JPH09502253A - 光活性化化学発光基質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 物質を標識する方法を記載している。本方法は、この物質を（ａ）照射時にシングレット酸素を発生できる光増感剤、および（ｂ）シングレット酸素により活性化できる化学発光化合物、ただし、該光増感剤および化学発光化合物は粒子状基質または非粒子状固体基質に含ませたものである、と合わせることを含む。粒子状基質は、固体または流体であることができる。本方法は、基質の照射時に実現できる遅延した発光を発生させることができる。本方法は、分析物を含む可能性のある媒体中の分析物の測定に適用する。１つの方法は、分析物を含む可能性のある媒体を、特異的結合対（ｓｂｐ）メンバーの複合体が、分析物の存在、および、ｓｂｐメンバー複合体が、化学発光および光増感剤特性を共に有する単一の組成物を標識として使用することにより形成したかどうかの測定、に相関して形成される条件に付すことを含む。光増感剤特性の活性化時に、シングレット酸素が発生し、化学発光特性を活性化する。組成物およびキットもまた記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】 光活性化化学発光基質 発明の背景 １．発明の分野 本発明は、光活性化化学発光基質、ならびに試料中の分析物を測定するための 方法、組成物および測定用キットに関する。 臨床診断分野は、容易かつ正確に測定できる物質（分析物）並びに測定方法の 多様性に関して、近年幅広い展開がなされてきた。液体中の低濃度の物質の存在 を検出するための便利で信頼でき、かつ危険ではない手段が望まれている。臨床 化学では、これらの物質は、１０^-12モル以下の濃度で体液中に存在することが ある。これらの低濃度物質を検出する難しさは、利用できる試料のサイズが相対 的に小さいことにより増大する。 アッセイを発展させる場合に多くの検討がなされる。一つの検討課題は、分析 物の濃度の変化に対するシグナル応答である。第２の検討課題は、アッセイのプ ロトコールを実施できる容易さである。第３の検討課題は、試料間の干渉の変化 である。試薬の製造および精製の容易さ、設備の入手可能性、自動化の容易さ、 および対象物質との相互作用は、有用なアッセイの開発において付随的な検討課 題となる。 広義の技術分野は、分析物の存在の機能として標識されたリガンドの特定の空 間的極性構造に特異的に結合することができる受容体の使用に関する。受容体に より観測された結合の効果は、標識に応じて異なる。ある場合には、受容体の結 合は、単に結合および非結合標識リガンド間の分子量の区別を提供するだけであ る。他の場合には、受容体の結合は、遊離標識リガンドから結合標識リガンドの 分離を容易にするかまたは、標識から得られるシグナルの性質に影響を及ぼし、 シグナルが標識リガンドに結合した受容体量に応じて変化し得るようにする。別 の変法は、受容体を標識し、リガンドを非標識にすることである。別法としては 、標識がきわめて接近したとき相互作用するか、もしくは存在するリガンドの量 が受容体の標識が相互作用できる程度に影響を及ぼす場合は、受容体およびリガ ン ドを両方とも標識するか、または、異なる受容体を異なる標識で標識する。 異なるリガンドの幅広いスペクトルに適用することができるか、または、他の 方法が容易に適用できない特異な場合に使用することができる、新しい正確な技 術の絶えまない必要性がある。 均一系イムノアッセイは、以前は小分子量のものについて記載されている。こ れらのアッセイは、シバのフラット（商標）アッセイ、エミット（商標）アッセ イ、酵素チャネリングイムノアッセイおよび蛍光エネルギー転移イムノアッセイ （ＦＥＴＩ）、酵素阻害イムノアッセイ（ホフマン・ラロシェおよびアボット・ ラボラトリーズ）、蛍光分極イムノアッセイ（ダンドリッカー）、その他を含む 。これらの全方法は、感度が限られており、ＦＥＴＩおよび酵素チャネリングを 含むほんのわずかしか大型の多エピトープ分析物には適しない。 蛍光化合物および化学発光化合物のような発光化合物は、光を放射する能力が あるため、アッセイ分野において幅広く適用できる。この理由で、発光体は核酸 アッセイおよびイムノアッセイのようなアッセイの標識として利用されている。 例えば、特異的結合対のメンバーは、発光体にコンジュゲートし、様々なプロト コールが採用される。発光体コンジュゲートは、分析物を含む可能性のある試料 中の分析物量に関連して、固相および液相間で分配することができる。いずれか 一方の相の発光を測定することにより、観測発光レベルを試料中の分析物濃度に 関連させることができる。 リポソームおよび赤血球ゴーストのような粒子は、カプセル化水溶性物質の担 体として利用されている。例えば、リポソーム類が、薬物をリポソーム製剤中に 密封し処置すべき患者に投与する薬剤送達システムのような、多様な用途のため に、生物学的に活性のある物質をカプセル化するために使用されている。 ラテックスビーズおよびリポソームのような粒子はまた、アッセイにも利用さ れている。例えば、均一系アッセイでは、酵素が抗体または抗原で標識されたリ ポソームの水相で密封する。リポソームは、試料および成分が存在すると、酵素 を遊離させる。水相小胞内にカプセル化した水溶性蛍光もしくは非蛍光染料また は脂質の脂質二重層に溶解した脂溶性染料を有する抗体または抗原標識リポソー ムはまた、表面に結合した抗体または抗原の免疫化学反応に携わることができる 分析物のアッセイに利用されている。界面活性剤は、リポソームの水相から染料 を遊離するのに使用されている。 化学発光標識は、リガンド結合アッセイにおいて格別の感度を提供するが、１ つまたはそれ以上の化学的活性化段階が通常必要とされる。蛍光標識はこの欠陥 がないが、感度は低い。 化学発光標識は、結合相手に共有的に結合しており、化学活性化で光を放射す る基のイムノアッセイおよび核酸アッセイについて記載されている。アクリジニ ウムエステルを利用する核酸アッセイキットが、ジェンプローブペイス２システ ム（商標）、サンディエゴ、カリフォルニア）により市販されており、この型の 標識を使用するマジックライト（商標）イムノアッセイキットが、チバ−ガイギ ー（バーゼル、スイス）により市販されている。標識核酸プローブから第２プロ ーブに結合する蛍光受容体へのエネルギー転移は、ヘラー等、ＩおよびII（下記 参照）のサンドイッチ核酸アッセイに記載されている。マギオＩ（下記参照）は 、イムノアッセイの同様の製造を述べている。ポリヌクレオチドに共有的に結合 した発光体からインターカレートする発蛍光団へのエネルギー移転は、ヘラー等 、IV（下記参照）により記載されている。ポリヌクレオチド上の挿入染料から発 光体への転移は、近年カルデュロ等（下記参照）により最近記載された。さらに 、マックカプラ（下記参照）は、標識としての光増感剤の使用を記載しており、 その光増感剤は、発熱時に光を産生する化合物と順番に反応するシングレット状 態に酸素を活性化する。 ２．関連技術の簡単な説明 ヨーロッパ特許出願第０ ４２１ ７８８ Ａ２号は、液体試料中の分析物の存 在または量を測定するハロペルオキシダーゼ−酸−オキシダント化学発光アッセ イシステムを記載している。そのシステムは、ハロペルオキシダーゼ、ハライド 、オキシダントおよび化学発光基質を利用する。指示薬システムは、化学発光基 質と反応して反応産生物を酸化した励起状態をもたらす高反応性シングレット分 子酸素のシンセサイザーとして作用する。励起状態反応産生物をその後、各反応 関 与物の量に関連する量において、測定できる光の放射をもつ低いエネルギー状態 に緩和する。化学発光基質は、標識として使用し、蛋白質、ホルモン、ハプテン 、ステロイド、レクチン、核酸、代謝物質、抗原、抗体、核酸プローブ、バクテ リオファージまたはウイルスのようなリガンドに結合する（第１０頁、第８−１ ７行）。 オサー等、アンゲバンテ・ヘミー・インターナショナル・エディション・イン グリッシュ、第２９巻、第１１６７−１１６９頁（１９９０年）は、純液相での 三重Ｔｂ（III）複合体のＤＮＡ鋳型媒介形成によるＤＮＡハイブリッド形成の 非放射性アッセイを記載している。 米国特許第５,０１７,４７３号は、光吸収物質を使用する均一系化学発光イム ノアッセイを記載している。 ヨーロッパ特許出願第０,３４５,７７６号（マックカプラ）は、標識として増 感剤を利用する特異的結合アッセイを記載している。光増感剤は、１つまたはそ れ以上の波長または他の化学的または物理的剌激（例えば、電気転移、電気分解 、電界発光またはエネルギー転移）の放射をもつ励起により刺激される場合に、 励起状態に達する任意の部分を含み、その励起状態は、（ａ）分子酸素との相互 作用時に、シングレット酸素を産生し、または（ｂ）ロイコ染料との相互作用時 に、過酸化水素の産生をもたらす分子酸素との相互作用によりその本来の励起し ていない状態にもどすことができる還元型を呈する。どちらか一方の励起した光 増感剤との相互作用は、試薬の添加で検出できるシグナルを産生する。 ヨーロッパ特許出願第０,０７０,６８５号（ヘラー等、Ｉ）は、非放射エネル ギー転移による診断の均一系核酸ハイブリッド形成を記載している。 光放射ポリヌクレオチドハイブリッド形成診断方法は、ヨーロッパ特許出願第 ０,０７０,６８７号（ヘラー等、II）に記載されている。 ヨーロッパ特許出願第０,２３２,９６７号（モリソンＩ）は、標的ポリヌクレ オチドストランドのアッセイを実施する方法および組成物を記載している。その 方法は、試料と、第１および第２ポリヌクレオチドプローブを含む試薬との接触 を含む。第１および第２プローブは、それらのプローブがお互いに結合する第１ 位置、およびそれらのプローブが標的に結合する第２位置を呈することができる 。それらのプローブは、位置する２つのうちの１つであるプローブを示すシグナ ルを産生するために相互作用することができる標識部分を含む。 ヨーロッパ特許出願第０,３１５,３６４号は、流体の抗原または抗体の存在ま たは濃度を測定する免疫化学的アッセイを記載している。そのアッセイは、（ａ ）第１標識抗体または抗原、第２標識抗体または抗原、および測定されるべき抗 原または抗体の三重複合体の形成、および（ｂ）抗原物質に結合しているために 互いに接近していることによって増大した第１標識および第２標識間の相互作用 により、少なくとも１つの基質の存在中に、産生されたシグナルを検出すること を含む。 ヨーロッパ特許出願第０,２２９,９４３号（ヘラー等、III）は、ポリヌクレ オチドハイブリッド形成アッセイのための蛍光ストークスシフトプローブを記載 している。 米国特許第４,２２６,９９３号（バッカー等）は、化学発光フタルヒドラジド 標識コンジュゲートの合成の中間体として利用される免疫官能付与性フタルヒド ラジドを記載している。コンジュゲートは、液体媒体のリガンドまたはそれらの 特異的結合相手を測定する特異的結合アッセイの試薬として利用される。 他の関連する技術文献は、ヨーロッパ特許出願第０,５１５,１９４号に記載さ れている。 発明の要約 本発明は、最広義の態様では、例えば（ａ）媒体中の分析物、（ｂ）流体シス テム中の漏出、（ｃ）機械部分の摩耗、または（ｄ）光の放射について、それら が存在するかまたは存在しないような状況を測定する方法を含む。その方法は、 該状況から生じるかまたはそれに付す組成物を照射することを含む。その組成物 は、（ａ）照射時にシングレット酸素を発生することができる光増感剤および（ ｂ）シングレット酸素により活性化することができる化学発光化合物を含む非粒 子状の固体基質または粒子状の基質を含む。粒子状の基質は、固体または流体で ある。 他の態様では、本発明は、（ａ）媒体中の分析物の存在または量に相関する分 子、（ｂ）流体システム中の流体物質、または（ｃ）機械部分からの摩耗物質、 （ｄ）細胞、または（ｅ）生物学的組織のような物質を標識する方法に関する。 本方法は、これらの物質を（１）照射時にシングレット酸素を発生することがで きる光増感剤、および（２）シングレット酸素により活性化することができる化 学発光化合物、と合わせることを含んでなる。光増感剤および化学発光化合物は 、非粒子状固体または粒子状固体または流体であることができる基質中に包含さ れたものである。 本発明の他の態様は、物質を検出する方法である。この方法は、（ａ）これら の物質を（１）照射時にシングレット酸素を発生することができる光増感剤、お よび（２）シングレット酸素により活性化することができる化学発光化合物と合 わせることを含んでなる。光増感剤および化学発光化合物は、固体基質または粒 子状固体または流体中に含められ、（ｂ）２００−１０００ｎｍの波長の光での これらの物質を照射し、さらに（ｃ）化学発光化合物により放射された光を検出 する。 本発明の他の態様は、遅延した発光を発生させる方法に関する。その方法は、 （１）照射時にシングレット酸素を発生することができる光増感剤、および（２ ）シングレット酸素により活性化することができる化学発光化合物、を含めた非 粒子状、固体基質または粒子状固体または流体基質を含む組成物を照射する段階 を含んでなる。 本発明の他の態様は、分析物を測定する方法に関する。この方法は、分析物を 含む可能性のある媒体を、特異的結合対（ｓｂｐ）メンバーの複合体が分析物の 存在と相関して形成される条件に付し、そして光増感剤特性の活性化時にシング レット酸素が発生し、化学発光特性を活性化するような化学発光および光増感剤 特性を共に有する単一の組成物を標識として使用することにより、ｓｂｐメンバ ー複合体が形成したかどうかを測定する段階を含んでなる。 分析物を測定する方法の他の態様は、（ａ）（１）上記分析物を含む可能性の ある媒体と、（２）光増感剤特性の活性化時にシングレット酸素が発生し、化学 発光特性を活性化するような光増感剤および化学発光特性を共に有する単一組成 物とアソシエートする第１特異的結合対（ｓｂｐ）メンバー、ただし、この第１ ｓｂｐメンバーは、分析物または分析物の存在に相関して複合体を形成する第２ ｓｂｐメンバーに結合できるものである、を含む標識試薬とを組合わせで提供し 、（ｂ）光増感剤特性を活性化し、さらに（ｃ）化学発光特性により発生した発 光量（その量は、媒体の分析物量に相関する）の検出することを含む。 本発明により分析物を測定する他の方法は、（ａ）分析物を含む可能性のある 媒体と、（２）照射時にシングレット酸素を発生することができる光増感剤およ び、光増感剤の活性化時にシングレット酸素が発生し、化学発光特性を活性化す るような、シングレット酸素により活性化することができる化学発光化合物を有 する粒子とアソシエートする、第１特異的結合対（ｓｂｐ）メンバー、ただし、 この第１ｓｂｐメンバーは、分析物または分析物の存在に相関して複合体を形成 する第２ｓｂｐメンバーに結合できるものである、を含む標識試薬とを組合わせ で提供し、（ｂ）光増感剤を活性化シ、さらに（ｃ）化学発光化合物により発生 した発光量（その量は、媒体中の分析物量に相関する）を検出することを含む。 上記方法の好ましい態様は、少なくとも１つの上記光増感剤および上記化学発 光化合物が上記基質に共有的に連結している場合である。 本発明の別の態様は、活性化時にシングレット酸素を発生することができる光 増感剤、およびシングレット酸素により活性化できる化学発光化合物を含めた非 粒子状固体基質または粒子状固体または流体を含む組成物である。 本発明による他の組成物は、シングレット酸素を発生することができる光増感 剤、およびシングレット酸素により活性化できる化学発光化合物を含めた、固体 または流体のいずれかの粒子を含むものであって、その粒子は、分析物の検出に 有用な分子に結合しているものである。この分子は、特異的結合対のメンバーで ある。 本発明の他の態様は、活性化時にシングレット酸素を発生することができる光 増感剤、およびシングレット酸素により活性化できる化学発光化合物を含めた油 滴、リポソームおよび乳化剤からなる群から選択される流体粒子を含む組成物で ある。 本発明の他の態様は、発光組成物により放射された光強度を検定する方法であ る。この方法は、（ａ）照射時に光を放射できる発光組成物と、本発明の上記組 成物の１つとを媒体中で組合わせ、その際、組成物の１つは、光により活性化す る場合、他の組成物の衰退時間より実質的に大きい光放射の衰退時間をもつもの であり、（ｂ）発光組成物および本発明の組成物を活性化するために媒体を照射 し、（ｃ）短い方の衰退時間をもつ活性化組成物の衰退中に放射した光の強度を 測定し、（ｄ）段階（ｃ）の測定後および短い方の衰退時間をもつ活性化組成物 の少なくとも部分的な衰退後に放射された光の強度を測定し、さらに（ｅ）短い 方の衰退時間をもつ活性化組成物の衰退中に放射された光の強度と、内部検定に 提供するための段階（ｄ）で放射された光の強度と比較する各段階を含む。段階 ｂおよびｃは、段階ｄより前に１回またはそれ以上繰り返してもよい。ある態様 では、本発明の活性化組成物は、短い方の衰退時間をもつ。本発明の別の態様は 、上記組成物の１つおよび特異的結合対のメンバーを含むキットである。 具体的実施態様の記載 本発明は、光増感剤および化学発光化合物を含む、固体基質または固体または 流体粒子である組成物、を入手可能にする。これらの組成物の照射は、その発光 衰退の寿命が、化学発光化合物の構造、固体物質または粒子の組成物、化学発光 化合物とシングレット酸素との反応時に生成した分子、通常ジオキセタン類の分 解率を増大する温度および活性化剤の存在を含む多くの因子により決まってくる 遅延した発光を生ぜしめることができる。これらの組成物は、例えば乾燥状態で 細胞表面に結合シたとき、またはそれらが安定である他の媒体中で発光すること ができる。 これらの組成物は、最初に活性化し、次いで活性化後数秒ないし数分で検出で きるため、例えば非常に感度の高いトレーサーとして使用することができる。例 えば、これらの組成物は、流体中に懸濁する場合、液体またはガスであり得る流 体システムの漏出を追跡するのに使用できる。