分と液体伝達されており、そして
液体の輸送は毛管により上記混合部分から上記第２部分
へと進む。混合部分が上記アッセイ装置に含まれていな
いならば、上記トレーサー部分は上記第２部分を含む固
相支持体部分と直接毛管流で伝達される。

【００１４】第２部分を含む上記固相支持体部分（ｓｅ
ｇｍｅｎｔ）は吸収性微孔性材料を含む。該微孔性材料
は毛管により前記部分から第２部分へ液体をはじく（ｗ
ｉｃｋ）ために機能する。即ち、分析物とトレーサーの
液体混合物はトレーサー部分または混合部分から上記微
性材料へ毛管流により輸送され、そして第２部分のバイ
ンダーに接触して上記微孔性材料内で輸送され続ける。
この好ましいアッセイ装置のこの部分に使用されるのに
適した微孔性材料はフィルターペーパー、クロマトグラ
フィーペーパー、グラスフィルター、架橋結合されたデ
キストラン、ナイロンおよびニトロセルロースを含む。
ニトロセルロースが最も好ましいが、それは上記第２部
分のバインダーが共有結合なしにこの材料上に容易に固
定できるからである。

【００１５】必要ではないが最も好ましくは、吸収性微
孔性材料からなる上記固相支持体部分（ｓｅｇｍｅｎ
ｔ）は、図面により示されるとおり、その内部の毛管流
の方向が前記部分を通る流れの方向に対して実質的に垂
直になるように配置される。これにより、水平位置より
むしろ垂直位置でこのアッセイ装置を用いて実施するこ
とができるアッセイが提供され、アッセイを実施および
読み取る間に装置をホールドする必要性がなくなる。さ
らに、もっとも好ましいアッセイ装置は上記付加的混合
部分を含む前記すべての部分を含む。

【００１６】第２部分のバインダーは、アッセイがサン
ドイッチアッセイフォーマットで実施されるのかあるい
は競争アッセイフォーマットで実施されるのかに依存し
て（１）分析物または（２）分析物とトレーサーであ
る、相補的結合対のメンバーに特異的に結合するリガン
ドまたはリセプターである。このようなバインダー／相
補的結合対のメンバーの多くは当該技術分野において公
知であり、抗原と抗体、酵素とそれらの基質、炭水化物
とレクチン、およびアビジンあるいはストレプトアビジ
ンとビオチンのペアを含む。本発明のアッセイにおける
使用には、抗原またはハプテンとポリクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体が第２部分の好ましいバインダ
ーである。第２部分のバインダーに関する抗原または抗
体の選択は検出される分析物の性質、即ち、分析物がそ
れ自身抗原であるかあるいは抗体であるかに依存する。
検出される分析物が抗体の場合は、第２部分のバインダ
ーはその抗体により特異的に認識され、かつ、結合され
る抗原であってよい。別法として、抗体分析物は適当な
抗−抗体抗体（ａｎｔｉ−ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｔｉ
ｂｏｄｙ）により第２部分に結合していてよい。反対
に、検出される分析物が抗原またはハプテンの場合は、
第２部分のバインダーはその抗原に対する抗体であって
よい。

【００１７】バインダーは、第２部分を通る液体の毛管
流により第２部分から除去されないように、第２部分内
の微孔性材料に固定される。即ち、バインダーは、第２
部分が分析物およびトレーサーを含む液体により濡れた
ときに、拡散しないように上記微孔性材料に結合し、そ
して第２部分に固定されて残る。このような固定は当該
技術分野において公知の方法により、バインダーを上記
微孔性材料に共有結合させることにより達成してよい。
別法として、上記微孔性材料がニトロセルロースの場合
は、満足の行く非共有結合が可能である。この理由か
ら、ニトロセルロースが好ましい材料であり、バインダ
ーを結合するためのより単純な方法となる。したがっ
て、ニトロセルロースを用いる場合は、バインダーを第
２部分上にスポットまたはプリントしてよく、「プラ
ス」サイン、チェックマークまたは幾何学図（例えば、
円、四角または三角）のようなきまったパターンで適用
することが好ましい。分析物とトレーサーを含む液体が
第２部分に流れると共に分析物とトレーサーは第２ゾー
ン中でバインダーに結合するようになり、そしてそこに
固定される。