漏出を検出するトレーサーの適用 は、当業者によく知られている。一般に、本発明の組成物の約１０^-14−１０^-2 ％を、液体またはガス中に分散させる。次に、流体は、光で照射して光増感剤を 活性化し、その後この流体を本システムに通す。この適用では、以下に記載する 技術の１つを使用して発光を遅延させることが望ましい。本システムは、漏出が 存在するかどうかの測定を逃れたかもしれないどんな発光をも試験する。 これらの組成物はまた、散布剤として法犯罪学に利用することもできる。かか る目的のための散布剤の使用は非常によく知られており、本書に記載するまでも ない。この目的には、本組成物を粒子状とし、直径約１.０１−１０μｍとする 。粒子中の光増感剤および化学発光化合物の濃度は、一般に約１０^-5Ｍないし１ ０^-1Ｍとする。 本発明の組成物の他の使用例を下記するが、例示としてであり、限定されるも のではない。これらの組成物は、摩耗した物質の検出により摩耗査定を可能にす るため機械部分に含ませることができる。それらはまた、光線量計または固体蛍 光検定計としても使用できる。線量計として使用する場合、シングレット酸素と 化学発光化合物との反応により形成したジオキセタンが、組成物が加熱されるま で発光が起こらないほど充分に安定であることがしばしば望ましい。好ましくは 、これらの適用では、組成物はフィルム形状である。組成物はまた、光源および 光度計を検定するのにも使用できる。一般に、本発明の粒子状組成物は、これら の数値が他の物質のより早い衰退時間との比率をはかり、光強度測定および光電 子倍増適用での検定を提供するのに使用できるように、比較的に長い衰退時間を もつように選ばれる。 本発明の粒子状組成物は、それらが標識としてまたは標識した試薬の１部分と して使用することができる場合、診断アッセイの分野で特定の適用が見られる。 多くの場合、組成物は、その表面に結合する特異的結合対（ｓｂｐ）のメンバー をもつ。ｓｂｐメンバーは、分析物または、その存在が分析物の存在を示す分子 に結合して、複合体を形成することができる。この複合体は、標識を照射し、そ れに伴って放射する光をモニターすることにより検出できる。このアッセイは、 競合またはサンドイッチモード、またはそれらのバリエーションで実施できる。 検出すべき分子が細胞に関連する場合、細胞は本発明の粒子状組成物で標識で きる。例えば、本発明の組成物は、細胞の表面上のｓｂｐメンバーに相補的なＳ ｂｐメンバーを含むことができる。標識した細胞を照射し、その後それ以上照射 しないで顕微鏡を通して見ることができる。結果として、蛍光顕微鏡検査で重大 な問題であるバックグラウンド蛍光を避けることができる。 本発明の組成物は、蛍光測定法の内部検定に利用することができる。発光が媒 体の照射により生成するアッセイ培地中にこれらの組成物の粒子を含めることに より、これらの組成物は、アッセイで生成した放射とは検出できるほど異なる放 射を生成する。この相違は、異なる波長の放射、または発光の異なる衰退速度の 結果であり得る。 例えば、蛍光イムノアッセイでは、蛍光強度を最初に測定する。媒体の照射を 止め、本発明の組成物から放射する発光を、光強度、検出器の感度、および試料 干渉の正確な内部標準を提供するために測定する。これらの組成物は、ヨーロッ パ特許公開第０,５１５,１９４号（ＥＰ−５１５,１９４）に記載された、アッ セイの内部および外部検定と同様の方法で利用することができる。その点で、上 記したように、本発明の粒子状組成物は、ＥＰ−５１５,１９４の物質の衰退時 間と比較する場合、相対的に長い衰退時間をもつように選ぶことができる。結果 として、本粒子状組成物は、ＥＰ−５１５,１９４の物質を利用するアッセイの 内部検定に使用することができる。ＥＰ−５１５,１９４の物質と本発明の粒子 状組成物とを含有する媒体は照射することができ、照射に続いて放射した光強度 を測定することができ、ＥＰ−５１５,１９４の物質からの放射を部分的にまた は完全に衰退させるために充分な時間を経過させることができ、媒体はその後再 び照射することができ、光強度を測定し、放射を所望により衰退させ、この過程 は、測定の信頼性を最大にするのに充分なだけ何度も繰り返すことができる。最 終経路に続いて、本粒子状組成物からようやく主として放射してくる光の強度は 、本粒子状組成物の衰退時間が非常に長いので、独立して測定することができる 。照射期間の経過中に本粒子状組成物により放射した残留光強度は、照射光強度 に照射時間をかけたものに正比例する。ＥＰ−５１５,１９４の放射物質の衰退 の前に測定した光強度は、内部検定に供する本粒子状組成物の残留強度との比率 を はかることができる。逆に、本組成物の崩壊時間をＥＰ−５１５,１９４の組成 物の衰退時間より短くすることができ、急速に衰退する光強度が参照として役立 ち残留光強度がＰ−５１５,１９４物質からのものであることを除いて、同様の 操作を検定に使用することができる。 光強度は幅広く変化し得る。一般に、定常状態に達するまで照射を実施できる 急速衰退種では、光源が明るければ明るいほど、多くの活性化種が定常状態で存 在し、続いて起こる放射の強度が強くなる。低速衰退組成物では、照射期間が長 ければ長いほど、多くの活性化種が蓄積され、放射の強度が強くなる。この場合 では、照射および光強度の時間を犠牲にすることができる。前者の場合では、光 強度は重要である。照射は、１マイクロ秒から２０分、好ましくは０.１から６ ０秒、さらに好ましくは、０.１から１０秒、通常約１秒、実施できる。光源は 、多波長であり得るが、その場合は瀘過して短波長の光を除去する。例えば、６ ５０カットフィルターとともにタングステン−ハロゲンランプ（１００ないし１ ,０００ワット）を使用できる。別法としては、Ｈｅ／Ｎｅレーザー源を利用す ることができる。他のやり方では、５ないし１００ｍワット出力の通常６３０ｎ ｍまたはそれ以上のＬＥＤを使用する。本書で以下に記載する試験は、直接試料 に導かれた４００ワットハロゲンランプ光を使用する。 分析物のアッセイは、分析物またはその存在が分析物の存在を示すｓｂｐメン バーが結合しており、標識として使用した本発明の粒子状組成物を、未結合組成 物から分離することにより達成できる。分離した結合または未結合画分のいずれ かを、通常、光の照射により、光増感剤を活性化するために処理した後、その画 分の発光を試験する。化学発光化合物の放射は、触媒および／またはエネルギー 受容体で修飾することができ、それらは本発明の組成物中に含めることができる 。エネルギー受容体は、蛍光であるべきであり、通常放射の波長を修飾する。触 媒は、通常、放射の割合および／または効率を増加する。蛍光および触媒特性は 、同じ化合物中にまたは異なる化合物中にで存在し、それらの１つまたは両方が 本発明の組成物に含まれ得る。 主題のアッセィは、簡単で、効果的に再現できる方法で、試料中の幅広い多様 性のある分析物を検出し、測定するための便利な方法を提供し、それは反応中に 生成する光の量を測定するための目視検査またはありきたりの装置を使用するこ とができる。 さらに本発明の具体的な態様の記載を進める前に、多数の用語を定義し、詳細 に述べる。 分析物：検出すべき化合物または組成物。分析物は、特異的結合対（ｓｂｐ） のメンバーであり得、さらにリガンドでもあり得るが、それは一価（モノエピト ープ）または多価（ポリエピトープ）性で、通常、抗原またはハプテンであり、 また少なくとも共通エピトープまたは決定基部位を共有する、単一化合物または 多種化合物である。分析物は、細菌のような細胞、またはＡ、Ｂ、Ｄ等のような 血液型抗原を有する細胞、またはＨＬＡ抗原、または例えば細菌、真菌、原生動 物またはウイルスのような微生物等の一部であり得る。 多価リガンド分析物は、ふつうポリ（アミノ酸）、すなわち、ポリペプチドお よび蛋白質、多糖類、核酸およびそれらの組合わせである。それらの結合は、細 菌、ウイルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、核、細胞膜及び同種物の成分 を含む。 多くの場合、主題の発明に適用できるポリエピトープリガンド分析物は、少な くとも約５,０００、さらに通常は少なくとも１０,０００の分子量を有する。ポ リ（アミノ酸）カテゴリーでは、対象となるポリ（アミノ酸）は、一般的に約５ ,０００から５,０００，０００の分子量、さらに一般的には約２０，０００から １,０００,０００の分子量を有する。対象となるホルモンでは、分子量は通常約 ５,０００から６０,０００の範囲内である。 幅広い種類の蛋白質が、類似の構造特徴を有する蛋白質、特定の生物学的機能 を有する蛋白質、特定微生物、特に病原性微生物等に関連した蛋白質の部類に属 するとみなされる。そのような蛋白質は、例えば、免疫グロブリン類、サイトカ イン類、酵素類、ホルモン類、癌抗原類、栄養マーカー類、組織特異的抗原類を 含む。 次記は構造関連の蛋白質分類である。： プロタミン類、ヒストン類、アルブミン類、グロブリン類、硬蛋白質類、リン蛋 白質類、ムコ蛋白質類、色素蛋白質類、リポ蛋白質類、核蛋白質類、糖蛋白質類 類、Ｔ細胞受容体類、プロテオグリカン類、ＨＬＡ、未分類蛋白質類（例えばソ マトトロピン、プロラクチン、インスリン、ペプシン）。 ヒト血漿中に見出される多数の蛋白質は、臨床的に重要であり、 プレアルブミン、アルブミン、α₁−リポ蛋白質、α₁−抗トリプシン、α₁−糖 蛋白質、トランスコルチン、４.６Ｓ−ポストアルブミン、トリプトファン欠乏 α₁−糖蛋白質、α₁Ｘ−糖蛋白質、チロキシン結合グロブリン、インター−α− トリプシン阻害剤、Ｇｃ−グロブリン（（Ｇｃ１−１）、（Ｇｃ２−１）（Ｇｃ ２−２））、ヘプトグロビン（（Ｈｐ１−１）、（Ｈｐ２−１）（Ｈｐ２−２） ）、セルロプラスミン、コリンエステラーゼ、α₂−リポ蛋白質（類）、ミオグ ロビン、Ｃ−反応蛋白質、α₂−マクログロブリン、α₂−ＨＳ−糖蛋白質、Ｚｎ −α₂−糖蛋白質、α₂−ノイラミノ糖蛋白質、エリスロポイエチン、β−リポ蛋 白質、トランスフェリン、ヘモペキシン、フィブリノーゲン、プラスミノーゲン 、β₂−糖蛋白質Ｉおよびβ₂−糖蛋白質II、 免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）またはγＧ−グロブリン、分子式：γ₂κ₂またはγ₂ λ₂、 免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）またはγＡ−グロブリン、分子式：（α₂κ₂）ⁿま たは（α₂λ₂）ⁿ）、 免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）またはγＭ−グロブリン、分子式：（μ₂κ₂）⁵ま たは（μ₂λ₂）⁵）、 免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）またはγＤ−グロブリン（γＤ）、分子式：（δ₂ κ₂）または（δ₂λ₂）、 免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）またはγＥ−グロブリン（γＥ）、分子式：（ε₂ κ₂）または（ε₂λ₂）、 遊離κおよびλＬ鎖、 補体因子：Ｃ'１（例えばＣ'１ｑ、Ｃ'１ｒ、Ｃ'１ｓ）、Ｃ'２、Ｃ'３（例えば β₁Ａ、α₂Ｄ）、Ｃ'４、Ｃ'５、Ｃ'６、Ｃ'７、Ｃ'８、Ｃ'９ を含む。 重要な血液凝固因子は、 国際称号 名称 Ｉ フィブリノーゲン II プロトロンビン IIａ トロンビン III 組織トロンボプラスチン ＶおよびＶＩ プロアクセレリン／Ａｃグロブリン ＶII プロコンベルチン VIII 抗血友病グロブリン（ＡＨＧ） ＩＸ クリスマス因子 血漿トロンボプラスチン成分（ＰＴＣ） Ｘ スチュアート−プラウワー因子 オートプロトロンビンIII ＸＩ 血漿トロンボプラスチン前駆体（ＰＴＡ） ＸII ハーゲマン因子 XIII フィブリン安定化因子 を含む。 重要な蛋白質ホルモンは、 ペプチドおよび蛋白質ホルモン 副甲状腺ホルモン（例えばパラトルモン）、チロカルシトニン、インスリン、 グルカゴン、レラキシン、エリスロポイエチン、メラノトロピン（例えばメラニ ン刺激ホルモン；インターメジン）、ソマトトロピン（成長ホルモン）、コルチ コトロピン（副腎皮質刺激ホルモン）、チロトロピン、卵胞刺激ホルモン、黄体 形成ホルモン（間質細胞刺激ホルモン）、黄体腫刺激ホルモン（ルテオトロピン 、プロラクチン）、ゴナドトロピン（胎盤性性腺刺激ホルモン）のようなペプチ ド 組織ホルモン セクレチン、ガストリン、アンギオテンシンＩおよびII、ブラジキニンおよび ヒト胎盤性ラクトゲン シトキニン ＩＬ Ｉ、ＩＬ II、ＩＬ VI、ＥＧＦ、ＴＮＦ、ＮＧＦ 癌抗原 ＰＳＡ、ＣＥＡ、α−フェトプロテイン、酸性ホスファターゼ、ＣＡ１９.９ 、ＣＡ１２５ 組織特異性抗原 アルカリ性ホスファターゼ、ミオグロビン、ＣＰＫ−ＭＢ、カルシトニンおよ びミエリン塩基性蛋白質 神経下垂体からのペプチドホルモン オキシトシン、バソプレッシン、終結因子（ＲＦ）：ＣＲＦ、ＬＲＦ、ＴＲＦ 、ソマトトロピン−ＲＦ、ＧＲＦ、ＦＳＨ−ＲＦ、ＰＩＦ、ＭＩＦ を含む。 他の対象となる高分子物質は、ムコ多糖類および多糖類である。 実例となる微生物は、 コリネバクテリア属 コリネバクリテウム・ジフテリア 肺炎球菌属 ジプロコッカス・ニューモニアエ 連鎖球菌属 ストレプトコッカス・プロゲネス ストレプトコッカス・サリバルス ブドウ球菌属 スタヒロコッカス・オーレウス スタヒロコッカス・アルブス ナイセリア属 ナイセリア・メニンギティディス ナイセリア・ゴナレア 腸内細菌 大腸菌 アエロバクター・アエロゲネス 大腸菌型 クレブシエラ・ニューモニアエ 細菌 サルモネラ・チホサ サルモネラ・コレラエスイス サルモネラ菌属 サルモネラ・チフリムリウム ジゲラ・ジセンテリア シゲラ・シミツイ シゲラ・アルビノタルダ 赤痢菌属 シゲラ・フレクスナー シゲラ・ボイディ シゲラ・ソンネイ 他の腸内細菌 プロテウス・ブルガリス プロテウス・ミラビリス プロテウス属 プロテウス・モルガニ シュードモナス・アエルギノサ アルカリゲネス・ファエカリス ビブリオ・コレラエ ヘモフィルス−ボルデテラ群 インフルエンザ菌、デュクレー菌 ヘモフィルス・ヘモフィルス ヘモフィルス・アエギプティカス ヘモフィルス・パラインフルエンザ ボルデテラ・ペルツシス パスツレラ属 パスツレラ・ペスティス パスツレラ・ツラレウシス ブルセラ属 ブルセラ・メリテンシス ブルセラ・アボルタス ブルセラ・スイス 好気性胞子形成細菌 バシラス・アントラシス バシラス・スブチリス バシラス・メガテリウム バシラス・セレウス 嫌気性胞子形成細菌 クロストリジウム・ボツリヌス クロストリジウム・テタニ クロストリジウム・ペルテリンゲンスクロストリジウム・ノビイ クロストリジウム・セプティクム クロストリジウム・ヒストリチクス クロストリジウム・テルチウム クロストリジウム・ビフェルメンタンス クロストリジウム・スポロゲネス ミコバクテリア ミコバクテリウム・ツベルクロシス・ホミニス ミコバクテリウム・ボビス ミコバクテリウム・アビウム ミコバクテリウム・レプラエ ミコバクテリウム・パラツベルクロシス 放線菌属（真菌様菌） アクチノマイセス・イスラエリ アクチノマイセス・ボビス アクチノマイセス・ネスルンディ ノカルジア・アステロイデス ノカルジア・ブラシリエンシス スピロヘータ属 トレポネーマ・パリデュム スピリルム・ミナス トレポネーマ・ペルテニュー ストレプトバシルス・モノイリホルミス トレポネーマ・カラテウム ボレリア・レクレンティス レプトスピラ・イクテロヘモラジアエ レプトスピラ・カニコラ トリパノソーマ属 マイコプラズマ属 マイコプラズマ・ニューモニアエ 他の病原体 リステリア・モノシトゲンズ エリシペロトリックス・ルシオパチアエ ストレプトバシラス・マニリホルミス ドンバニア・グラヌロマティス バルトネラ・バシリホルミス リケッチア属（細菌様寄生虫） ウイルス リケッチア・プロバゼキ リケッチア・モオセリ リケッチア・リケッツイ リケッチア・コノリ リケッチア・アウストラリス リケッチア・シベリカス リケッチア・アカリ リケッチア・ツツガムシ リケッチア・ブルテッティ リケッチア・クインタナ クラミジア属（分類未能寄生虫細菌／ウイルス性） クラミジア剤（名称不詳） 真菌 クリプトコックス・ネオファルマンス ブラストミセス・デルマティディス ヒストプラズマ・カプスラタム コクシジオイデス・イミティス パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス カンジダ・アルビカンス アスペルギルス・フミガツス ムコール・コリムビファー（アブシディア・コリムビフェラ） リゾプス・オリザエ リゾプス・アリヒズス 藻菌類 リゾプス・ニグリカンズ スポロトリクス・ジエンキ フォンセセア・ペドロソイ フォンセセア・コムパクト フォンセセア・デルマティディス クラドスポリウム・カリオニ フィアロフォラ・ベルコサ アスペルギルス・ニデュランス マズレラ・ミセトミ マズレラ・グリセア アレステリア・ボイディ フィアロスフォラ・ジェアンセルメイ ミクロスポルム・ギプセウム トリクロフィトン・メタグロフィテス ケラチノマイセス・アジェロイ ミクロスポルム・カニス トリクロフィトン・ルブルム ミクロスポルム・トードウイニ ウイルス類 アデノウイルス類 ヘルペスウイルス類 単純ヘルペス 水痘（水ぼうそう） 帯状ヘルペス（帯状庖疹） Ｂウイルス サイトメガロウイルス 痘疹ウイルス 痘瘡（天然痘） 完全痘庖 ポックスウイルス・ボビス パラワクシニア モルスカム・コンタジオスム ピコルナウイルス属 ポリオウイルス コクサッキーウイルス ＥＣＨＯウイルス ライノウイルス ミクソウイルス類 インフルエンザ（Ａ、ＢおよびＣ型） パラインフルエンザ（１−４型） おたふくかぜウイルス ニューキャッスル病ウイルス 麻疹ウイルス 牛疫ウイルス イヌジステンパーウイルス 呼吸性シンチウムウイルス 風疹ウイルス アルボウイルス類 東部ウマ脳脊髄炎症ウイルス 西部ウマ脳脊髄炎症ウイルス シンドビスウイルス チクングニヤウイルス セムリキフォレストウイルス マヨラウイルス セントルイス脳炎ウイルス カリフォルニア脳炎ウイルス コロラドマダニ熱ウイルス 黄熱病ウイルス デング熱ウイルス レオウイルス属 レオウイルス１−３型 レトロウイルス類 ヒト免疫不全ウイルスＩおよびII型（ＨＩＶ） ヒトＴ細胞向性ウイルスＩおよびII型（ＨＴＬＶ） 肝炎類 Ａ型肝炎 Ｂ型肝炎 Ｃ型肝炎 腫瘍ウイルス類 ローシャー白血病ウイルス グロスウイルス マロニー白血病ウイルス ヒト乳頭腫ウイルス を含む。 