【００１８】規定されたパターンのバインダーが第２部
分に固定される場合は、第２バインダーの第２パターン
を、第２部分のバインダーに隣接している上記固相支持
体上に位置するように適用して、２つのバインダーが同
じ実験条件で上記液体先端により接触されるようにして
よい。この第２パターンをポジティブコントロールエリ
アとして用いることによりアッセイを正確に機能させて
よく、必要であれば抗原または抗体のいずれかを含ませ
てよい。例えば、抗原分析物を検出するようにアッセイ
をデザインするのならば、第２パターンは検出される抗
原を含んでよい。抗体分析物を検出するようにアッセイ
をデザインするのならば、第２パターンは抗体を含んで
よい。別法として、第２パターンのバインダーは検出さ
れる分析物、例えばトレーサー部分に含まれる標識ハプ
テンを結合する抗−ハプテン抗体と関連させなくてよ
い。適切なハプテンの例としは、ビオチン、ＤＮＰおよ
び安息香酸を含み、対応する抗体は第２部分の第２パタ
ーン中に存在する。

【００１９】第２部分を接触させた後、液体は毛管流に
より微孔性材料を通って、第２部分を通過して第３部分
へ移動し続ける。即ち、第３部分は第２部分と毛管流に
より液体伝達されている。第３部分は第２部分からの液
体を受ける微孔性材料のエリアからなる。競争アッセイ
フォーマットにおいては、第３部分は第２部分内で結合
しなかった検出用トレーサーの基質を含んでよい。サン
ドイッチアッセイフォーマットにおいては、第３部分は
通常、第２部分内で結合しなかった液体含有物質を受け
るためだけに機能し、即ち、分析物の検出に関連したい
かなる付加的試薬も含まない。好ましくは、第３部分
は、可視インディケーターゾーン、下記染料が可逆的に
上記支持体に結合するように規定されたエリア内で上記
支持体に適用された水溶性染料、例えばエリスロシン
Ｂ、サフラニンＯまたはフェノールレッドをさらに含
む。液体先端が第２部分を横切り、そして第３部分に入
る場合は、上記インディケーターゾーンを通って流れ、
そして染料は、上記微孔性材料上の元の位置から液体に
より第２位置（完了ゾーン）へ運ばれ、そこで、液体先
端が第１部分、トレーサー部分および第２部分を通過し
てアッセイが完了したことを指示するものとして視覚的
に検出できる。第３部分が未結合トレーサーの検出のた
めの試薬を含むならば、上記インディケーターゾーンは
試薬と接触した後に液体先端により接触するエリア内に
位置する。

【００２０】別の態様においては、トレーサーは上記微
孔性材料上のトレーサー位置を規定するエリアに可逆的
に固定される。トレーサー部分は第１部分とバインダー
を含む第２部分の間に配置される。第１部分は上記微孔
性材料と直接液体伝達される。第１部分に適用された試
料は上記微孔性材料へはじかれ（ｗｉｃｋｅｄ）、そこ
でトレーサーと接触して混合される。トレーサー部分を
通って流れた後、液体はバインダーと相互作用するため
に毛管により第２部分へ移動し続ける。この態様は抗原
トレーサーを用いる抗体分析物のアッセイにおいて特に
利点を有し、わずかな量のトレーサーを用いてコストを
抑えることができる。

【００２１】本発明の現在好ましい態様のもっとも好ま
しいアッセイプロトコルは、抗体または抗原分析物の検
出のためのサンドイッチアッセイである。サンドイッチ
アッセイにおいては、トレーサー／分析物の複合体が第
２部分で固定され、かつ、検出されるので、バインダー
は通常過剰量存在することにより実質的にすべての複合
体が結合する。次に、標識シグナルの強度の検出は、存
在する分析物の量の定性、定量または半定量の指示とし
て使用してよい。