モノエピトープリガンド分析物は、一般に約１００から２,０００の分子量、 さらに通常１２５から１,０００の分子量である。分析物は、薬剤、代謝生成物 、殺虫剤、汚染物質及び同種物を含む。対象となる薬剤に含まれるものは、アル カロイド類である。アルカロイドの中は、モルヒネ、コデイン、ヘロイン、デキ ストロメトルファンを含むモルヒネアルカロイド類、それらの誘導体および代謝 生成物；コカインおよびベンジルエクゴニンを含むコカインアルカロイド類、そ れらの誘導体および代謝生成物；リセルグ酸ジエチルアミドを含むエルゴットア ルカロイド類；ステロイドアルカロイド類；イミナゾイルアルカロイド類；キナ ゾリンアルカロイド類；イソキノリンアルカロイド類；キニンおよびキニジンを 含むキノリンアルカロイド類；ジテルペンアルカロイド類、それらの誘導体およ び代謝生成物である。 次の薬剤群は、エストロゲン類、アンドロゲン類、副腎皮質ステロイド類、胆 汁酸類、強心性グリコシド類を含むステロイド類、ジゴキシンおよびジゴキシゲ ニンを含むアグリコン類、サポニン類およびサポゲニン類、それらの誘導体およ び代謝生成物を含む。また、ジエチルスチルベストロールのような疑似ステロイ ド物質も含まれる。 次の薬剤群は、バルビツル酸塩類、例えば、フェノバルビタールおよびセコバ ルビタール、ジフェニルヒダントニン、プリミードン、エトサキシミドおよびそ れらの代謝生成物を含む、５ないし６員環ラクタムである。 次の薬剤群は、アンフェタミン類を含む、炭素原子２から３個のアルキルを有 するアミノアルキルベンゼン類；エフェドリン、Ｌ−ドーパ、エピネフリンを含 むカテコールアミン類；ナルセイン；パパベリン；および上記の代謝生成物であ る。 次の薬剤群は、オキサゼパム、クロルプロマジン、テグレトールを含むベンズ 複素環類、それらの誘導体および代謝生成物であり、該複素環は、アゼピン、ジ アゼピンおよびフェノチアジンである。 次の薬剤群は、テオフィリン、カフェインを含むプリン類、それらの代謝生成 物および誘導体である。 次の薬剤群は、カンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノールを含む、マ リファナに由来した薬剤を含む。 次の薬剤群は、チロキシン、コルチゾール、トリヨードチロニン、テストステ ロン、エストラジオール、エストロン、プロゲステロンのようなホルモン類、ア ンギオテンシン、ＬＨＲＨのようなポリペプチド類、およびシクロスポリン、Ｆ Ｋ−５０６、ミコフェノール酸その他のような免疫抑制剤等である。 次の薬剤群は、Ａ、Ｂ、例えば、Ｂ₁₂、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＫ、葉酸、チアミン のようなビタミン類である。 次の薬剤群は、水酸化および不飽和の程度および部位により異なるプロスタグ ランジン類である。 次の薬剤群は、イミプラミン、ジメチルイミプラミン、アミトリプチリン、ノ ルトリプチリン、プロトリプチリン、トリイミプラミン、クロムイミプラミン、 ドキセピンおよびデスメチルドキセピンを含む３員環抗抑圧剤である。 次の薬剤群は、メトトレキサートを含む抗新生物薬である。 次の薬剤群は、ペニシリン、クロロマイセチン、アクチノマイセチン、テトラ サイクリン、テルラマイシンを含む抗生物質、それらの代謝生成物および誘導体 である。 次の薬剤群は、ＡＴＰ、ＮＡＤ、ＦＭＮ、アデノシン、グアノシン、チミジン およびシチジンを含み、それらの適当な糖およびリン酸塩置換基をもつヌクレオ シドおよびヌクレオチドである。 次の薬剤群は、メタドン、メプロバメート、セロトニン、メペリジン、リドカ イン、プロカインアミド、アセチルプロカインアミド、プロプラノロール、グリ セオフルビン、バルプロ酸、ブチロフェノン、抗ヒスタミン、クロラムフェニコ ール、アトロピンのような抗コリン性薬剤、それらの代謝生成物および誘導体を 含む種々の各薬剤である。 病的状態に関連する代謝生成物は、スペルミン、ガラクトース、フェニルピル ビン酸およびポルフィリン１型を含む。 次の薬剤群は、ゲンタマイシン、カナマイシン、トブラマイシンおよびアミカ シンのようなアミノ配糖体類である。 対象となる殺虫剤の中は、ポリハロゲン化ビフェニル類、リン酸エステル類、 チオリン酸塩類、カルバメート類、ポリハロゲン化スルフェンアミド類、それら の代謝生成物および誘導体である。 受容体分析物では、分子量は一般的に１０,０００から２×１０⁸、さらに通常 は１０,０００から１０⁶の範囲である。免疫グロブリンであるＩｇＡ、ＩｇＧ、 ＩｇＥおよびＩｇＭでは、分子量は一般的に約１６０,０００から約１０⁶に変化 し得る。酵素類は、標準的に約１０,０００から１,０００,０００の分子量の範 囲である。天然の受容体は、幅広く変化し、一般的に少なくとも約２５,０００ の分子量であり、１０⁶またはそれ以上の分子量であることができ、アビジン、 ＤＮＡ、ＲＮＡ、チロキシン結合グロブリン、チロキシン結合プレアルブミン、 トランスコルチン等のような物質を含む。 分析物という用語は、さらに以下に定義するポリヌクレオチドのようなポリヌ クレオチド分析物を含む。これらは、ｍ−ＲＮＡ、ｒ−ＲＮＡ、ｔ−ＲＮＡ、Ｄ ＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ二重体等を含む。分析物という用語は、また例えば、制限 酵素、活性化剤、抑制剤、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、ヒストン、修復酵素、 化学療法剤等のようなポリヌクレオチド結合剤である受容体も含む。 分析物は宿主から、体液を含む生物学的組織のような試料中に直接見出される 分子であることができる。試料は直接試験でかるが、より容易に検出できるよう に分析物を前処理してもよい。さらに、対象となる分析物は、対象となる分析物 に相補的な特異的結合対メンバーのような対象となる分析物が試料中に存在する 場合にだけその存在が検出される、対象となる分析物を証明する試剤を検出する ことにより測定することができる。こうして、分析物を証明する剤は、アッセイ で検出される分析物になる。生物学的組織は、器官または宿主および体液の他の 部分、例えば尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、大便、痰、脳脊髄液、涙液、 粘液等から切除した組織を含む。 特異的結合対メンバー（「ｓｂｐメンバー」）：表面上または空洞の中に、他 の分子の特定の空間的および極性の構造に特異的に結合する領域を有し、それ故 にそれと相補的と定義される、２つの異なる分子の１つ。特異的結合対メンバー は、リガンドおよび受容体（抗リガンド）を意味し得る。これらは通常抗原−抗 体のような免疫学的対のメンバーであるが、但しビオチンーアビジン、ホルモン −ホルモン受容体、核酸二本鎖分子、ＩｇＧ−プロテインＡ、ポリヌクレオチド 結合剤、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡのようなポリヌクレオチド対等のよう な他の特異的結合対は、免疫学的対ではないが、本発明およびｓｂｐメンバーの 定義に含まれる。 ポリヌクレオチド：自然な状態で約５０から５００,０００またはそれ以上の ヌクレオチドを有し、単離した状態で約１５から５０,０００またはそれ以上の ヌクレオチドを有し、通常は約１５から２０,０００のヌクレオチド、さらに頻 繁には１５から１０,０００のヌクレオチドを有するポリマーヌクレオチドであ る化合物または組成物。ポリヌクレオチドは、任意の資源由来の精製または未精 製形態の核酸を含み、天然に生成するかまたは合成的に製造され、ＤＮＡ（ｄｓ ＤＮＡおよびsｓＤＮＡ）およびＲＮＡ、通常はＤＮＡを含み、ｔ−ＲＮＡ、ｍ −ＲＮＡ、ｒ−ＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡおよびＲＮＡ、クロロプラストＤ ＮＡおよびＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはそれらの混合物、遺伝 子、染色体、プラスミド、微生物、例えば細菌、酵母、ウイルス、ウイロイド、 かび、真菌、植物、動物、ヒト、およびそれらのフラグメント、及び同種物のよ うな、生物学的物質のゲノムであることができる。 リガンド…それに対する受容体が天然に存在するかまたは製造することができ る任意の有機化合物。 リガンドアナログ…通常１００以上の分子量を有する修飾リガンド、有機ラジ カルまたは分析物アナログであり、それは受容体の類似したリガンドと競合する ことができ、修飾は、リガンドアナログを別の分子につなぐための手段を提供す る。リガンドアナログは、リガンドアナログを中心または標識に連結する結合で 水素を置換する以上に、リガンドとは異なるが必要はない。リガンドアナログは 、 リガンドに類似する方法で受容体に結合することができる。例えば、アナログは 、抗体のイディオタイプに対してリガンドに向けられた抗体であり得る。 受容体（「抗リガンド」）…分子の特定の空間的および極性の構造、例えばエ ピトープまたは決定基部位を認識できる全ての化合物または組成物。例となる受 容体は、天然に生成する受容体、例えば、チロキシン結合グロブリン、抗体類、 酵素類、Ｆａｂフラグメント類、レクチン類、核酸類、プロテインＡ、補体成分 Ｃ１ｑ及び同種物を含む。 特異的結合…他の分子に対するかなり低い認識と比較し、２つの異なる分子の １つを特異的に認識すること。一般に、その分子は、それらの表面上または空洞 に２分子間の特異的認識を起こす領域をもつ。特異的結合の典型例は、抗原−抗 体相互作用、酵素基質相互作用、ポリヌクレオチド相互作用、その他である。 非特異的結合…特異的表面構造から相対的に独立している分子間の非共有結合 。非特異的結合は、分子間の疎水性相互作用を含む数種の因子から生ずる。 抗体…他の分子の特定の空間的および極性構造に特異的に結合し、そのためそ れと相補的であると定義される免疫グロブリン。抗体は、モノクローナルまたは ポリクローナルであることができ、宿主の免疫および血清（ポリクローナル）の 収集のように当業者によく知られた技術によって、または連続的なハイブリッド セルラインの調製と分泌蛋白質（モノクローナル）の収集によって、または少な くとも天然の抗体との特異的結合に必要なアミノ酸配列をコードするヌクレオチ ド配列またはその変異版のクローニングおよび発現によって製造できる。抗体類 は、完全な免疫グロブリンまたはそれらのフラグメントを含むことができ、その 免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇ Ｇ３、ＩｇＭ等のような様々な種類およびイソタイプを含む。それらのフラグメ ントは、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦ(ａｂ')₂、Ｆａｂ'等を含むことができる。さら に、凝集体、ポリマー類および免疫グロブリン類またはそれらのフラグメントの コンジュゲートは、特定の分子の結合親和性が維持される限り、適当な場合に使 用することができる。 抗体（ポリクローナル）を含む抗血清は、適当な免疫源での、ウサギ、モルモ ッ トまたはヤギのような動物の免疫に関与し、適当な時間をおいて免疫した動物の 血液から抗血漿を得る充分に確立した技術によって得られる。最新の批評は、パ ーカー、ラジオイミノアッセイ・オブ・バイオロジカリー・アクティブ・コンパ ウンズ、プレンティス・ホール（イングルウッド・クリフス、ニュージャージー 、アメリカ合衆国、１９７６年）、バトラー、ジャーナル・オブ・イムノロジカ ル・メソッズ、第７巻、第１−２４頁（１９７５年）、ブロートンおよびストロ ング、クリニカル・ケミストリー、第２２巻、第７２６−７３２頁（１９７６年 ）およびプレイフェアー等、ブリティッシ・メディカル・ブレタン、第３０巻、 第２４−３１頁（１９７４年）で提供される。 抗体はまた、体細胞ハイブリッド形成技術によって得られ、上記抗体は、モノ クローナル抗体と通常称する。モノクローナル抗体は、ケーラーおよびミルシュ タイン、ネイチャー、第２６５巻、第４９５−４９７頁（１９７５年）の標準技 術により産生することができる。モノクローナル抗体の批評は、リンパ球ハイブ リドーマ、メルチャーズ出版等で見られる。スプリンガー−ベルラグ（ニューヨ ーク１９７８年）、ネイチャー、第２６６巻、第４９５頁（１９７７年）、サイ エンス、第２０８巻、第６９２頁（１９８０年）、およびメソッズ・オブ・エン ザイモロジー、第７３巻（パートＢ）、第３−４６頁（１９８１年）。適当な免 疫製造の試料は、ネズミのような動物に注射して、充分に時間がたった後、その 動物を犠牲にして脾臓の細胞を得る。別法として、非免疫動物の脾臓の細胞を試 験管内で免疫源に増感することができる。所望の免疫グロビンの塩基配列をコー ド化する脾臓細胞染色体は、一般に、例えばポリエチレングリコールのような非 イオン性界面活性剤の存在下、骨髄腫セルラインで脾臓細胞を融合することによ って圧縮することができる。融合したハイブリドーマを含む生じる細胞は、ＨＡ Ｔ媒体のような選択的な媒体で成長させ、残存する不滅の細胞を限界希釈条件を 使用して上記媒体で成長させる。その細胞は、微量滴定ウエルのような適当な容 器で成長させ、上清を、所望の特異性をもつモノクローナル抗体にスクリーンに かける。 モノクローナル抗体の収率を増大するためには、様々な技術があり、例えばハ イブリドーマ細胞を、細胞を受け入れる哺乳類の宿主の腹腔に注入し、腹水を集 める。腹水中で集めたモノクローナル抗体の量が不充分な場合は、抗体を宿主の 血液から集める。別法としては、所望の抗体を産生する細胞は、中空糸細胞培養 または撹拌フラスコ装置で成長することができ、これら両方とも当業者によく知 られている。他の蛋白質および他の混入物からのモノクローナル抗体の単離およ び精製するためには、様々な常法が存在する（ケーラーおよびミルシュタイン参 照、前掲）。 抗体の製造のための別の接近法では、抗体結合部位にコードする配列は、染色 体ＤＮＡから切除して、細菌中で発現することができるクローニングベクターに 挿入して、相当する抗体結合部位をもつ組換え蛋白質を産生することができる。 一般に、抗体は、ＤＥＡＥクロマトグラフィー、ＡＢｘクロマトグラフィー等 のようなクロマトグラフィー、濾過、その他のような既知技術によって精製する ことができる。 アルキル基…脂肪族炭化水素から１つのＨ原子を除去して誘導される一価の分 枝または非分枝ラジカルで、低級アルキルおよび高級アルキル基の両方を含む。 低級アルキル基…例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、 イソブチル、ペンチル、イソペンチル等のような１ないし５個の炭素原子を含む アルキル。 高級アルキル基…６個以上の炭素原子を含むアルキルで、通常６ないし２０個 の炭素原子で、例えばヘキシル、ヘプチル、オクチル等である。 アルキリジン…脂肪族炭化水素から誘導される二価の有機ラジカルで、例えば ２個の水素原子は同じ炭素原子から得られたエチリジンである。 アリール基…芳香族炭化水素から１つの原子の除去により誘導され、１つまた はそれ以上の芳香族環を含み、通常は例えば、フェニル（ベンゼンから）、ナフ チル(ナフタレンから)等のような１ないし４個の芳香族環を含む有機ラジカル。 アラルキル…アリール基に結合するアルキル基を含む有機ラジカル、例えばベ ンジル、フェネチル、３−フェニルプロピル、１−ナフチルエチル等。 アルコキシ…酸素原子による分子の残留物に結合するアルキルラジカル、例え ばメトキシ、エトキシ等。 アリールオキシ…酸素原子による分子の残留物に結合するアリールラジカル、 例えばフェノキシ、ナフトキシ等。 アラルコキシ…酸素原子による分子の残留物に結合するアラルキルラジカル、 例えばベンゾキシ、１−ナフチルエトキシ等。 置換は、ある分子のある水素原子が別の原子と置き換わることを意味し、ここ で別の分子は、ハロゲン等のような単一原子であるか、または１から５０個の原 子を有する置換基のような官能性を形成する（それらの原子の原子価を満たすの に必要な所要水素原子以外の）原子群の一部であり、それらの原子は、独立して 炭素、酸素、窒素、硫黄およびハロゲン（塩素、臭素、ヨウ素、フッ素）からな る群から選択されたものであり、１つまたはそれ以上の金属原子と結合し得るか または結合し得ないものである。 アルキルチオ…硫黄原子による分子の残留物に結合するアルキルラジカル、例 えばメチルチオ、エチルチオ等。 アリールチオ…硫黄原子による分子の残留物に結合するアリールラジカル、例 えばフェニルチオ、ナフチルチオ等。 電子供与基…分子に結合する場合、電子供与基の電子が乏しくなり、分子の別 の部分に比較して陽性に荷電する、すなわち低下した電子密度をもつように、分 子を分極化することができる置換体。上記の基は、アミン、エーテル、チオエー テル、ホスフィン、ヒドロキシ、オキシアニオン、メルカプタンおよびそれらの アニオン、スルフィド等であるが、例示的にかつ非限定的にあげられる。 １から５０個の原子をもつ（それらの原子の原子価を満たすのに必要な所要水 素原子以外の）置換基で、それらの原子は、独立して炭素、酸素、窒素、硫黄、 ハロゲンおよびリンからなる群から選択される。