【００２２】例として、サンドイッチアッセイにおいて
検出すべき分析物が抗体ならば、トレーサーのリガンド
部分は該抗体分析物により認識かつ結合される抗原また
はハプテンであってよい。抗原またはハプテンは第２部
分に固定されたバインダーであってもよい。当業者であ
れば、抗体の検出のためのサンドイッチアッセイにおけ
るバインダーおよびトレーサーが抗原またはハプテンの
場合に、第２部分において結合させておくために、抗体
の分析物結合容量を飽和させるはずの量より低い量でト
レーサーが存在するであろうことは認識するであろう。
試薬の量に関するこのような日常の調節は当該技術分野
の範囲内である。別法として、トレーサーまたはバイン
ダーのいずれかは抗−分析物（Ａｂ）抗体であってよ
い。

【００２３】サンドイッチアッセイを実施するために
は、抗体を含む疑いのある試料を第１部分に適用し、そ
して該第１部分を通ってトレーサー部分へ毛管流により
移動させて、そこで標識トレーサーと混合する。存在す
るのならば、分析物の抗体はトレーサーのリガンド成分
に結合する。該液体がトレーサー部分を通ると、トレー
サーは液体と共にトレーサー部分から輸送される。もっ
とも好ましくは、該混合物をトレーサー部分から混合部
分へ輸送して微孔性材料および第２部分と接触する前に
抗体とトレーサーの結合のために十分な時間を与える。
第２部分においてバインダーは抗体／トレーサー複合体
と結合し、そして該複合体を第２部分に固定する。次
に、トレーサーの標識成分を第２部分において検出して
ポジティブなアッセイ結果を示すことができる。もしも
アッセイがネガティブ、即ち、試料中に抗体が存在しな
いならば、抗体／バインダー複合体は第２部分において
結合せず、トレーサーも検出されない。あらゆる未結合
の抗体、トレーサーおよび抗体／トレーサー複合体を含
む液体先端は毛管により第２部分から第３部分へと移動
し続け、そこでインディケーターゾーン中におかれた染
料に接触する。該液体先端はインディケーターゾーンか
ら完了ゾーンへ染料を運び、該液体染料が第２部分を通
過してアッセイが完了したことを示す。この方法を用い
て検出されるかもしれない抗体分析物の代表例は、ヒト
免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する抗体、風疹に対す
る抗体、サイトメガロウイルスに対する抗体、エプスタ
インバールウイルス（ＥＢＶ）に対する抗体およびライ
ム病の病原体ボレリアブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌ
ｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）に対する抗体である。

【００２４】反対に、抗原分析物が検出されるサンドイ
ッチアッセイは、該検出される抗原を特異的に認識しか
つ結合する抗体からなるトレーサーを用いてよい。第２
ゾーン中のバインダーはトレーサー抗体により結合され
るエピトープと異なる二次抗−抗原抗体であってよい。
そうでなければ、抗原に関するサンドイッチアッセイは
本質的に、抗体分析物を検出するための上記方法で実施
してよい。この方法を用いて検出されるかもしれない抗
原分析物の代表例は、グループＡストレプトコッカス抗
原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、黄体形成ホ
ルモン（ＬＨ）およびクラミジア抗原である。

【００２５】このアッセイは競争アッセイフォーマット
において実施してもよい。この態様において、分析物
（抗原、ハプテンまたは抗体のいずれか）は、第２部分
における結合に関して分析物と競争することができるリ
ガンドからなるトレーサーと混合される。したがって、
バインダーは、分析物が存在する場合に分析物とトレー
サーの総量に満たない量で存在するが、分析物が存在し
ない場合には本質的にすべてのトレーサーに十分結合す
る。これにより、分析物が存在する場合は、未結合のト
レーサーが第３部分で検出される。通常、分析物が抗体
の場合、トレーサーのリガンド成分は同じ抗体である
が、トレーサー抗体は分析物抗体と同じエピトープを認
識するか、またはバインダーに対する結合に関して該ト
レーサー抗体と競争するあらゆる抗体であってよい。分
析物が抗原またはハプテンの場合、トレーサーのリガン
ド成分は通常、同じ抗原またはハプテンであるが、分析
物の類似体であってもよい。分析物抗原またはハプテン
の類似体には、第２部分におけるバインダーへの結合に
関して分析物と競争することができる抗原またはハプテ
ンのあらゆる誘導体が含まれる。