…有機ラジカル；有機ラジカル は、ラジカルでの原子の原子価を満たすのに必要な所要水素原子以外の１−５０ 個の原子を有する。一般に、優勢な原子は、炭素（Ｃ）であるが、酸素（Ｏ）、 窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）およびリン（Ｐ）でもあり、Ｏ、Ｎ、ＳまたはＰは、そ れらが存在する場合、炭素とまたは各々互いに１つまたはそれ以上とまたは水素 とまたは金属原子と結合して、例えば、カルボン酸、アルコール、チオール、カ ルボキサミド、カルバメート、カルボン酸エステル、スルホン酸、スルホン酸エ ステル、リン酸、リン酸エステル、尿素、カルバメート、ホスホルアミド、スル ホンアミド、エーテル、スルフィド、チオエーテル、オレフィン、アセチレン、 アミン、ケトン、アルデヒド、ニトリル等のような様々な官能基を形成する。そ のような有機ラジカルまたは基の例としては、アルキル、アルキリジン、アリー ル、アラルキル、および前述の官能性の１つまたはそれ以上に置換したアルキル 、アリールおよびアラルキルが、例示的にかつ非限定的にあげられる。 連結基…分子間の共有結合。連結基は、連結する分子、すなわち光増感剤、化 学発光化合物、ｓｂｐメンバーまたは粒子に関連するかまたはその部分である分 子の性質により異なり変化し得る。光増感剤または化学発光化合物上に標準的に 存在するかまたは導入される官能基が、これらの物質を、ｓｂｐメンバーまたは 、リポソームまたは油滴の親油性成分、ラテックス粒子、シリコン粒子、金属ゾ ルまたは色素微結晶のような粒子に連結するのに使用される。 カルボニル官能性群は、多くの場合、例えばアルデヒドのようなオキソカルボ ニルおよび例えばカルボキシ、アミジン、アミデート、チオカルボキシおよびチ オノカルボキシのような非オキソカルボニル（窒素および硫黄アナログを含む） の両方に使われる。 オキソの別の官能性群は、活性ハロゲン、ジアゾ、メルカプト、オレフィン、 特に活性化オレフィン、アミノ、ホスホロ及び同種物を含む。連結基の記載は、 アメリカ特許第３,８１７,８３７号に見ることができ、その記載は、引用して本 明細書に包含させる。 連結基は、１ないし１００個の原子、通常は約１ないし７０個の原子、好まし くは１ないし５０個の原子、さらに好ましくは１ないし２０個の原子からなる結 合から鎖まで変化し、各々は独立して、標準的に炭素、酸素、窒素、硫黄、ハロ ゲンおよびリンからなる群から選択される。連結基中のヘテロ原子の数は、標準 的には約０から２０個、通常は約１から１５個、さらに好ましくは２から６個の 範囲である。鎖中の原子は、１から５０個の原子を有する置換基について記載し たのと同様の方法で、水素以外の原子群で置換され得る。一般的に、ある特定の 連結基の長さは、合成上の利便性および、エネルギー受容体、発蛍光団、重原子 等のようなシステム内交差分析のための基といった任意の所望基導入の利便性の ために随意に選択することができる。連結基は、脂肪族または芳香族であり得る が、ただしジアゾ基を伴うときは、通常芳香族基が関与する。 ヘテロ原子が存在する場合、酸素は標準的に、炭素、硫黄、窒素またはリンに 結合しているオキソまたはオキシとして存在し、窒素は、標準的に炭素、酸素、 硫黄またはリンに結合しているニトロ、ニトロソまたはアミノとして標準的に存 在し、硫黄は、酸素と同様であるが、リンは、通常はホスホネートおよびリン酸 モノまたはジエステルとして炭素、硫黄、酸素または窒素に結合している。 連結基とコンジュゲートすべき分子間の共有結合を形成する共通の官能性群は 、アルキルアミン、アミジン、チオアミド、エーテル、尿素、チオ尿素、グアニ ジン、アゾ、チオエーテルおよびカルボキシレート、スルホネート、およびホス ホン酸エステル、アミドおよびチオエステルである。 多くの場合、連結基が光増感剤に結合する場合、光化学的に活性化できる化学 発光化合物または本発明の粒子状組成物は、窒素および硫黄アナログを含む非オ キソカルボニル基、リン酸基、アミノ基、ハロまたはトシルアルキルのようなア ルキル化剤、オキシ（ヒドロキシルまたは硫黄アナログ、メルカプト）オキソカ ルボニル（例えば、アルデヒドまたはケトン）、またはビニルスルフォンまたは α,β−不飽和エステルのような活性オレフィンを有する。これらの官能性群は 、アミノ基、カルボキシル基、活性オレフィン、アルキル化剤、例えばブロモア セチルに連結する。アミンおよびカルボン酸またはその窒素誘導体またはリン酸 が連結する場合、アミド、アミジンおよびホスホルアミドが形成する。メルカプ タンおよび活性オレフィンが連結する場合、チオエーテルが形成する。メルカプ タンおよびアルキル化剤が連結する場合、チオエーテルが形成する。アルデヒド およびアミンが還元条件下で連結する場合、アルキルアミンが形成する。カルボ ン酸またはリン酸およびアルコールが連結する場合、エステルが形成する。 親水性または水溶性を与える基または官能性群は、親水性官能性群であり、そ れは、水で固体の湿潤性を高め、それが結合する化合物の水溶解度を高める。そ のような官能基または官能性群は、１ないし５０またはそれ以上の原子をもつ置 換基であり、スルホネート、スルフェート、ホスフェート、アミジン、ホスホネ ート、カルボキシレート、ヒドロキシル、特にポリオール、アミン、アミド及び 同種物を含む。例となる官能基は、カルボキシアルキル、スルホンオキシアルキ ル、ＣＯＮＨＯＣＨ₂ＣＯＯＨ、ＣＯ−（グルコサミン）、糖、デキストラン、 シクロデキストリン、ＳＯ₂ＮＨＣＨ₂ＣＯＯＨ、ＳＯ₃Ｈ、ＣＯＮＨＣＨ₂ＣＨ₂ ＳＯ₃Ｈ、ＰＯ₃Ｈ₂、ＯＰＯ₃Ｈ₂、ヒドロキシル、カルボキシル、ケトンおよび それらの組合わせである。ほとんどの上記官能性群はまた、結合基として利用さ れており、それは、ｓｂｐメンバーが光増感剤および化学発光化合物を含む粒子 状組成物と結合するのを可能にする。 親油性または脂溶性を与える基または官能性は、親油性官能性群であり、それ は、水で表面の湿潤性を低め、それが結合する化合物の水溶解度を低くする。そ のような官能基または官能性群は、１ないし５０またはそれ以上の原子をもち、 通常は水素またはハロゲンと置換する炭素原子であり、アルキル、アルキリデン 、アリールおよびアラルキルを含むことができる。脂溶性基または官能性群は、 少なくとも６個の炭素原子、通常少なくとも１０個の炭素原子、好ましくは少な くとも１２個の炭素原子、通常３０個以下の炭素原子の、標準的に１ないし６個 の直鎖または分枝鎖の脂肪族基を含むことができる。脂肪族基は、５ないし６員 環に結合し、脂環性、複素環性または芳香族性である。脂溶性基は、光増感剤ま たは化学発光化合物に結合して、非水性基質でそれらの溶解度を高める。 光増感剤…光での励起により通常シングレット酸素を発生する増感剤。通常、 光増感剤は、化学発光化合物より長い波長で吸収し、化学発光化合物より低いエ ネルギートリプレットをもつが、但し、どちらも本発明の成功には重要ではない 。光増感剤は、光活性化できる（例えば、染料および芳香族化合物）。光増感剤 は、通常共有結合した原子を含む化合物であり、通常多重にコンジュゲートした 二重または三重結合をもつ。化合物は、励起波長で、その吸収最大値が５００Ｍ^-1 ｃｍ^-1、好ましくは少なくとも５０００Ｍ^-1ｃｍ^-1、さらに好ましくは５０, ００ ０Ｍ^-1ｃｍ^-1以上の吸光係数である、２００ないし１１００ｎｍ、通常３００な いし１０００ｎｍ、好ましくは４５０ないし９５０ｎｍの範囲の波長で光を吸収 すべきである。酸素なしでの光の吸収に続いて産生された励起状態の寿命は、通 常少なくとも１００ｎｓｅｃであり、好ましくは少なくとも１ｍｓｅｃである。 一般に、その寿命は、エネルギーを酸素に転移するのを可能にするために充分に 長くしなければならなく、それは標準的に媒体により異なるが、１０^-5ないし１ ０^-3Ｍの範囲の濃度で存在する。光増感剤励起状態は、通常その基底状態より異 なるスピン量子数（Ｓ）をもち、よくあることであるが、基底状態がシングレッ ト（Ｓ＝０）である場合は、トリプレット（Ｓ＝１）である。好ましくは、光増 感剤は、高いシステム内交差率をもつ。すなわち、光増感剤の光励起は、少なく とも１０％、望ましくは少なくとも４０％、好ましくは８０％以上の効率をもつ 長命状態（通常トリプレット）を産生する。励起状態は、基底状態に比例して、 少なくとも２０Ｋｃａｌ／モル、好ましくは少なくとも２２Ｋｃａｌ／モル、通 常６５Ｋｃａｌ／モル未満のエネルギーをもつが、但しそれより高いエネルギー も使用される。光増感剤は、通常アッセイ条件下最も弱い蛍光である（通常０. ５未満、好ましくは０.１未満の係数率）。 光により励起される光増感剤は、相対的に光安定であり、シングレット酸素と 効果的に化学反応しない。数種の構造特性が、ほとんどの有用な光増感剤に存在 する。ほとんどの光増感剤は、強固でしばしば芳香族構造をもつ、少なくとも１ つ、しばしば３つまたはそれ以上のコンジュゲートした二重または三重結合をも つ。それらは、しばしばカルボニルまたはイミン基のようなシステム内交差を促 進する少なくとも１個の基または周期表の第３−６列から選択された重原子、特 にヨウ素または臭素を含むか、またはそれらは延長した芳香族構造をもつ。典型 的な光増感剤は、アセトン、ベンゾフェノン、９−チオキサントン、エオシン、 ９,１０−ジブロモアントラセン、メチレンブルー、ポルフィリン、ヘマトポル フィリンのようなメタロポルフィリン、フタロシアニン、クロロフィル、ローズ ベンガル、バックミンスターフレレン等および、そのような化合物をより親油性 にまたはより親水性にさせるため、および／または例えばｓｂｐメンバーに結合 する結合基として１ないし５０個の原子の置換体をもつこれらの化合物の誘導体 を含む。好ましい光増感剤は、メチレンブルー、ポルフィリン、フタロシアニン 、クロロフィルおよびローズベンガルのような染料である。本発明で利用し得る 他の光増感剤の例としては、上記特性をもち、Ｎ.Ｊ.テュロ、「分子光化学」、 第１３２頁、Ｗ.Ａ.ベンジャミン・インコーポレイテッド、ニューヨーク（１９ ６５年）に列挙されている。 光増感剤が油滴、リポソーム、ラテックス粒子等に含まれる場合、光増感剤が 親油性メンバーに確実に溶解するために相対的に非極性であるのが好ましい。 活性化がシングレット酸素によるものである場合、光増感剤は光活性化を促進 する。通常、光増感剤は光を吸収し、こうして形成した励起光増感剤は、酸素を 活性化させて、シングレット酸素を生成し、そのシングレット酸素は化学発光化 合物と反応して、準安定な発光中間体を得る。望ましくは、化学試薬を加えずに 本発明の組成物を活性化することが必要で、光増感剤および化学発光化合物は１ 種の組成物内で見られる。 光増感剤は、化学発光化合物を活性化するシングレット酸素を生成するための 多くの異なったやり方でで使用する。光増感剤は、粒子に溶解または結合し、さ らにｓｂｐメンバーに結合する。一般に、使用される光増感剤の量は、化学発光 化合物の活性化をもたらすある濃度のシングレット酸素を生成するのに充分な量 である。 固体基質…多孔性または非多孔性の水不溶性物質を含んで成る支持体または表 面。この表面は、ストリップ、ロッド、ビーズを含む粒子及び同種物のような、 多種の任意の形のものを有し得る。この表面は、親水性であるかまたは親水性と なし得るものであり、シリカ、硫酸マグネシウムおよびアルミナのような無機粉 末；天然のポリマー物質、特にセルロース系物質および、例えば濾紙、クロマト グラフィー紙のような紙を含む繊維のようにセルロースから誘導される物質；ニ トロセルロース、酢酸セルロース、ポリ（塩化ビニル）、ポリアクリルアミド、 架橋デキストラン、アガロース、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピ レン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメトアクリレート、ポリ (エチレンテレフタレート)、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）等のような合 成のまたは修飾した天然産生ポリマー類；それ自体でまたは他の物質と併用で； バイオガラスとして入手できるガラス、セラミックス、金属及び同種物を含む。 支持体または表面へのｓｂｐメンバーの結合は、文献で通常入手できるよく知 られた技術により達成することできる。例えば、「固定化酵素」、イチロー・チ バタ、ハルステッド・プレス、ニューヨーク（１９７８年）およびクアトレカサ ス、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２４５巻、第３０５ ９頁（１９７０年）を参照。 表面は、通常多機能であるか、または多機能にすることができるか、または特 異的、非特異的、共有または非共有相互作用によってオリゴヌクレオチド、ｓｂ ｐメンバー、光増感剤および／または光化学的に活性できる化学発光化合物、に 結合することができる。様々な官能基が入手可能であるかたは導入できる。この 官能基は、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロ キシル基、メルカプト基及び類似物を含む。幅広く多様な化合物を表面に結合さ せる方法が、よく知られており、文献に十分説明されている。例えば、クアトレ カサス、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２４５巻、第３ ０５９頁（１９７０年）参照。オリゴヌクレオチドまたはｓｂｐメンバーの連結 基との長さは、連結しようとする化合物の性質、連結しようとする化合物間の距 離の影響および特異的結合特性の表面及び類似物により異なり、幅広く変化し得 る。 粒子…少なくとも約２０ｎｍで約２０ミクロン以下、通常少なくとも約４０ｎ ｍで約１０ミクロン未満、好ましくは直径が約０.１０から２.０ミクロンで、標 準的に１ピコリットル以下の容量を有する粒子。この粒子は、有機、無機、膨張 性または非膨張性、多孔質または非多孔質である固体または流体で、それは、任 意の密度をもつが、好ましくは水に近い密度をもち、一般に約０.７から約１.５ ｇ／ｍｌ、好ましくは水中に懸濁でき、透明、部分的に透明、または不透明であ る物質からなる。この粒子は、電荷を有するかまたは有しないことができ、荷電 している場合は、好ましくはマイナス荷電である。この粒子は、固体(例えばポ リマー、金属、ガラス、有機物および無機物、例えば鉱物、塩およびけいそう) 、油滴（例えば、炭化水素、フッ化炭素、シリコン液）または小胞（例えば、リ ン脂質のような合成のまたは細胞やオルガネラのような天然の）である。この粒 子はラテックス粒子または、有機もしくは無機ポリマーを含む他の粒子；例えば リポソーム、リン脂質小胞のような脂質二重層；油小滴；シリコン粒子；金属ゾ ル；細胞；多糖；ヒドロゲル；架橋蛋白質；けいそう；および色素微結晶を含む 他の粒子である。 有機粒子は、標準的にポリマー類、付加または濃縮ポリマー類のいずれかであ り、それらはアッセイ培地中で容易に分散することができる。有機粒子はまた、 それらの表面でｓｂｐメンバーに直接または間接的に結合し、光増感剤または光 化学的に活性化できる化学発光化合物にそれらの表面で結合するかまたはその内 部に含めるように、吸着性または官能付与性でもある。 この粒子は、天然産生物質、合成的に修飾した天然産生物質、および合成物質 から調達できる。例えばリポソームや非リン脂質小胞のような脂質二重層のよう な天然または合成アセンブリが好ましい。特に有利な有機ポリマーの中には、多 糖類、特にアガロースのような架橋した多糖類、それはセファロースとして入手 できる、があり、セファデックスおよびセファクリルとして入手できるデキスト ラン、セルロース、デンプン及び同種物；ポリスチレン、ポリアクリルアミド、 アクリレートやメタアクリレートの誘導体、特にヒドロゲルや同種物を含む遊離 ヒドロキシ官能性を有するエステルやアミドのホモポリマーおよびコポリマーの ような付加ポリマーがある。無機ポリマーは、シリコン、バイオガラスとして入 手できるガラス等を含む。ゾルは、金、銀セレンおよび他の金属を含む。粒子は また、ポルフィリン、フタロシアニン等のような水不溶性染料を分散し、それは また、光増感剤として役立つ。粒子はまた、けいそう、細胞、ウイルス性粒子、 マグネットゾーム、細胞核及び同種物を含む。 粒子が商業的に入手できる場合、粒子径は、粉砕、音波破砕、撹拌等のような 機械的手段により、大きい粒子を小さい粒子に細かくすることにより変え得る。 粒子は、通常多機能であるかまたは多機能にすることができるか、またはｓｂ ｐメンバーに結合することができるおよび／または特異的、非特異的、共有また は非共有相互作用を通じて、光増感剤および／または化学発光化合物に結合する ことができる。幅広く多様な官能基が入手できるかまたは含むことができる。官 能基の典型例は、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、 ヒドロキシル基、メルカプト基及び同種物を含む。ｓｂｐメンバー、化学発光化 合物または光増感剤と粒子との共有結合を実施する場合、連結する方法は、よく 知られており、文献で十分に説明されている。例えば、クアトレカサス、ジャー ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２４５巻、第３０５９頁（１９ ７０年）参照。連結基の長さは、連結しようとする化合物の性質、粒子の性質、 連結しようとするる化合物間の距離の影響およびｓｂｐメンバーおよび分析物の 結合上の粒子及び類似物により異なり、幅広く変化し得る。 粒子に共有結合しない場合、光増感剤および／または光活性化する化学発光化 合物を、粒子の表面で溶解するかまたはそれに非共有結合するように選択し得る 。この場合、これらの化合物は、粒子から解離する可能性を減少するために疎水 性であることが好ましい。