【００２６】競争アッセイに関しては、トレーサー部
分、および必要であれば混合部分における適切なトレー
サーとの混合後、混合されたトレーサーと分析物は毛管
流により第２部分中のバインダーに接触した微孔性材料
中に輸送される。分析物が抗体の場合、バインダーは通
常、抗体またはその類似体により認識される抗原または
ハプテンである。抗原またはハプテンが分析物の場合、
抗原またはハプテンを認識する抗体が一般的である。抗
原分析物またはハプテン分析物に関するトレーサーとし
て分析物の類似体を用いる場合、抗体バインダーはその
類似体も認識し、かつ結合する。

【００２７】液体先端は微孔性材料により第２部分を通
って輸送され続け、そして、第２部分中の分析物とトレ
ーサーの競争結合および固定を許す。次に、未結合のト
レーサーおよび未結合の分析物は毛管により第３部分へ
流れ、そこで、必要であればトレーサーは付加的試薬と
接触して標識が検出される。例えば、標識が、発色反応
生成物を生成する酵素である場合、付加的試薬は適当な
酵素基質を含む。標識、例えば、蛍光染料、ラジオアイ
ソトープ、および吸収染料はさらなる反応なしに直接検
出され、そして通常は第２部分中に付加的試薬を必要と
しない。液体先端の進行はインディケーターゾーンから
固相支持体の完了ゾーンに染料も運び、そこで染料が視
覚化され、液体が第２部分と、存在するのならば第３部
分の試薬含有エリアの間を横切ったことを示す。これに
よりアッセイが完了したことが示される。

【００２８】アッセイフォーマットがサンドイッチアッ
セイであろうと競争アッセイであろうと、トレーサー標
識が染料の場合は、該アッセイ法が、トレーサー標識を
検出する部分において発色を安定化させる工程を含むこ
とが好ましい。これは、イムノキャピラリーアッセイに
おいては、標識が検出されるエリアへの液体の連続する
毛管流が標識からのシグナルを強く発色させ続けるため
である。このシグナルの「変化（ｄｒｉｆｔ）」は、時
間が経つにつれてネガティブな結果をまちがったポジテ
ィブな結果にさせるかもしれず、あるいは弱いポジティ
ブなシグナルを強いポジティブなシグナルにするかもし
れない。現在、毛管流に基づくイムノアッセイにおいて
このシグナルを止めるかまたは安定化させる便利な方法
はない。しかしながら、今、試料の添加後に吸湿性材料
を上記固相支持体に応用することによりシグナルの変化
（ｄｒｉｆｔ）が阻害され、そしてのちのアッセイ結果
の読み取りに関するシグナルの発色を安定化させる。第
２部分の上流に位置する固相支持体のエリアに吸湿性材
料を加えることが好ましく、もっとも好ましくは、試料
を添加する部位に加える。

【００２９】現在のアッセイにおいて発色を安定化させ
るために有用な吸湿性材料は、ポリソディウムアクリレ
ート（ＰＳＡ、ユナイテッドデシカンツ、Ｐｅｎｎｓａ
ｕｋｅｎ，ニュージャージーから市販されている）、Ｓ
ＥＰＨＡＤＥＸ（デキストランをエピクロロヒドリンで
架橋結合させて製造されたビーズ形態のゲル、ファルマ
シアファインケミカルズ、ピスカタウエイ、ニュージャ
ージーから市販されている）、および吸収性セルロース
誘導体、例えばＴＲＡＮＳＯＲＢセルロース系フィルタ
ー（アメリカンフィルトロナ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｉ
ｌｔｒｏｎａ）、リッチモンド、バージニア）を含む。
最も好ましいのは、ＳＥＰＨＡＤＥＸＧ−５０である。
本発明のこの側面をいかに操作するかという任意の特定
の理論により結び付けられることを意図するものではな
いが、出願人は、吸湿性材料が孔性支持体から液体を吸
収することによりシグナルの発色を安定化させ、即ち、
標識が検出される部分への液体およびトレーサーの毛管
流を妨害すると信じる。標識が検出される部分を液体先
端が横切った後に、選択された吸湿性材料を固相支持体
の第１部分に適用するか、または、実質的に試料が添加
された直後に上記選択された吸湿性材料を適用してよ
い。この発色安定法は、トレーサー標識が可視染料、例
えばラテックス粒子に結合されたかまたは組み入れられ
た染料を含む場合に特に有用である。