一般に、光増感剤および化学発光化合物と粒子との関 連を好むように、粒子状組成物が選択される。 粒子に関連する光増感剤または光活性化できる化学発光化合物の分子の数は、 平均して通常少なくとも１個であり、粒子が完全に光増感剤および光化学的に活 性化できる化学発光化合物分子からなるように充分に高い。好ましい分子の数は 、アッセイのような特定の用途についてバックグラウンドへのもっとも高いシグ ナルを提供するために経験上選択される。いくつかの場合では、このことは、い くつもの異なった光増感剤分子を粒子に関連づけることによって最善に達成する ことができ、またはエネルギーを光増感剤に転移することができるいくつもの同 様または異なった蛍光染料分子は、光エネルギーを集め、それを光増感剤分子に 転移する粒子に含むことができる。通常、粒子での光増感剤または光活性化でき る化学発光化合物対ｓｂｐメンバーの割合は、少なくとも０.１、好ましくは少 なくとも１０、最も好ましくは１００対１以上である。 油滴は、乳化剤で被覆および安定化した親油性化合物を含む流動粒子で、その 乳化剤は、例えばリン脂質、スフィンゴミエリン、アルブミン及び同種物のよう な両親媒性の分子である。 リン脂質は、脂肪族ポリオールの脂肪族カルボン酸エステルに基づいており、 少なくとも１つのヒドロキシル基が約８から３６個、通常は約１０から２０個の 炭素原子のカルボン酸エステルに置換する場合、それは０から３個、通常０から １個のエチレン不飽和の部位を有し、少なくとも１つ、通常１つのみであるヒド ロキシル基は、リン酸塩と置換してリン酸エステルを形成する。リン酸基は、さ らに２つまたはそれ以上の官能性群、一般にヒドロキシルまたはアミノ基をもつ 小さな脂肪族化合物と置換する。 油滴は、適当な親油性化合物と、界面活性剤が混合物の約０.１から５、通常 約０.１から２重量パーセントで存在する場合、アニオン、カチオンまたは非イ オン性の界面活性剤との組合わせにより、そして水性媒体の混合物を音波処理ま たは渦まきのような撹拌をすることにより通常の製法に関連して実施され得る。 例となる親油性化合物は、炭化水素油、フルオロカーボンを含むハロカーボン、 アルキルフタレート、トリアルキルホスフェート、トリグリセリド等を含む。 ｓｂｐメンバーは、通常油滴の表面に吸着するかまたは、油滴の表面成分に直 接または間接的に結合する。ｓｂｐメンバーは、液体粒子の製造間または後のい ずれかで液体粒子に含ませる。ｓｂｐメンバーは、粒子の表面上に存在する分子 の約０.５から１００、通常１から９０、しばしば約５から８０、好ましくは約 ５０から１００モルパーセントで標準的に存在する。 次は、油滴を安定化するために利用される両親媒性化合物のリストであり、例 示的にかつ非限定的にあげられる。：ホスファチジルエタノールアミン、ホスフ ァチジルコリン、ホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルコリン 、卵ホスファチジルコリン、ジアパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファ チジン酸、カルジオリピン、レシチン、ガラクトセルブロシド、スフィンゴミエ リン、ジセチルホスファート、ホスファチジルイノシトール、２−トリヘキサデ シルアンモニウムエチルアミン、１,３−ビス（オクタデシルホスフェート）プ ロパノール、ステアロイルオキシエチレンホスフェート、リン脂質、ジアルキル ホ スフェート、ドデシル硫酸ナトリウム、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面 活性剤、アルブミンのような蛋白質、非イオン性界面活性剤等。 親油性をもち、前に記載した他の化合物もまた使用することもできる。多くの 場合、これらの化合物は、６から２０個の炭素原子をもち、通常アルキル基の混 合物をもつアルキルベンゼン類で、それは直鎖または分枝鎖であり、カルボキシ ル基、ヒドロキシル基、ポリオキシアルキレン基（２−３個の炭素原子をもつア ルキレン）、カルボン酸基、スルホン酸基またはアミノ基をもつ。標準的に約１ ０ら３６個、通常１２から２０個の炭素原子である脂肪族脂肪酸を使用する。ま た、脂肪酸に対して示された炭素限界をもつ脂肪アルコール、同様の炭素限界を もつ脂肪アミンおよび様々なステロイドもまた使用する。 油滴は、フッ化炭素油またはシリコン油（シリコン粒子）を含むことができる 。そのような小滴は、米国特許第４,６３４,６８１号および第４,６１９,９０４ 号のギアエバーにより記載されている。ギアエバーはまた、小滴の製造およびｓ ｂｐメンバーがその小滴に結合することができる方法を記載している。ギアエバ ーにより記載された他の油滴もまた、本発明で使用する。 リポゾーム…ほぼ球状型で、本発明の使用に好ましい物質の１つである微小小 胞。リポゾームは、直径が少なくとも約２０ｎｍで、約２０ミクロン以下、通常 少なくとも約４０ｎｍで約１０ミクロン未満である。好ましくは、リポゾームの 直径は、沈降または浮遊を制限するように約２ミクロン未満である。 リポゾームの外郭は、水または水性溶液の１容量を含む両親媒性二重層からな る。１つ以上の二重層をもつリポゾームは、多重膜小胞と称する。１つだけの二 重層をもつリポソームは、単一膜小胞と称する。親油性光増感剤または化学発光 化合物を使用する場合、多重膜小胞は、これらの物質を単一膜小胞よりも多量に 含むことができるので、本発明に好ましい。両親媒性二重層は、しばしばリン脂 質を含む。本発明で利用できる粒子の製造で使用するリン脂質は、レシチンを含 む天然膜で見られる任意のリン脂質またはリン脂質混合物、または飽和または不 飽和１２−炭素の合成グリセリルリン酸ジエステルまたは２４−炭素の直鎖脂肪 酸であり、そのリン酸塩は、モノエステルとして、またはエタノールアミン、コ リン、イノシトール、セリン、グリセロール及び同種物のエステルとして存在す ることができる。特に好ましいリン脂質は、Ｌ−α−パルミトイルオレオイル− ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグ リセロール（ＰＯＰＧ）、Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルグリセロール、 Ｌ−α（ジオレオイル）−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）および Ｌ−α（ジオレオイル）−ホスファチジル−（４−（Ｎ−マレイミドメチル）− シクロヘキサン−１−カルボキシアミド）エタノール（ＤＯＰＥ−ＭＣＣ）を含 む。 二重層でのリン脂質は、コレステロールで補足し、通常荷電した極性基および 通常２個の直鎖炭化水素鎖を含む疎水性部分をもつ他の両親媒性化合物で置換す ることができる。そのような置換体の例は、ジアルキルホスフェート、アルキル 基が炭素原子１２−２０個の直鎖をもつジアルコキシプロピルホスフェート、１ ９９０年１月３０日に発行された米国特許第４,８９７,３５５号に記載されてい るようなＮ−（２,３−ジ（９−（Ｚ）−オクタデセニルオキシ））−プロプ− １−イル−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、スフィ ンゴミエリン、カルジオリピン及び同種物を含む。 本発明で利用するリポソームは、懸濁液を安定化させ、自然におこる凝集を防 ぐために高い陰性の荷電をもつことが好ましい。 本発明の使用では、リポソームは、ｓｂｐメンバーに結合することができ、水 性または非水性相のいずれかに関連する光増感剤および／または化学発光化合物 をもつことができる。本発明に利用するリポソームは、通常脂質小胞の外部表面 に結合するｓｂｐメンバーをもつ。 リポソームは、水溶液の乾燥したリン脂質またはリン脂質置換体の水和および 機械的分散を含む様々な方法により産生する。本方法で製造されるリポソームは 、様々な面積、組成物および挙動をもつ。機械的に分散したリポソームの挙動の 不均質および矛盾を軽減する方法の１つは、音波処理である。そのような方法は 、リポソームの平均サイズを小さくする。別法としては、リポソームの産生間の 最終段階として押出しを用いることができる。米国特許第４,５２９,５６１号は 、 均一サイズを改良するために、圧力をかけて均一細孔膜に通して、リポソームを 押出す方法を記載している。 脂質二重層に溶解する疎水性または両親媒性光増感剤および／または化学発光 化合物を含むリポソームの製造は、様々な方法で実施でき、オルセン等により、 ビオシミカ・エ・ビオフィジカ・アクタ、第５５７巻、第９頁（１９７９年）に 記載されている方法を含む。 小滴およびリポソームの標識は、例えば、チオールまたはマレイミドまたは脂 質二重層を含む分子上のビオチン基を包含することをしばしば含む。光増感剤、 化学発光分子および／またはｓｂｐメンバーは、その後粒子と、それぞれ、スル フヒドリル反応試薬、スルフヒドリル基またはアビジンに結合するこれらの物質 の１つとの反応により、表面に結合する。スルフヒドリル反応基は、ブロモアセ トアミドおよびマレイミドのようなアルキル化試薬を含む。 ｓｂｐメンバーは、弱い疎水性相互作用によりリポソーム粒子の表面に誘引す ることができるが、しかしながら、そのような相互作用は、インキュベーション や洗浄間に起こるせん断力に耐えることが一般的に充分ではない。ｓｂｐメンバ ーは、リポソーム粒子に共有的に結合することが好ましく、その粒子は、例えば 上記に示したようなＤＯＰＥ−ＭＣＣの使用により、そのようなリポソームとメ ルカプタン基で官能性化した選択ｓｂｐメンバーとを組合わせることにより官能 性化される。例えば、ｓｂｐメンバーが抗体である場合、それは、Ｓ−アセチル メルカプトコハク酸無水物（ＳＡＭＳＡ）と反応し、加水分解して、スルフヒド リル修飾抗体を提供する。 ラテックス粒子…「ラテックス」は、粒子状で水に懸濁でき、水に不溶性のポ リマー物質を意味し、それは、直径が２０ｎｍないし２０ｍｍ、好ましくは１０ ０ないし１００ｎｍである粒子面積をもつ。ラテックスは、しばしば下記のよう な置換したポリエチレンである。：ポリスチレンブタジエン、ポリアクリルアミ ドポリスチレン、アミノ基をもつポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリメタアク リル酸、アクリロニトリルブタジエン、スチレンコポリマー類、ポリビニルアセ テート−アクリレート、ポリビニルピリジン、ビニルクロリドアクリレートコポ リマー類及び同種物。スチレンの非架橋ポリマーおよびカルボキシル化スチレン またはアミノ、ヒドロキシル、ハロ及び同種物のような他の活性基で官能性化し たスチレンが好ましい。しばしば、スチレンをブタジエンのようなジエンで置換 したコポリマーが使用される。 光増感剤および化学発光化合物と本発明で利用するラテックス粒子との関連は 、重合による粒子の形成間の導入を伴うが、通常粒子への非共有溶解により予備 形成した粒子への導入を伴う。通常、化学発光化合物および光増感剤の溶液が使 用される。利用できる溶媒は、エタノール、エチレングリコールおよびベンジル アルコールを含むアルコール類；ジメチルホルムアミド、ホルムアミド、アセト アミドおよびテトラメチル尿素及び同種物のようなアミド類；ジメチルスルホキ シドおよびスルホランのようなスルホキシド類；およびカルビトール、エチルカ ルビトール、ジメトキシエタン及び同種物のようなエーテル類および水を含む。 粒子が不溶性である、高い沸点をもつ溶媒の使用は、化合物が粒子に溶解するの を促進するために、高い温度の使用を可能にし、特に適用する。溶媒は、単独ま たは組合わせて使用する。光増感剤を導入するのに特に好ましい溶媒は、それら の本来の特性またはそれらが、粒子に不溶性である水のような溶媒に溶解する能 力によって、粒子から実質的に除去することができることのいずれかによって、 光増感剤のトリプレット励起状態を抑制しないものである。ヒドロキシル化溶媒 、すなわち、１つまたはそれ以上のヒドロキシル基を含むものが好ましく、一般 に膨張するが粒子に溶解しない溶媒が使用できる。粒子での化学発光化合物の導 入では、それらの本来の特性またはそれらが粒子から除去することによって、発 光を妨害することができないような溶媒を選択すべきである。しばしば、ヒドロ キシル化溶媒も好ましい。ジブチルフタレート、ベンゾニトリル、ナフトニトリ ル、ジオクチルテレフタレート、ジクロロベンゼン、ジフェニルエーテル、ジメ トキシベンゼン等を含む典型的な芳香族共存溶媒は、粒子の溶解を避けるために 充分に低い濃度で使用されるが、粒子を膨張するのに充分な濃度で使用される。 光増感剤および／または化学発光化合物が粒子に共有的に結合すべきである場 合を除いて、電子的に中性である光増感剤または化学発光化合物を使用するのが 通常好ましい。選択された液体媒体は、固着の点でポリマーを軟らかくしないの が好ましい。好ましい技術は、光増感剤および／または化学発光化合物が少なく とも限定された溶解度をもつ液体溶媒で選択されたラテックス粒子を懸濁するこ とを含む。好ましくは、液体媒体の光増感剤および化学発光化合物の濃度は、最 も高いシングレット酸素形成効率および媒体の化学発光化合物からの最も高い放 射量子収率をもつ粒子を提供するように選択されるが、時にはあまり濃縮されて いない溶液が好ましい。溶媒の粒子のゆがめまたは溶解は、粒子が不溶性である 混合できる共存溶媒を加えることにより避けることができる。 一般に、操作中に採用した温度は、粒子に伴われる光増感剤のシングレット酸 素形成、および粒子に伴われる化学発光化合物の量子収率を最大にするように選 択されるが、但し、粒子は選択した温度で溶融または凝集してはならない。高い 温度が標準的に使用される。操作のための温度は、一般的に２０℃から２００℃ 、さらに通常５０℃から１７０℃の範囲である。室温でほとんど不溶性であるい くつかの化合物は、高い温度で、例えばエタノールおよびエチレングリコール及 び同種物のような低分子量のアルコールに溶解することが観測されている。カル ボキシル化した修飾ラテックス粒子は、そのような温度で、低分子量のアルコー ルを許容するように示している。 ｓｂｐメンバーは、ラテックス粒子の表面で物理的に吸着するかまたは粒子に 共有的に結合する。ｓｂｐメンバーがラテックス粒子の表面に単に弱く結合する 場合、結合は、ある場合、インキュベーションおよび洗浄間に起こる粒子−粒子 間のせん断力に耐えることができない。それ故、吸着を最小限にする条件で、ｓ ｂｐメンバーがラテックス粒子に共有的に結合することが好ましい。このことは 、ラテックスの表面を化学的に活性化することにより達成する。例えば、表面カ ルボキシル基のＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステルが形成し、アッセイ成分 の粒子表面への非特異的結合を減少させる活性化粒子は、その後エステル基と反 応するかまたはアミノ基をもつｓｂｐメンバーと直接反応するアミノ基をもつリ ンカーと接触する。リンカーは、通常アッセイ成分の粒子表面への非特異的結合 を減少させるように選択され、ラテックス粒子への結合およびｓｂｐメンバーの 結 合のための適当な官能性群を提供することが好ましい。適当な物質は、マレイミ ド化アミノデキストラン（ＭＡＤ）、ポリリジン、アミノサッカライド及び同種 物を含む。ＭＡＤは、ハーバート等により、プロシーディングス・ナショナル・ アカデミー・オブ・サイエンシーズ、第７５（７）巻、第３１４３頁（１９７８ 年）に記載されているように製造することができる。 １つの方法では、ＭＡＤを、例えば１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３ −エチルカルボジイミドのような水溶性カルボジイミドを使用して、最初にカル ボキシル含有ラテックス粒子に結合する。被覆した粒子をその後非特異的結合を さけるために試薬で平衡させる。そのような試薬は、ウシガンマグロブリン（Ｂ ＧＧ）のような蛋白質、およびツイーン２０、トリトンＸ−１００及び同種物の ような界面活性剤を含む。スルフヒドリル基をもつかまたはスルフヒドリル基を 導入するように適当に修飾したｓｂｐメンバーは、その後粒子の懸濁液に加える と、共有結合が粒子上でｓｂｐメンバーとＭＡＤ間に形成される。任意の余剰未 反応ｓｂｐメンバーは、その後洗浄により除去することができる。 金属ゾルは、重金属、すなわち例えば、金または銀または、セレニウムまたは テルリウムのようなカルコゲンのようなＩＢ群金属のような、原子番号が２０以 上の重金属を含む金属ゾル粒子である。 金属ゾル粒子は、例えば米国特許第４,３１３,７３４号のリューバリングによ り記載されている。上記ゾルは、金属のコロイド状水性分散、金属化合物、また は金属または金属化合物に被覆されたポリマー核を含む。 金属ゾルは、金属または金属酸化物、金属水酸化物および金属塩のような金属 化合物であるか、または金属または金属化合物で被覆されたポリマー核である。 そのような金属の例は、白金、金、銀、水銀、鉛、パラジウム、および銅であり 、上記金属化合物の例は、ヨウ化銀、臭化銀、含水酸化銅、酸化鉄、水酸化鉄ま たは含水酸化鉄、水酸化アルミニウムまたは含水酸化アルミニウム、二酸化クロ ムまたは含水酸化クロム、酸化バナジウム、硫化ヒ素、水酸化マンガン、硫化鉛 、硫化水銀、硫酸バリウムおよび二酸化チタンである。一般に、有用な金属また は金属化合物は、既知技術によって容易に実施できる。 上記記載した金属または金属化合物で被覆したポリマー核からなる分散粒子を 含むゾルを使用することが時には有利である。これらの粒子は、純粋な金属また は金属化合物の分散相と同様の特性をもつが、大きさ、密度および金属接触は、 最適に組み合わせることができる。 金属ゾル粒子は、それ自体知られている多くの方法で製造することができる。 