【００３０】上記材料および試薬は使用しやすいように
アッセイ装置の形態でパッケージされていることが好ま
しい。水平方向で使用されるそのような装置の例は図１
に例示されている。第１部分、トレーサー部分、混合部
分、第２部分、第３部分およびインディケーター部分を
伴う孔性支持体は適切な液体浸透可能な材料のハウジン
グ内に置かれる。成形可能なプラスチック、例えばポリ
スチレンが好ましいが、他の浸透可能な材料、例えばガ
ラスまたは金属も使用してよい。上記ハウジングは下部
セクションおよび（１）上部セクション（２）を含む。
孔性支持体はハウジングの下部部分に横たわり、そして
その中に多くの開口部を有する上部部分により覆われて
いる。これら開口部は孔性支持体に整列されており該支
持体のさまざまな部分（３−５）への視覚的接近または
試料の接近を提供する。今、図２を参照すると、試料部
分の開口部（５）は、第１ゾーン（６）からなる多孔性
材料への接近を提供し、そして該開口部の回りに一段高
い側面を有し、該側面はウエルを形成して液体試料の第
１ゾーンへの適用を促進する。第１ゾーンからなる該多
孔性材料は試料のインテリアエッジに対してきちんとフ
ィットしてそこへ適用された液体が本質的には第１部分
を通って流れることのみにより下のトレーサー部分に接
近する。上記支持体のトレーサー部分（７）および付加
的混合（８）部分からなる多孔性材料は第１ゾーンの下
の試料部分に整列され、これら材料を通る液体の流れ
は、装置の平面および第１部分の平面に実質的に対して
垂直となる。

【００３１】第２部分（９）を有する微孔性材料は、存
在するのならば混合部分のトレーサー部分からなる多孔
性材料に接触し、そして第１部分およびトレーサー部分
を通って液体の流れに対して実質的に垂直方向にハウジ
ングの中で広がる。好ましくは、該微孔性材料は液体浸
透材料の上部層（１０）と下部層（１１）の間におかれ
るが、液体浸透材料の例としてはポリエチレンテレフタ
レート（例えば、ＭＹＬＡＲ、アドヒーシブリサーチイ
ンコーポレイテッド、グレンロック、ペンシルバニアよ
り市販されている）またはポリエチレンが挙げられる。
該微孔性材料は液体浸透材料で覆われておらずトレーサ
ー部分または混合部分と接触することにより装置内の液
体の毛管流は分断されない。例示されたサンドイッチア
ッセイにおいては、検出窓（４）は微孔性材料の第２部
分に一列に並んでハウジングの上部セクション内に提供
され、そこへの視覚接近（ｖｉｓｕａｌ ａｃｃｅｓ
ｓ）を提供する。検出窓により、図４に示された第２ゾ
ーンに結合したトレーサーの視覚化または検出が可能に
なり（１３）、サンドイッチアッセイにおけるポジティ
ブな結果を示す。競争アッセイにおいて使用される装置
においては、検出窓は第３部分のエリアに整列されてい
てよく、そこで未結合のトレーサーが検出できる。

【００３２】インディケーター染料（１２）は、液体が
第２部分を通過した後に、微孔性支持体上のインディケ
ーターゾーン内の、液体により接触されている位置にあ
る。別法として、インディケーター染料は、第２部分お
よび第３部分のエリアを通過した後に、液体により接触
されている微孔性支持体のエリア内にあってよく、そこ
で未結合のトレーサーは競争アッセイにより検出され
る。インディケーターゾーンはハウジングの上部セクシ
ョンの下に隠されており、かつ、この装置を用いてアッ
セイを行う前には見えないことが好ましい。アッセイを
作動させて液体先端がインディケーターゾーンを通過し
たとき、染料は毛管流により支持体に沿ってハウジング
の上部セクション内の完了窓（３）と列をなすように移
動し、そのとき完了窓により染料が視覚化される。これ
により、アッセイの首尾よい完了に必要な装置のすべて
の部分を液体先端が通過したことが示される。図４は、
インディケーター染料（１２）が完了窓（３）内の見え
るところに移動したところ、および第２部分（１３）お
よびポジティブコントロールエリア（１４）に固定され
たトレーサーを示すポジティブアッセイの完了を例示す
る。図５は、完全装置を用いた実験者による眺めとして
図４のポジティブアッセイを例示する。

【００３３】以下の実施例は本発明の特定の特徴を例示
するが、本発明の範囲を限定するよう意図されたもので
はなく本発明の範囲は特許請求の範囲により規定され
る。

【００３４】

【実施例】

実施例１ 例示的アッセイ装置の構成および使用法 約９×１０ｍｍ片の孔性ポリエチレン（１５−４５μ
ｍ、ＰＯＬＥＸ）（約１．５ｍｍ厚）を、染料を浸透さ
せた０．４−０．５ミクロンのラテックス微粒子（ＢＬ
ＵＥ ＤＹＥＤ ＬＡＴＥＸ、バングスラボラトリー
ズ、インディアナポリス、インディアナ）で標識した抗
−ＨＣＧ抗体からなるトレーサーで浸透させてトレーサ
ー部分を形成した。該トレーサー部分を、第２のポリエ
チレン９×１０ｍｍ片と孔性ポリエチレン９×１９ｍｍ
片の間にサンドイッチし、そして該ポリエチレンの堆積
物を、底に縁が並んだ約９×４６ｍｍの大きさのニトロ
セルロースのストリップの上部においた。該ポリエチレ
ン堆積物とニトロセルロースは、並んだ底の縁に沿って
おかれた、裏が接着性のＭＹＬＡＲ［ＡＳ−１１０ Ａ
ＣＲＹＬＩＣ ＳＹＳＴＥＭ（アドヒーシブズリサーチ
インコーポレイテッド、グレンロック、ペンシルバニア
より市販されている）］と共に支えられた。ポリエチレ
ンの大きい方の片の固定しない縁から約１０−１５ｍｍ
に、１μｌのＰＢＳ／５％グルコース中の１マイクログ
ラムの抗−ＨＣＧ抗体をニトロセルロース上にチェック
マークの形でスポットして乾燥させた。１μｌのＰＢＳ
中の５μｇのＨＣＧを抗−ＨＣＧ抗体のチェックマーク
に隣接した小さなドットにポジティブコントロールエリ
アとしてスポットし、そして乾燥させた。１μｌのエリ
スリオシンＢ（アルドリッヒケミカルズ社、ミルウオー
キー、ウイスコンシン）を、抗−ＨＣＧバインダーの上
部約５ｍｍにニトロセルロースを横切ってバンド内にお
いた（即ち、ポリエチレンの大きい方の片の上部の縁か
ら約１５−２０ｍｍ）。次に、図面に示すとおりに、製
造された固相支持体を成形されたポリスチレンハウジン
グの下部セクション内においた。ポリエチレンの小片、
抗−ＨＣＧチェックマーク／ＨＣＧドット、およびエリ
スリオシンＢのバンドの下流のニトロセルロースのエリ
アが並んだ、開口部を有するハウジングの上部セクショ
ンは支持体上部にかぶせられ、そして下部セクション上
にかませられた（ｓｎａｐｐｅｄ）。

【００３５】この装置を用いてＨＣＧに関するアッセイ
を実施するために、５滴（約３２０μｌ）の尿を試料ウ
エルに添加して吸着させた。１分後、エリスリオシンＢ
インディケーター染料が完了窓に現れ、アッセイの完了
を示した。そのときに、青いチェックマークが検出窓に
現れＨＣＧに関してポジティブな結果を示した。チェッ
クマークに隣接した青いドットもポジティブコントロー
ルとして見られた。ネガティブコントロール試料はプー
ルされたネガティブな尿またはＰＢＳからなり、そして
これらをアッセイシステムに供した場合、青いポジティ
ブコントロールのみが検出窓に現れた。