例えば、金ゾルの製造については、リューバリングは、ネイチャー・フィジカル ・サイエンス、第２４１巻、第２０頁（１９７３年）のＧ.フレンスによる論説 を引用している。 金属ゾル粒子は、ｓｂｐメンバー、光増感剤および化学発光化合物に連結する ための上記したような様々な官能基を含むように修飾することができる。例えば 、高分子結合剤は、多くの重金属に強く結合するチオール基、または結合して、 例えば金属粒子と、磁気粒子を被覆するためにアドバンスド・マグネティックス によりヨーロッパ特許出願第８４４００９５２.２号に記載されているトリアル コキシアミノアルキルシランとの反応によるような、高分子被覆を形成できるシ リル化剤、を含むポリマーのような粒子を被覆するのに使用することができる。 染料微結晶…純粋または混合した固体水不溶性染料の微結晶で、上に記載した 光増感剤として役立つ染料が好ましい。本発明に有用な染料微結晶は、２０ｎｍ ないし２０ｍｍの範囲の大きさをもつ。 染料微結晶を製造する１つの方法は、米国特許第４,３７３,９３２号（グリブ ナウ等）に記載されている。グリブナウは、コロイド状粒子、および疎水性染料 または色素の水性分散液を記載しており、それは免疫学的に反応する成分、およ び直接または間接的に結合する化学発光化合物をもち得る。染料粒子は、一般に 、水中に染料を分散させた後、遠心分離することにより製造される。 染料微結晶を製造する他の方法は、水と混合できる溶媒で染料の溶液を水にゆ っくり加えることである。別の方法は、水中で固体染料の懸濁液を音波処理する ことである。 染料粒子へのｓｂｐメンバーの結合は、直接または間接的、吸着または共有化 学的結合により達成できる。後者は、化学発光化合物の結合にも使用でき、任意 の被覆物質および染料中の適当な官能基の存在により制御される。例えば、官能 基は、ジアゾ化した芳香族アミノ基および所望の官能基を含む化合物を、染料の フェノール基またはアニリノ基とカップリングすることにより、染料微結晶の表 面上に導入することができる。 染料がカルボキシル基をもつ場合、染料微結晶は、カルボジイミドにより活性 化でき、第１級アミノ成分とカップリングすることができる。脂肪族第１級アミ ノ基およびヒドロキシル基は、例えば臭化シアノーゲンまたはハロゲン置換ジま たはトリアジンにより活性化することができ、その後第１級アミノ成分、または 例えば−ＳＨまたは−ＯＨ基を含む成分との結合を行うことができる。二官能性 反応化合物も使用できる。例えば、グルタルアルデヒドは、染料の第１級アミノ 成分とｓｂｐメンバーとの相互カップリングに使用することができ、また例えば Ｎ−サクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロビオネートのようなヘテ ロ二官能性試薬は、チオール基を含む成分への第１級アミノ成分のカップリング に使用することができる。 本発明の乳化剤は、次のように製造することができる。金属ゾルは、還元的沈 殿により、例えば硝酸銀溶液に対するヒドラジンの作用により、製造することが できる。油類は、水性油懸濁液の音波処理により、および／または細孔フィルタ ーを通した押出しにより、乳化することができる。油乳化剤はまた、メタノール のような水と混合できる溶媒に油を溶かした溶液を水で希釈することにより得ら れる。アニオン界面活性剤、蛋白質、リン脂質及び同種物のような、水中に存在 する界面活性剤がある場合のみ安定な乳化剤が形成する。 化学発光化合物（ＣＣ）…光により直接または増感した励起時、またはシング レット酸素との反応時に、化学的反応を受けて、通常２５０ないし１２００ｎｍ の波長範囲内の、同時にまたは続けて行う光の放射により分解することができる 、準安定な反応生成物を形成する光活性化物質。「光活性化する」という用語は 、「光化学的に活性化する」ことを含む。本発明の好ましいＣＣは、シングレッ ト酸素と反応してジオキセタン類またはジオキセタノン類を形成するＣＣである 。後者は、通常電子が豊富なオレフィン類（１）である。上記の電子が豊富なオ レフィンの典型例は、エノールエーテル類、エナミン類、９−アルキリデン−Ｎ −アルキルアクリダン類、アリールビニルエーテル類、ジオキセタン類、アリー ルアミダゾール類、９−アルキリデンキサンタン類およびルシゲニンである。本 発明で特に対象となるものは、エノールエーテル類、エナミン類および９−アル キ リデン−Ｎ−アルキルアクリダン類である。「ＣＣ」という用語に含まれる他の 化合物は、ルミノールおよび他のフタルヒドラジン類および、光化学的に不安定 な保護基によりそれらが保護されることにより、化学発光反応を受けることから 保護される化学発光化合物を含み、そのような化合物は、例えばホタルルシフェ リン、アクアホリン、ルミノール等を含む。 対象とするＣＣは、３００ナノメートル以上、好ましくは５００ナノメートル 、さらに好ましくは５５０ナノメートル以上の波長で放射するのが好ましい。試 料成分が光吸収に顕著に寄与する場合、領域を越えた波長で吸収および放射する 化合物が、本発明で特に使用される。血清の吸収は、５００ｎｍ以上で急速に少 なくなり、６００ｎｍ以上で取るに足らないものになる。それ故、６００ｎｍ以 上で光を放射する化学発光化合物は、特に重要となる。しかしながら、短い波長 で吸収する化学発光化合物は、試料の干渉吸収が存在しない場合に有益である。 化学発光化合物の自己感作を避けるために、光増感剤を励起するのに使用する 光を吸収しないことが好ましい。一般的に、増感剤は、５００ｎｍより長い光波 長で励起することが好ましいので、化学発光化合物による光の吸収が５００ｎｍ より上の波長では非常に低いことが望ましい。 化学発光化合物からの長波長放射が望ましい場合、化学発光化合物に結合する 、ピレンのような長波長エミッターを使用することができる。別法としては、蛍 光分子は、化学発光化合物を含む媒体中に含めることができる。好ましい蛍光分 子は、活性化した化学発光化合物により励起され、通常５５０ｎｍ以上である化 学発光化合物の放射波長より長い波長で放射する。蛍光分子はまた、光増感剤を 活性化するのに使用する光の波長では吸収しないことが通常望ましい。有用な染 料の例は、ローダミン、エチジウム、ダンシル、Ｅｕ（ｆｏｄ）₃、Ｅｕ（ＴＴ Ａ）₃、Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ⁺⁺（ｂｐｙ＝２,２'−ジピリジル等）を含む。一般に、 これらの染料は、エネルギー転移過程において受容体として作用し、好ましくは 高い蛍光量子収率をもち、シングレット酸素と急速に反応しない。それらは、粒 子中への化学発光化合物の導入と同時に粒子中に導入することができる。下記の ＣＣの１は、一般に化学的に反応性のアリルＣＨまたはＮＨ基を含まない。 電子が豊富にあるオレフィン類１は、一般に、オレフィン： ［式中、Ａは、例えばＮ（Ｄ）₂、ＯＤ、Ｐ−Ｃ₆Ｈ₄Ｎ（Ｄ）₂、フラニル、Ｎ− アルキルイミダゾール、Ｎ−アルキルピロリル、２−インドイル等のような電子 供与基であり、Ｄは、例えばアルキルまたはアリール、Ａはオレフィン炭素に直 接結合するかまたは他のコンジュゲートした二重結合の中間体により結合される かのいずれかである］ とのコンジュゲーションで電子供与基をもつ。オレフィン１中のＣ原子の他の原 子価は、一緒になって融合または非融合する１つまたはそれ以上の環群を形成す ることができる１ないし５０原子の置換体であり、例えばシクロアルキル、フェ ニル、７−ノルボルニル、ナフチル、アントラシル、アクリダニル、アダマンチ ル、その他である。 通常、原子が小さい二環式系の橋頭位置のような二重結合を許容できない位置 でない限り、オレフィンに直接結合する水素原子をもつ原子はない。室温で急速 に衰退する（６０分未満、好ましくは５分未満、望ましくは３０秒未満）ジオキ セタンをもつオレフィン類がさらに好ましい。ジオキセタン類は、単独でまたは 蛍光エネルギー受容体と一緒になって発光性であり得る。 エノールエーテル類２は、一般に構造： ［式中、Ｒは、１ないし２０個の炭素原子のアルキルであり、オレフィン上の残 りの置換体は、Ｈおよび好ましくは１ないし５０個の原子をもつ置換体からなる 群から選択される］ をもつ。アリール環が蛍光を与える位置で電子供与基と置換されている場合、エ ーテルと同一の炭素上にアリールをもつエノールエーテル化合物が有用である。 電子供与基は、例えばｍ−ヒドロキシフェニル、ｍ−ジメチルアミノ−フェニル 、１−（５−アミノナフチル）、ピリル、１−（３−ヒドロキシピリル）、アン トラシル、クリシル等であることができる。１位炭素を酸素で置換えることによ り形成されるケトンが、蛍光性の、例えばβ−ナフチルまたは２−アントリルで ある場合、２位の１つまたは両方の基は、アリールであり得る。エノールエーテ ル類の典型例は、次のものであり、それは例示的にかつ非限定的にあげたもので ある： 米国特許第４,９５６,４７７号のブロンスタイン等により記載された ［式中、Ｘ₁は、Ｈ、ＯＣ（Ｏ）ＣＨ₃、ＯＣＨ₃、ＯＨである］； 米国特許第４,９５６,４７７号のブロンスタイン等により記載された Ｐ.シャープにより、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエ ティー、第１０４巻、第３５０４頁（１９８２年）に、およびＰ.シャープによ り、フォトケミカル・アンド・フォトバイオロジー、第３０巻、第３５頁（１９ ７９年）に記載された ［式中、Ｘ₂は、Ｈ、ＯＨ、Ｎ（ＣＨ₃）₂またはＯＣＨ₃である］； Ｐ.シャープにより、Ｕ.Ｓ.アーミー・リサーチ・オフィスの報告、１９８６年 １０月１５日に、およびＳ.Ｄ.ガグノン、Ｐｈ.Ｄ.テシスにより、ウエイン・ス テイト・ユニバーシティー（１９８２年）に記載された ［式中、Ｘ₂は、上記と同意義であり、Ｘ₃は、Ｈ、ＯＣＨ₃またはＮ（ＣＨ₃）₂ である］； Ｐ.シャープにより、オフィス・オブ・ネイバル・リサーチの報告、１９８７年 ３月１７日に記載された ［式中、Ｘ₄＝Ｏ、Ｓ、ＣＨ₃ＮまたはＰｈＮで、Ｙ＝Ｏ、ＳまたはＣＨ₃Ｎで、 Ｐｈ＝フェニルである］； Ｐ.シャープにより、Ｕ.Ｓ.アーミー・リサーチ・オフィスの報告、１９８６年 １０月１５日に記載された エナミン類７は、一般的に構造： ［式中、Ｒ¹は、独立してアリールまたはアルキルであり、オレフィン上に残り の置換体は、Ｈおよび１ないし５０個の原子の置換体からなる群から選択される ］を有する。一般に、有用なエナミン類は、エノールエーテル類について上記し た規則に従う。 有用なエナミン類の例としては、ＯＣＨ₃のかわりにＮ（ＣＨ₃）₂をもつ上記 エノールエーテル類３−５が、例示的にかつ非限定的にあげられる。さらなる例 は、 である。９−アルキリデン−Ｎ−アルキルアクリダン類１０は、一般的に構造 ［式中、Ｒ³はアルキルであり、オレフィン上の残りの置換基は、Ｈおよび１− ５０個の原子の置換基からなる群から選択され、好ましくはフェニル、ナフチル 、フェナントリル、ｍ−メトキシフェニル、ジメチルアミノ、トリチル、メトキ シ、Ｎ−モルホレノであり、一緒になって例えばアダマンチル、Ｎ−メチルアク リダニリド、キサンタニリジン、１−（３,４−ベンゾ−５−ヒドロフリリデン ）、及び同種物、のような環を形成することもある］ を有する。 本発明で標識として有用な９−アルキリデン−Ｎ−アルキルアクリダン類の具 体例としては、次のものが、例示的かつ非限定的にあげられる。： シンガーにより、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー、第４１巻、 第２６８５頁（１９７６年）に記載された Ｅ.ホワイトにより、ケミカル・レターズ、第１４９１頁（１９７９年）に記載 された シンガー等により、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエテ ィ、第１０２巻、第３８２３頁（１９８３年）に記載された ［式中、Ｒ₄およびＲ₅は独立してＨまたはフェニルである］； マッカプラにより、ケミカル・コミュニティー、第９４４頁（１９９７年）にお よびシンガー等により、同書に記載された マッカプラにより、同書に記載された マッカプラにより、同書に記載された 上記文献の適切な箇所は、引用して本書に包含させる。 ９−アルキリデンキサンタン類は、一般に構造 ［式中、オレフィン上の置換基は、Ｈおよび原子１−５０個の置換体からなる群 から選択され、好ましくはフェニル、ナフチル、フェナントリル、ｍ−メトキシ フェニル、ジメチルアミノ、トリチル、メトキシ、Ｎ−モルホレノであり、一緒 になって例えばアダマンチル、Ｎ−メチアクリダニリド、キサンタニリジン、１ −（３,４−ベンゾ−５−ヒドロフリリデン）、及び同種物、例えば９−フェニ ルメチリデンキサンテンのような環を形成する］ を有する。 他のＣＣ類は、２,３−ジヒドロ−１,４−フタルアラジンジオン類である。最 も代表的な化合物は、５−アミノ化合物であるルミノールである。この類の他の メンバーは、５−アミノ−６,７,８−トリメトキシおよびジメチルアミノ［ｃａ ］ベンズアナログを含む。ルミノールはアッセイで標識として使用されているこ とに注意すべきであるが、しかしながら、ルミノールの励起は、本発明の場合の ような光活性化によるのではなく化学的に達成されている。これらの化合物は、 シンクレット酸素により、そして光放射で分解するスーパーオキシドまたは過酸 化水素との次の反応で１,４−フタルアジニジオン類に酸化される。 別のＣＣ類は、親産生物の通称名がロフィンである２,４,５−トリフェニルイ ミダゾール類である。化学発光アナログは、パラジメチルアミノおよびパラメト キシ置換体を含む。 上にあげた必要条件を満足させる他の化学発光化合物は、ヨーロッパ特許出願 第０,３４５,７７６号に見出される。 シングレット酸素と化学発光化合物との反応により形成されるジオキセタン類 は、炭素（Ｃ）上の置換体が相当するオレフィン上に存在する場合、以下の一般 式をもつ： あるジオキセタン類は自然に分解し、他のものは光を放射しながら熱により分 解する。いくつかの場合では、ジオキセタンは、自然にヒドロペルオキシドに変 換すると、塩基がジオキセタンを再生するのに必要になり、分解と光放射を可能 にする。 エネルギー受容体は、本書では蛍光エネルギー受容体とも称する。３１０ｎｍ より高く、標準的に３５０ｎｍより高く、好ましくは約４００ｎｍより高いかな りの吸収をもつ発色団。エネルギー受容体の選択はまた、特定のＣＣにより制御 される。エネルギー受容体は、ＣＣにより放射した光を吸収することができる。 好ましくは、エネルギー受容体の吸収最大値は、化学発光化合物の放射最大値と 同様の波長であるべきである。高い吸光度が望ましく、通常１０より多く、好ま しくは１０³より多く、特に１０⁴より多いのが好ましい。エネルギー受容体は蛍 光であるべきで、通常少なくとも０.１、好ましくは０.４以上の高い蛍光量子収 率をもつことが好ましい。 エネルギー受容体として有用な多くの異なる分子は、ウルマン等により、Ｉ、 II、IVおよびＶの第８および９欄に記載され、その適切な箇所は、引用して本書 に包含させる。上記した多くの望ましい特性をもつ蛍光体の１つの群は、３,６ −ジヒドロキシ−９−フェニルキサントヒドロールから誘導されるフルオレセイ ン、および３,６−ジアミノ−９−フェニルキサントヒドロールから誘導される ローザミン類、およびローダミン類を含むキサンテン染料である。ローダミン類 およびフルオレセイン類は、９−ｏ−カルボキシフェニル基をもち、９−ｏ−カ ルボキシフェニルキサントヒドロールの誘導体である。 これらの化合物は、結合部位としてまたは結合官能性群として使用することが できる、置換分をフェニル基上に有するものとして商業的に入手できる。例えば 、アミノおよびイソチオシアネート置換フルオレセイン化合物が入手できる。 蛍光化合物の別の群は、アルファまたはベータ位、通常アルファ位にアミノ基 をもつナフチルアミン類である。ナフチルアミノ化合物の中には、１−ジメチル アミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネー トおよび２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホネートが含まれる。 蛋白質と反応するために活性化する染料前駆体は、３−フェニル−７−イソシ アナトクマリン；９−イソシアナトアクリジンのようなアクリジン類；Ｎ−（ｐ −（２−ベンゾキサゾリル）フェニル）マレイミド；４−クロロ−７−ニトロベ ンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾールのようなベンゾキサジアゾール ；４−ジメチルアミノ−４'−イソチオシアナトスチルベンおよび４−ジメチル アミノ−４'−マレイミドスチルベンのようなスチルベン類を含む。ｓｂｐメン バーと組合わせるために官能性化され得る他の染料は、アクリジンオレンジ、７ −（ｐ−メトキシベンジルアミノ）−４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１,３− ジアゾール；Ｎ,Ｎ'−ジオクタデシルオキサカルボシアニンｐ−トルエンスルホ ネート；８−ヒドロキシ−１,３,６−ピレントリスルホン酸のようなピレン類、 および他の容易に利用できる蛍光性分子と共に、１−ピレンブチル酸、メロシア ニン５４０、ローズベンガルを含む。 ポリヌクレオチドアッセイでは、多様なエネルギー受容体が使用されるが、二 重鎖核酸に結合したとき、蛍光を増大させるものが好ましい。臭化エチジウムお よびアクリジンオレンジのようなインターカレートする染料が典型的な例である 。バートン（ジャーナル・オブ・アメリカン・ソサイエティー、第１１２巻、第 ４９６０頁（１９９０年））により発展されたルテニウム誘導体は、インターカ レーション時に劇的にスイッチオンするため、特に魅力的である。あるいは、エ ネルギー受容体は、プローブに標識した化学発光化合物の近くで結合することが できる第２ポリヌクレオチドプローブに結合するか、または、エネルギー受容体 は、結合せず、溶液中で自由に分散し得る。 