【００３６】実施例２ 発色の安定化 ＨＣＧのアッセイに関する図面において示されたのと同
様の装置を用いて発色の安定化のための方法を試験し
た。このアッセイは、抗−ＨＣＧ抗体とトレーサー標識
を含むトレーサーおよびバインダーがＢＬＵＥ ＤＹＥ
Ｄ ＬＡＴＥＸである、サンドイッチアッセイであっ
た。

【００３７】２５０ｍＩＵ／ｍｌのＨＣＧを含む５滴の
尿試料をアッセイ装置の試料部分に加え、そして染料が
インディケーター窓において視覚化されてアッセイの終
了を示すまでアッセイを実施した。そのとき、ＳＥＰＨ
ＡＤＥＸ Ｇ−５０を該試料部分に加えて満たした。コ
ントロールアッセイは試料部分にＳＥＰＨＡＤＥＸを加
えずに実施した。ネガティブコントロールアッセイはＨ
ＣＧを含まない５滴の尿を用いて実施した。

【００３８】アッセイ結果は１＋から４＋のスケールで
視覚的にスコアされた。ポジティブコントロールに関し
ては発色反応は最初に１−２＋と評価された。この強度
はＳＥＰＨＡＤＥＸで処理された装置中で４日間保持さ
れた。対照的に、ポジティブアッセイ装置にＳＥＰＨＡ
ＤＥＸを加えなかった場合、シグナルは４日間で漸次大
きくなった。

【００３９】ネガティブコントロールに関しては、最初
の試験結果はネガティブであった。しかしながら、アッ
セイ装置にＳＥＰＨＡＤＥＸを加えない場合、アッセイ
完了後１から４日間誤ったポジティブな結果が発色され
た。ＳＥＰＨＡＤＥＸ処理された装置は４日間ネガティ
ブであった。

【００４０】グループＡストレプトコッカス抗原に関す
る同様の実験のアッセイを実施してＰＳＡおよびＦＩＬ
ＴＲＯＮＡセルロースフィルターの安定化能力を試験し
た。この例においては、試料をアッセイ装置に加えた直
後（実質的に直後）に吸湿性材料を試料部分に加えた。
試料は、ラテックステスト（ＣＵＬＴＵＲＥＴＴＥ１０
ＭＩＮＵＴＥ、ベクトンディッキンソンアドヴァンス
トダイアグノスティックス、ボルチモア、メリーラン
ド）においてグループＡストレプトコッカス抗原に関し
てネガティブであるとされた、のどのスワブの亜硝酸抽
出物であった。

【００４１】グループＡストレプトコッカスに関してネ
ガティブなのどのスワブを亜硝酸で抽出した。この抽出
物５滴（約３２０μｌ）をアッセイ装置の試料ウエルに
加えた。液体が吸収されるやいなや、吸収材料（ＰＳＡ
またはＴＲＡＮＳＯＲＢ）をウエルに加えた。コントロ
ールアッセイにおいては吸収材料を加えなかった。イン
ディケーター染料が完了部分に現れ（アッセイの終了、
「ＥＯＡ」）、３、５、および１０分後、検出窓におけ
るアッセイ結果は１＋から４＋であることが視覚的に観
察された。添加吸収材料を含まない試料は実験時間内に
ネガティブからポジティブに変化するという顕著なつり
合いを示した。対照的に、ＰＳＡまたはＴＲＡＮＳＯＲ
Ｂを加えた試料はあやまったポジティブな結果において
増加を示さなかった。

【００４２】アッセイの感度に対する発色安定化の効果
を測定するために、抽出されたグループＡストレプトコ
ッカス抗原を５滴アッセイ装置に加え、そしてＰＳＡま
たはＴＲＡＮＳＯＲＢを含むかあるいは含まないＥＯＡ
と結果を比較した。吸収による感度の顕著な低下はみい
だされなかった。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の代表的装置の平面図である。