光増感剤およびＣＣは、いずれも、粒子とアソシエートして本発明の基質を形 成する。この基質は、ｓｂｐメンバーと共同する。このことは、上に記載した多 くの方法で達成される。例えば、光増感剤またはＣＣまたは粒子は、ｓｂｐメン バーに結合する官能性群を含むか、またはｓｂｐメンバーは、光増感剤、ＣＣま たは粒子に結合する官能性群を含む。これらの結合は、分子間の直接結合により 達成されるか、またはｓｂｐメンバーおよび光増感剤、ＣＣまたは粒子間で連結 基を使用することができる。別の態様では、光増感剤およびＣＣは、ｓｂｐメン バーにも結合する粒子に結合するかまたは導入することができる。ｓｂｐメンバ ーは、分析物に結合することができる。光増感剤およびＣＣは、少なくとも粒子 の１つの相に溶解できるため、粒子中に導入することができる。光増感剤または ＣＣは、粒子中に導入されない場合は、粒子に結合する。この目的では、光増感 剤またはＣＣまたは粒子またはそれらの成分は、光増感剤および／またはＣＣが 粒子に結合する手段を提供するために官能性化する。油滴または脂質二重層であ る粒子では、光増感剤および／またはＣＣは、粒子組成物と適合し得る長い炭化 水素鎖への結合により、粒子に結合することができる。しばしば、８ないし２０ 個またはそれ以上の炭素原子をもつ、少なくとも１個、好ましくは２個の炭化水 素鎖が使用される。粒子がフッ化炭素の油滴である場合、光増感剤および／また はＣＣは、溶解度を増大させ、交換を減少させるためにフッ素化することができ 、連結に使用する炭化水素鎖は、フッ化炭素鎖で置き換えるのが好ましい。シリ コン粒子では、光増感剤および／またはＣＣは、ポリシロキサンに結合する。通 常、光増感剤およびＣＣの交換および極性を最小限にすることが望ましく、この やり方では、それらは粒子の非水性部分内に滞留する。ｓｂｐメンバーへの光増 感剤の結合は、本出願に十分に記載されている。 上に記載したように、光増感剤および化学発光化合物は、少なくとも粒子の１ つの相に溶解するので、粒子中に導入することができ、その場合、粒子内では光 増感剤および化学発光化合物は、バルクアッセイ培地内よりもずっと高い濃度に ある。光増感剤および化学発光化合物が粒子に共有結合する場合、光増感剤およ び化学発光化合物が粒子に共有的に結合する場合、光増感剤および化学発光化合 物または粒子、またはそれらの成分は、光増感剤および化学発光化合物および粒 子に結合する手段を提供するために官能性化する。油滴またはリポソームである 粒子では、光増感剤および化学発光化合物を、各々一般に少なくとも１０ないし ３０個の炭素原子をもつ、１つまたはそれ以上の長い炭化水素鎖に結合させるこ とができる。粒子がフッ化炭素の油滴である場合、これらの粒子中に導入される 光増感剤または化学発光化合物は、溶解度を増大させるため、および他の標識と 結合している他の粒子中への交換を減少させるためにフッ素化し、連結に使用す る炭化水素鎖は、フッ化炭素鎖に置き換えるのが好ましい。シリコン流体粒子で は、光増感剤および化学発光化合物は、ポリシロキサンに結合させることができ る。粒子あたりの光増感剤および化学発光化合物の数を最大にするために、粒子 中の非水性部分に滞留するように光増感剤および化学発光化合物の電荷および極 性を最小にすることが望ましい。粒子がリポソームで、リポソームの水相中に光 増感剤および化学発光化合物を保有することが望ましい場合、極性または電荷が 高い光増感剤および化学発光化合物を使用することが好ましい。 以下は、本発明のポリスチレン粒子の典型的な製造法を、例示的にかつ非限定 的にあげたものである。ポリスチレン粒子（１７５ｎｍ）を、光増感剤およびＣ Ｃの混合物の存在下、加熱により製造する。使用する媒体は、水、エチレングリ コールおよびベンジルアルコールの容量割合が、およそ１：８：１の混合物であ る。この混合物は、水性および有機特性のバランスを提供する。水様溶媒は、ビ ーズのコロイド状安定性を維持するのに好ましく、一方有機様溶媒は、染料を溶 解するのに好ましい。他の溶媒混合物を媒体として使用できる、しかしながら、 上記媒体は、本発明に従った多様な粒子の製造に一般的に許容できる。 光増感剤およびＣＣは、ベンジルアルコールの溶液（５ｍＭ）として個々に製 造される。様々な割合で一部が、エチレングリコール、ベンゼン９：１容量混合 物に加えられ、その混合物を１００ないし１１０℃まで加熱する。光増感剤およ びＣＣが導入されるべき適当な部分の粒子を、激しく撹拌しながら熱い混合物に 加える。加熱を短く続け、その後混合物を冷却し、エタノールで希釈する。余剰 の染料および溶媒混合物を遠心分離を繰り返して除去する。最終的に、洗浄した 粒子を好便な量の水（一般に１−１０ｍｌの水あたり１００ｍｇ）に再懸濁させ て、暗所に貯蔵する。 光増感剤、ＣＣおよびｓｂｐメンバーは、粒子と「アソシエート」して、本発 明の基質を形成する。本書中で使用されるとき、「アソシエートする」という用 語は、次のことを含む。：アソシエートは、共有または非共有結合をにより、ま たは、光増感剤およびＣＣの場合と同様に粒子中への導入を経ることである。一 般に、光増感剤およびＣＣを含ませる懸濁可能な粒子は、それに結合するｓｂｐ メンバーを有する。このｓｂｐメンバーは、一般に分析物または分析物に結合で きるｓｂｐに結合することができる。別のｓｂｐメンバーが使用され、それが分 析物に結合し得る場合、サンドイッチアッセイプロトコールが生じる。基質のｓ ｂｐメンバーはまた、分析物に類似したものであってもよく、その場合は、競合 アッセイプロトコールが生じる。 補助物質：様々な補助物質が、本発明のアッセイで頻繁に使用される。例えば 、緩衝液は、アッセイ培地およびアッセイ成分の安定剤とともに標準的にアッセ イ培地に存在する。しばしば、これらの付加物に加えて、アルブミンのような蛋 白質類；ホルムアミドのような有機溶媒；第４級アンモニウム塩類；硫酸デキス トランのようなポリアニオン類；界面活性剤類、特に非イオン性界面活性剤類； 結合エンハンサー、例えばポリアルキレングリコール及び類似物を含むことがで きる。 完全または部分的逐次配列性…本発明で利用する試料および様々な試剤が付随 的に（同時に）でなく結合する場合、１つまたはそれ以上が１つまたはそれ以上 の残りの剤と結合して副結合を形成する。各副結合は、その後、本発明の方法の １つまたはそれ以上の段階に付すことができる。こうして、各副結合は、それぞ れの条件下に培養して、１つまたはそれ以上の所望の結果を達成することができ る。 本発明は、診断アッセイ領域に格別の適用を有する。（１）分析物を含む可能 性のある媒体、および（２）光増感剤およびＣＣの両方をもつ単一組成物とアソ シエートする第１特異的結合対（ｓｂｐ）メンバーを含む標識試薬を含む組成物 が提供される。ｓｂｐメンバー複合体が分析物の存在に関して形成するように条 件を選択する。例えば、第１ｓｂｐメンバーは、分析物または第２ｓｂｐメンバ ーと結合して、分析物の存在に関する複合体を形成することができる。さらに、 本方法は、光増感剤を光活性化し、ＣＣによって発生した発光量を検出すること を含む。発光量は、媒体中の分析物の量に関連する。 一般に、光増感剤は、光の照射により活性化し、照射時に分子酸素をシングレ ット酸素に変換させる。その後シングレット酸素は、ＣＣを活性化する。シング レッ ト酸素でのＣＣの活性化により形成した生成物は、通常１０マイクロ秒ないし１ ０時間、好ましくは１００マイクロ秒ないし２時間、好ましくは１秒ないし１０ 分の寿命で、光を放射しながら自然に分解するのが好ましい。 発光に至るまでの時間を制御する因子の１つは、ＣＣの構造である。発光で衰 退に寄与する構造特性は、複雑であり、部分的にのみ予測できる。シャープ、前 掲、およびマッカプラ、前掲は、関連するいくつかの定義を論議しており、これ らの文献の適切な箇所は、引用して本書に包含させる。 発光までの時間を制御する別の因子は、組成物または粒子である。一般に、粒 子が、ＣＣが溶解する非極性物質からなる場合、衰退時間および量子効率は、極 性物質に関連して増加する。 発光までの時間を制御するのに使用する別の因子は、温度である。一般に、温 度の上昇は、衰退時間を減少させる。 発光までの時間を制御する別の因子は、反応中に産生するジオキセタンの分解 速度を増大させる活性化剤の存在である。上記活性化剤は、ハロカーボンのよう な分極性溶媒およびユウロピウムキレートのようなある金属キレートを含む。活 性化剤は、通常発光までの時間を望ましく遅らせるのに十分な量で存在する。こ の量は、活性化剤の性質により異なり、一般的に１０-3ないし１０^-1Ｍである。 光増感剤は、上記反応物を含む媒体が照射される場合、ＣＣを活性化するのに 役立つ。基質は、十分なエネルギーの波長をもつ光で照射して、光増感剤を励起 状態に変換して、それを分子酸素を活性化してシングレット酸素にすることがで きるようにさせる。基質の光増感剤濃度は、通常最大収率のシングレット酸素を 得るようにできるだけ利用して、しばしば１０^-4から１０^-1Ｍである。 光増感剤の励起状態は、通常最も低いトリプレット状態であり、少なくとも２ ０Ｋｃａｌ／モル、好ましくは少なくとも２３Ｋｃａｌ／モルであり、基底状態 よりエネルギーをもっている。一般に、基質は、約３００ないし１２００ｎｍ、 通常４５０ないし９５０、好ましくは５５０ないし８００ｎｍの波長をもつ光で 照射される。照射期間は、活性化ＣＣの寿命、光強度および所望する放射強度に より異なる。短命の活性化ＣＣでは、その期間は、１秒未満で、通常約１マイク ロ秒であるが、激しいフラッシュランプまたはレーザーが使用される場合、１マ イクロ秒と同じくらい短い。長命活性化ＣＣでは、照射期間は、長く、激しくな い定常光源が使用できる。一般に、照射期間中の面積光強度は、光増感剤分子の 少なくとも０.１％、好ましくは少なくとも３０％で励起するのに十分であるべ きで、最も好ましくは、すべての光増感剤分子が少なくとも１回励起する。 上記接近法で産生した発光または光は、可視的、写真的、光量測定的に、分光 測定的にまたは任意の他の好便な手段により測定し、媒体の分析物の量に関する それらの量を測定することができる。 ヘリウムネオンレーザーは、６３２.６ｎｍで励起する安価な光源である。こ の波長で光を吸収する光増感剤は、ヘリウムネオンレーザーの放射ラインと適合 し、それ故、本発明に特に有用である。他の光源は、例えばアルゴン、ＹＡＧ、 Ｈｅ／Ｃｄおよびルビーのような他のレーザー；ホトダイオード；水銀、ナトリ ウムおよびキセノン蒸気ランプ；タングステンおよびタングステン／ハロゲンの ような白熱ランプ；およびフラッシュランプを含む。 本発明の方法および組成物の格別な適用の１つは、分析物を測定する方法であ る。本方法は、分析物を含む可能性のある媒体を、ｓｂｐメンバーの複合体が分 析物の存在に関して形成する条件に付し、ｓｂｐメンバー複合体が形成するかど うか測定する段階を含む。本発明の粒子状組成物は、測定の助けとなる標識とし て使用する。標識試薬に関するｓｂｐメンバー複合体は、媒体中の分析物の存在 に相関して形成する。組成物はその後、光で照射し、化学発光化合物からの光エ ネルギーは、例えば目視検査、機器または蛍光エネルギー受容体の使用によって 測定され、それらの存在または強度は、媒体中の分析物の存在に相関する。 本発明の別の態様は、活性化時にシングレット酸素を発生することができる光 増感剤およびシングレット酸素により活性化することができる化学発光化合物を 含む固体基質を含む組成物である。光増感剤は、化学発光化合物に共有結合する ことができるが、通常結合しない。光増感剤および化学発光化合物の１つまたは 両方は、基質に共有的に連結できるかまたは共有結合しないで基質とアソシエー トすることができる。その組成物は、１つまたは複数の異なる化学発光化合物お よび１つまたは複数の異なる光増感剤を含むことができ、光エネルギーを集め、 それを光増感剤に転移するかまたは化学発光化合物からのエネルギーを受け入れ ることができる１つまたは複数の蛍光化合物をさらに含む。異なる化学発光化合 物は、放射の衰退速度の相違、続いてシングレット酸素による活性化により異な る。組成物はまた、蛍光性であるかまたは蛍光性ではなく、活性化化学発光化合 物の衰退を増大させる活性化剤を含む。組成物はさらに、組成物が通常粒子状で あるものに結合する特異的結合対（ｓｂｐ）のメンバーを含む。 本発明の別の態様は、シングレット酸素を発生することができる光増感剤およ びシングレット酸素により活性化することができる化学発光化合物を含む粒子で あり、その粒子は分析物の検出に有用な分子に結合することを含む組成物である 。分子は、特異的結合対のメンバーである。 光増感剤は、化学発光化合物に共有結合することができるが、標準的に、粒子 中でＣＣと非共有的にアソシエートする。光増感剤および化学発光化合物は、粒 子中に溶解する。 本発明の方法および組成物は、リガンド受容体、例えば、抗原抗体反応、ポリ ヌクレオチド結合アッセイその他のようなｓｂｐメンバーに関するほとんどのア ッセイに適用できる。これらのアッセイは、通常競合およびサンドイッチを含む 非均一系であるが、特にエネルギー受容体が利用される場合、均一系であり得る 。 蛍光エネルギー受容体を活性化するために活性化ＣＣにより生成される発光能 力は、２つのｓｂｐメンバーの結合により制御されるか、または、活性化ＣＣを 含む基質で相対的に高い濃度のエネルギー受容体の結果であり、その濃度は通常 少なくともマイクロモル、通常少なくともミリモルである。活性化が結合により 制御される場合、アッセイ培地中のエネルギー受容体の最初の濃度は、かなり低 く、しばしば１０^-15ないし１０^-6Ｍ、通常１０^-12ないし１０^-8Ｍである。 非均一系アッセイのやり方では、分析物を含む可能性のある試料は、ｓｂｐメ ンバーであり、相補的ｓｂｐメンバーを含む本発明の粒子状基質と結合する。基 質をその後、液相から分離して、固相または液相のいずれかを、通常、問題の特 定相を照射し、放射した光の量を測定することにより、発光エネルギーの存在を 試験する。別法としては、アッセイは、分離段階を使用しない均一系様式で実施 することができる。この条件では、別のｓｂｐメンバーに関連するエネルギー受 容体を使用し、そのｓｂｐメンバーが分析物に相補的（サンドイッチ）または類 似（競合）するかいずれかである。エネルギー受容体は、しばしばｓｂｐメンバ ーが結合する粒子に導入される。これらの物質は、一般に同時に、または完全ま たは部分的逐次配列性のいずれかで組合わせる。ｓｂｐメンバーの結合は、存在 する分析物の量に相関して起こり、活性化ＣＣに近接させ、放射したエネルギー を受け入れることができるエネルギー受容体をもたらす。試行で得られた数値と 既知濃度での対照を使用して得られた数値との比較は、存在の測定および分析物 の量の測定を可能にさせる。 特異的結合アッセイでは、試料は必要ならば不必要な物質を除去するために前 処理する。サンドイッチ型アッセイの免疫学的反応は、分析物に相補的で、粒子 状基質に結合するｓｂｐメンバー、例えば抗体、分析物にも相補的であるような 第２ｓｂｐメンバー、例えば抗体および対象とする試料に関する。競合プロトコ ルの免疫学的反応は、通常、分析物に相補的であるｓｂｐメンバーおよび分析物 に類似し、通常分析物の誘導体であるｓｂｐメンバーに関する。これらのｓｂｐ の１つは、粒子状基質に関連する。 分析物のアッセイは、標準的に、中性ｐＨで、一般的に最適アッセイ感受性を 提供する水性緩衝媒体で実施する。上記で説明したように、アッセイは、粒子状 基質の結合および未結合画分の分離（非均一系）で通常実施される。 水性媒体は、水単独であるかまたは０.０１から８０またはそれ以上の容量％ の共存溶媒を含む。媒体のｐＨは通常、約４ないし１３の範囲、さらに通常は約 ５ないし１０の範囲、好ましくは約６.５−９.５の範囲にある。ｐＨは、通常、 結合メンバーの最適化結合および非特異的結合を最小にし、量子効率の最大にす るｐＨ最適化間の妥協である。例えば、活性化ＣＣは、発光を産生するのに衰退 するためにあるｐＨ範囲を必要とする。 所望のｐＨを達成し、かつ測定中ｐＨを維持するために様々な緩衝液を使用す ることができる。緩衝液の例としては、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス、 バルビタール及び類似物がある。使用した特定の緩衝液は、本発明で限定的では なく、個々のアッセイでは、１つまたは多種の緩衝液が好ましい。 緩和な温度が標準的にアッセイを実施するのに使用され、測定中は、通常一定 の温度、好ましくは室温が使用される。インキュベーション温度は、標準的に約 ５℃から９９℃、通常約１５℃から７０℃、さらに多くの場合約２０℃から４５ ℃である。測定中の温度は、一般的に約１０℃から７０℃、さらに多くの場合約 ２０℃から４５℃、さらに多くの場合２０℃ないし２５℃の範囲である。いくつ かの例では、活性化ＣＣは、発光を産生するのに衰退するために１００℃まで加 熱する必要がある。 アッセイできる分析物の濃度は、一般的に約１０^-5から１０^-17Ｍ、さらに多 くの場合約１０^-6から１０^-14Ｍで変化する。測定が定性的、半測定的、測定的 であるかどうかの考慮、個々の検出技術、および対象となる分析物の濃度が、通 常各種試薬の濃度を決める。 アッセイ培地の各種試薬の濃度は、一般的に分析物の対象となる濃度範囲によ り定めるが、各試薬の最終濃度は、通常その範囲内で測定法の感受性を最適化す るために実験的に決定される。すなわち、重要な分析物の濃度の変更は、正確に 測定できるシグナルの差異を提供する。 添加の順序は幅広く変更し得るが、測定法の性質により異ってある優先がある 。最も簡単な添加の順序は、全ての物質を同時に加えることである。別法として は、試薬類を全部または一部ずつ順次に合わせることができる。場合によっては 、インキュベーション段階は、試薬を結合した後、一般的には約３０秒から６時 間、さらに多くの場合約２分から１時間の範囲で行うことができる。 