【図２】図２は、図１の線２に沿った代表的装置の断面
図である。

【図３】図３は、ハウジングの上部部分の開口部の位置
を示す、固相支持体の上部平面図である。

【図４】図４は、ポジティブアッセイ完了後の固相支持
体の上部平面図である。

【図５】図５は、ポジティブアッセイ完了を示す固相支
持体の上部平面図である。

フロントページの続き (72)発明者 アリ・ナクイ アメリカ合衆国メリーランド州21015，ベ ル・エア，カーギル・コート 610 (72)発明者 スティーヴン・ジェイ・ラヴェル アメリカ合衆国メリーランド州21204，ト ウソン，カンバレイ・サークル 724 エ イ７ (72)発明者 ケヴィン・ティー・カーンズ アメリカ合衆国メリーランド州21030，コ ッキースヴィル・レイク・ヴィスタ・サー クル 409 エイ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）多孔性材料の層からなる第１部分； （ｂ）該第１部分と下記トレーサー部分の間の液体の流
   れが上記第１部分の層の平面に対して実質的に垂直の方
   向であるように上記第１部分と液体伝達されているトレ
   ーサー部分であって、該トレーサー部分がその中に可逆
   的に固定されたトレーサーを有する孔性材料の層を含
   み； （ｃ）上記第１部分と上記トレーサー部分の液体の流れ
   の方向とは実質的に垂直の方向に下記孔性材料がトレー
   サー部分から液体をはじく（ｗｉｃｋ）ように上記トレ
   ーサー部分と液体伝達されている孔性材料； （ｄ）第２部分を規定するエリア内に、拡散しないよう
   に上記孔性材料上に固定された下記分析物のためのバイ
   ンダー；および （ｅ）液体と第２部分の接触後に液体により接触された
   インディケーターゾーン内で上記孔性材料に可逆的に結
   合した視覚化染料からなる、液体中の分析物を検出する
   ための固相支持体からなる装置。
2. 【請求項２】第１部分とトレーサー部分の孔性材料がニ
   トロセルロース中の孔性ポリエチレンおよび微孔性材料
   である、請求項１記載の装置。
3. 【請求項３】上記トレーサー部分と下記混合部分の間の
   液体の流れが上記トレーサー部分層の平面に実質的に垂
   直の方向であるように、上記支持体がさらに上記トレー
   サー部分と液体伝達された混合部分を含むが、その際、
   該混合部分は多孔性材料の層からなる、請求項１記載の
   装置。
4. 【請求項４】第１部分、トレーサー部分および混合部分
   の多孔性材料が孔性ポリエチレンである、請求項３記載
   の装置。
5. 【請求項５】上記微孔性材料がニトロセルロースであ
   る、請求項４記載の装置。
6. 【請求項６】上記第１部分に整列された第１開口部、上
   記第２部分に整列された第２開口部、および上記インデ
   ィケーターゾーンを通って流れた後の液体により接触さ
   れた上記微孔性材料のエリアに整列された第３開口部を
   含む、上部セクションを有する液体非透過性ハウジング
   により上記固相支持体が囲まれている、請求項１または
   ３記載の装置。
7. 【請求項７】上記トレーサーが染料でコートされた粒子
   を含む標識からなる、請求項１記載の装置。
8. 【請求項８】上記トレーサーおよびバインダーが上記分
   析物に結合する抗体である、請求項１または３記載の装
   置。
9. 【請求項９】上記第１部分に整列された第１開口部、上
   記第２部分と液体伝達されており上記第２部分を通って
   流れた後の液体により接触された上記微孔性支持体第３
   部分に整列された第２開口部、および上記インディケー
   ターゾーンを通って流れた後の液体により接触された上
   記微孔性材料のエリアに整列された第３開口部を含む、
   上部セクションを有する液体非透過性ハウジングにより
   上記固相支持体が囲まれている、請求項１または３記載
   の装置。
10. 【請求項１０】上記トレーサーが上記分析物または該分
    析物の類似体であり、そして、上記バインダーが上記分
    析物に結合する抗体である、請求項１または３記載の装
    置。