非均一系アッセイでは、全ての試薬を合わせた後、所望するならば、それらを インキュベートする。その後、固体および液体相を分離し、１つの相を照射し、 生じる放射した光を測定する。放射した光は、試験した試料の分析物の量に関す る。非均一系アッセイで使用した本発明の試薬の量は、分析物の性質により異な る。 次の組成物およびアッセイは、本発明の範囲を認識し、試験を台なしにしない で本発明を実行することを、当業者に可能にさせることを提供し、例示的にかつ 非限定的にあげられる。分析物、光増感剤、ＣＣ、表面、粒子および反応条件の 選択は、本書の記載および続く実施例を考慮して当業者に提案することが適切で ある。 次のアッセイでは、成分は、主としてｐＨ６ないし８.５の水性媒体で合わせ る。 本発明の１つの態様では、化学発光化合物である９−ベンザル−１０−メチル アクリダンは、甲状腺剌激ホルモン（ＴＳＨ）の抗体に共有的に連結する。フェ ニル環に結合するカルボキシル基のＮ−ヒドロキシサクシンイミジルエステルと 官能性化する、９−ベンザル−１０−メチルアクリダンは、抗体のアミノ基と反 応する。連結基は、カルボキサミドである。利用する光増感剤は、ローズベンガ ルである。抗体に結合する光増感剤および化学発光化合物は、平均面積が０.５ ミクロンをもつラテックス粒子に共有結合して、試薬１を得る。ラテックス粒子 およびローズベンガルおよび化学発光化合物は、ラテックス上のクロロメチル基 によってお互いに共有結合する。エステル連結基を提供するクロロメチル化した ラテックスへのローズベンガルの共有結合は、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカ ン・ケミカル・ソサイエティー、第９７巻、第３７４１頁（１９７５年）に記載 されている。ＴＳＨの第２抗体は、マイクロタイタープレートウエル（試薬２） 上に吸収される。使用した両方の抗体は、標準ハイブリッドセルライン技術によ り製造したモノクローナル抗体類である。一方の抗体は、ＴＳＨのα−サブユニ ットを認識し、他方は、ＴＳＨのβ−サブユニットを認識する。アッセイを実施 する場合、ＴＳＨを含む可能性のある血清試料は、患者から得られる。 ５０マイクロリットルの試料を、ｐＨ８.０のトリス緩衝液で緩衝した５００ ｍｌの水性媒体で、上記の試薬１と合わせる。試薬１の量は、約１０^-8モルの抗 体濃度を提供するのに十分である。反応混合物をその後マイクロタイタープレー トウエル（試薬２）に加え、２５℃で１時間インキュベートする。反応混合物を その後ウエルから除去して、プレートをｐＨ８.０の緩衝水性媒体で洗浄し、そ の後５６０ｎｍの光で３０秒間照射する。照射に続いて放射した光強度を測定し 、 ３０秒にわたって検出された総光エネルギーを、既知濃度のＴＳＨをもつ試料の 同様の製法で得られた数値と比較して、未知のＴＳＨの濃度を測定する。別法と しては、インキュベーションおよびウエルからの除去に続いて、未結合ラテック ス粒子を含む反応混合物を、同様に照射して、システムから放出した光の量を測 定し、前記のような対照数値と比較する。 別のやり方では、同じ試薬１を使用する。試薬２は、第２抗体が非共有的に結 合する炭素粒子（エネルギー受容体）である。アッセイは、５０マイクロリット ルの試料、５０μｌの試薬１の懸濁液、５０μｌの試薬２の懸濁液および５００ μｌのｐＨ８.０トリス緩衝液を混合し、１時間インキュベートし、光で照射す ることにより実施する。分析物の存在は、炭素粒子が試料中にＴＳＨが存在する ために活性化化学発光化合物に接近することによって、対照と比較する場合、分 析物の存在が光放射での還元により示される。 本発明による別の態様では、油滴（試薬３）は、ギアエバー、前掲による、鉱 物油の光増感剤、クロロフィルの溶液から製造される。直径が０.１から２ミク ロンの範囲の油滴は、官能性化してヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のモノ クローナル抗体に連結する。クロロフィルは、親油性であり、それ故、親油性油 滴に不可逆的に溶解する。９−（ジフェニルメチリンデン）−Ｎ−メチルアクリ ダンはまた、アクリダンのフェニル基の１つに結合するＮ,Ｎ−ジドデシルカル ボキサミド基を含むことにより、親油性油滴に不可逆的に溶解する。上記に引用 する第１モノクローナル抗体により認識部分と異なるｈＣＧ分子の部分を認識す る、ｈＣＧの第２モノクローナル抗体は、マイクロタイタープレートの表面に吸 着する。モノクローナル抗体は、標準ハイブリッドセルライン技術により製造さ れる。ｈＣＧを含む可能性のある尿試料（５０マイクロリットル）を、ｐＨ７. ５の水性緩衝媒体（５００ｍｌ）の余剰の試薬３と合わせて、マイクロタイター プレートのウエルに置く。媒体を２０分間２５℃でインキュベートする。媒体を その後プレートから分離して、プレートをｐＨ８の緩衝液で洗浄する。プレート を１分間カットオフフィルターをもつタングステン／ハロゲンランプを使用して ６５０ｎｍ以上で照射し、放射した光を上記記載のように測定する。光の量を、 ｈＣＧを既知量含む試料を使用して上記方法に続いて放射した量と比較し、未知 試料のｈＣＧの量を数値を比較することにより測定する。このようにして、ｈＣ Ｇの好便で感度のよいイムノアッセイを実施する。鉱物油のクロロフィルと共に 、 （米国特許第５,０３９,８１８号に記載されたように製造され、これは引用して 本書に包含させる）を含むことにより、多くの光を吸収し、クロロフィルに転移 し、与えられたｈＣＧの濃度の放射した光の強度は増加することができる。 本発明の別の態様では、リポソーム（直径０.２ミクロン）が、上記目的のた めに設計した商業的に入手可能な機器を使用した０.２ミクロン細孔膜を通って 、ｐＨ７.４のｎ−アセチルチロキシンのアミド連結を通してコンジュゲートし た、ホスファチジルセリンｘ％、ホスファチジルグリセロールｙ％、ホスファチ ジルエタノールアミンｚ％およびホスファチジルエタノールアミンｑ％の懸濁液 の高圧押出しにより形成される。トリピロールジメチン染料（３４）は、リポソ ームの親油性部分に溶解する。エノールエーテルである、１−［１−（１０−カ ルボキシデシルオキシ）−２−ビニル］ピレン（３３）およびリポソームは、カ ルボキサミド連結基（試薬４）により水溶性カルボジイミドにより共有的に連結 する。 チロキシンのモノクローナル抗体は、マイクロタイタープレートの表面に吸着す る。試薬４は、結合蛋白質（５０マイクロリットル）からチロキシンに置換する アニリノナフタレンスルホン酸を含むチロキシンを含む可能性のある血清試料と 一緒になってｐＨ８.０の水性緩衝アッセイ培地（５００ｍｌ）中で合わせる。 アッセイ培地は、その後マイクロタイタープレートに合わせて、室温で１時間イ ンキュベートする。媒体をプレートから分離して、それをｐＨ８の緩衝液で洗浄 して、その後１分間６５０ｎｍで照射して、生じる放射した光を発光計により測 定する。得られた数値を、既知量のチロキシンで同様のアッセイを実施すること により得られた数値と比較する。このようにして、血清試料のチロキシンの量を 測定する。 別の態様では、アッセイは、赤い血液細胞、すなわちＡ型抗体の表面上の特定 の血液型抗原の測定である。カルボキシル基を含む表面および１５０−５００ｎ ｍの粒子径をもつ商業的なラテックス粒子を利用する。ラテックス粒子は、増感 剤、すなわちクロロフィル、および化学発光化合物３６、すなわちジオキセタン と共にエチレングリコールで加熱すると、２つの化合物は、非共有的に粒子に溶 解する。粒子の懸濁液を水溶性カルボジイミドで処理し、続いて抗体を添加、イ ンキュベーション、Ｇ１００サイズ排除カラムのクロマトグラフィーによる粒子 の分離およびトリスｐＨ８緩衝液での画分を含む粒子の希釈により、粒子はＡ型 抗原の抗体に共有的に連結する。このラテックス粒子試薬は、水性媒体（５００ ｍｌ）で全血液（１００ｍｌ）と合わせる。媒体は、２５℃で１０分間インキュ ベートする。次に、細胞を簡単な遠心分離により分離して、緩衝液で洗浄し、６ ５０ｎｍカットオフフィルターを取り付けたタングステン源で６５０ｎｍ以上の 光で３０分間照射する。照射時間に続いて細胞から放射した光を測定し、Ａ型抗 原赤血液細胞がないと知られている試料で得られた光の量と比較する。すなわち 、閾値レベルを越えた光の量は、Ａ型抗原の存在を示唆する。 別の態様では、Ｅｕ（ＴＴＡ）₃３５が、光増感剤および化学発光化合物と共 にビーズに溶解し、表面に結合する抗体類は、血液型Ｂ抗原に対することを除い て、次の実施例のラテックスビーズは、同一であるラテックスビーズと一緒に使 用する。 Ｅμ（ＴＴＡ）₃は、活性化ＣＣの発光の衰退速度を増加し、光エネルギーを 受け入れて長波長（３８０ｎｍのかわりに６１５ｎｍ）でそれを再放射すること ができる。アッセイは次の例のように実施する。照射後、細胞からの光放射をモ ニターする。３８０ｎｍの放射は、Ａ抗原の存在に関連し、６１５ｎｍの放射は 、Ｂ抗原の存在に関連する。異なる衰退速度のために、６１５ｎｍの放射は、最 初の２０秒間モニターし、３８０ｎｍの放射は約１分後にモニターする。２つの 強度は、衰退曲線の解析および／または放射波長バンドの１つだけを光検出計に 選択的に伝達するように設計したフィルターを使用することにより、測定するこ とができる。閾値を越える各波長の光の量は、相当する血液型抗原の存在に相関 する。 ＤＮＡを含む試料の標的ヌクレオチド配列のアッセイでは、標的配列に相補的 である２５塩基ヌクレオチドは、９−フェニルメチリデンキサンタンであるＣＣ２３ に関連する。ＣＣおよび光増感剤であるテトラオクタデシルポルフィリンは 、上記記載のようなラテックス粒子に共に溶解する。ラテックス表面上のカルボ キシル基は、エチレングリコールのカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシサクシ ンイミドを活性化し、その後粒子に結合する目的でアミノ基に付加するオリゴヌ クレオチドに共役する。ラテックス粒子試薬を試料および、標的配列に異なる部 位に結合することができる第２の２５塩基オリゴヌクレオチドをそれらに結合さ せる磁気粒子の懸濁液と混合する。媒体をその後７５℃まで加熱し、５５℃に冷 却 して、存在する任意の標的配列へのオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成を可 能にする。磁気粒子はその後、磁石により分離する。ペレットをその後Ｈｅ／Ｎ ｅレーザーからの１１５ｎｍ光で照射して、照射の終結に続く化学発光化合物２ ３（約３５０ｎｍ）により放射した光の強度を測定する。光の強度は、標的配列 の存在に直接相関する。 本発明の別の態様では、本発明の粒子は、アッセイで検定を提供する対照ビー ズとして使用する。ラテックスビーズ（１８０ｎｍ）の１つのセットは、クロロ フィルで染色される。「受容体ビーズ」と呼ばれるラテックスビーズ（１８０ｎ ｍ）の別のセットは、２秒の半減期で衰退する化学発光受容体である１,２−ジ フェニル−３−ｐ−ジメチルアミノフェニル−△⁵'⁶−モルホリンを含み、製造 される。クロロフィル染色ビーズは、抗蛍光抗体で被覆され、受容体ビーズはそ れらの表面に結合するアビジンをもつ。ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を 含む可能性のある血清試料５０μｌを、蛍光で標識した抗α鎖抗体およびビオチ ンで標識した抗ｈＣＧβ鎖抗体を含む溶液２００μｌを合わせる。混合物を１０ 分間インキュベートした後、各上記ビーズ２μｇおよび、クロロフィルおよび１ −フェニル−２−ｐ−ジメチルアミノフェニル−５,６−ジヒドロ−１，４−ジ オキセン、２分の半減期で衰退する化学発光化合物両方を含む１８０ｎｍ対照ビ ーズ（本発明の粒子）１μｇを含む懸濁液の混合物２００μｌに加える。混合物 を１０分間インキュベートして、その後６５０ｎｍ長パスカットオフフィルター で装備したタングステン−ハロゲンランプで１秒間照射する。次の１０秒間試料 からの放射した光（Ｓ_T）を測定して、続いて別の１０秒間隔にわたる放射した 光（Ｓ_c）を測定する。第２間隔の間に放射した光は、全て対照ビーズからであ る。光強度、光電管感受性、照度時間変化、温度等のような計量値を訂正したシ グナルＢはその後、式：Ｂ＝Ｓ_T／ＣＳ_c−１（分析物が存在しない場合はＣ＝Ｓ_T ／Ｓ_c）から計測される。所望する場合、１秒照射および１０秒測定配列は、Ｓ_c の最終１０秒測定より前に数回繰り返すことができる。この場合、Ｓ_Tは、最終 数値を除く各数値の合計であり、Ｂは同じ方法で計測する。Ｂはその後、既知量 のｈＣＧを含む１つまたはそれ以上の検定で測定する。最後に、シグナルＢを検 定 からのシグナルＢと比較して、試料のｈＣＧの濃度を測定する。 本発明は、さらに化学発光化合物および光増感剤に関連する２０ナノメーター ないし２０ミクロンの懸濁できる粒子を含む組成物を含む。化学発光化合物およ び光増感剤は、粒子基質に共有的に結合するかまたは粒子基質に非共有的に結合 するか溶解する。粒子は、高分子であるかまたは油滴またはリポソームのような 小胞であるのが好ましい。粒子がリポソームである場合、化学発光化合物および 光増感剤は、脂質二重層に関連するかまたはリポソームの水性内部で溶解する。 アッセイの使用では、ｓｂｐメンバーは、粒子に結合する。好ましくは、ｓｂｐ 結合粒子は、平均直径が１００ないし１０００ｎｍである。本発明の別の態様は 、分析物を含む可能性のある試料で分析物の存在または量を測定するための本発 明のアッセイ方法を好便に実施するのに有用なキットに関する。主題の発明の多 能性を増大させるために、試薬の割合が方法およびアッセイの実質的な最適化を 提供するように、試薬が同じまたは分離した容器の組合わせパッケージで提供す ることができる。試薬は、各々分離した容器であるかまたは、様々な試薬は、試 薬の交差反応性および安定性により異なる１つまたはそれ以上の容器で合わせる ことができる。キットは、化学発光化合物および光増感剤と関連する懸濁できる 粒子であり、その粒子は、それに結合できるｓｂｐメンバーをもつことを含む組 成物を含む。光増感剤は、ｓｂｐメンバーが結合する粒子に関することができる 。キットはさらに、ｓｂｐメンバーに結合するエネルギー受容体、付加的なｓｂ ｐメンバー、補助試薬その他のようなアッセイを実施する他の個々にパッケージ した試薬を含む。 実施例 本発明は、次に示す実施例によりさらに説明する。本書に列挙する部分および パーセントは、異なる記載がない限り重量である。温度は摂氏（℃）である。 実施例１ 光増感剤および化学発光化合物を含有する ポリスチレン粒子の製造 使用した粒子は、０.７１６μカルボキシレート修飾ラテックス（ＣＭＬ）（ デ ューク・サイエンティフィック、ロット番号７６３８）であった。 光増感剤染料は、ベンジルアルコール中のテトラｎＣ₁₀フタロシアニン（ｎＣ₁₀ ＰＣ）（ウルトラ・ダイアグノスティクス、ロット番号ＧＲ１１−８２）２. ５ｍｇ／ｍｌであった。分子量１１８０（２.１ｍＭ）。 化学発光化合物は、ベンジルアルコール中のｐ−（Ｎ,Ｎ−ジオクタデシルカ ルボキサミドメトキシ）ベンジル−９−メチルアクリダン（Ｃ₁₈ベンザルアクリ ダン）１０ｍＭであり、次のように製造した：無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ ）の１０−ジメトキシホスフィニル−９−メチルアクリダン（モナトシ・ケミス トリー、第１１４巻、第３頁（１９８８年））（分子量３０３.２７、０.１００ ｇ、３.３ミリモル）に、アルゴン下−７８℃（アセトン／乾燥氷浴）でヘキサ ン中の１.６Ｍ ｎ−ブチルリチウム溶液０.４１３ｍｌを加えた。ｎ−ブチルリ チウムの添加時に、溶液は黄色を示す。ＴＨＦの上記アミド溶液が、ｎ−ブチル リチウムの添加後２０分で加えられた。反応溶液は、一晩中室温に保温した。 次の日、生成物をＴＬＣ（シリカゲル、３：７酢酸エチル／ヘキサン）により 単離した。単離した生成物を質量分析およびＮＭＲにより分析して、暗所に貯蔵 した。 粒子製造のプロトコル：エチレングリコール０.８ｍｌ、ベンジルアルコール ０.１ｍｌ、光増感剤染料（ｎＣ₁₀ＰＣ）それぞれ１、２、４、または８μｌ（ それぞれ粒子製造Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）およびＣ₁₈ベンザルアクリダン１０μｌを共 に混合して、混合物を１分間１００−１１０℃に加熱した。その後、０.７１６ μｌのＣＭＬ０.１ｍｌを混合物に加え、それを１００−１１０℃で５分間加熱 した。混合物を室温まで冷却した。エタノール等量を加え、混合物を３０分間１ ５Ｋで遠心分離した。遠心分離したものをデカントし、粒子をエタノール２ｍｌ を加え、上記記載のように遠心分離した。洗浄および遠心分離段階を水を使用し て繰り返した。粒子を水に再懸濁させて、最終容量が約１ｍｌで１.０％固体、 すなわち、１ｍｌあたり４.９５×１０¹⁰粒子であった。 粒子により放射した光をターナーＴＤ−２０ｅ発光計を使用して記録した。衰 退時間は０で、インテグラルは２０秒であった。しばしば、余分に２０秒間の数 値を読み取り、粒子の衰退半減期を測定した。粒子をハロゲンランプおよび６５ ０ｎｍカットオフフィルターを使用して６０分間照射した。 典型的に、上記からの粒子懸濁液１０μｌをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ） で１ｍｌまで希釈した。希釈した粒子１００μｌを放射した相対光ユニット（Ｒ ＬＵ）を測定するのに使用した。結果は、次の第１表に要約される。 界面活性剤の効果：粒子１０μｌを、上記記載のように、ＰＢＳで希釈するか わりに１％トリトンＸ−１００（製造Ｆ）１ｍｌに希釈した。結果は、次の第２ 表で要約される。 界面活性剤の効果はほとんどないことが観測された。このことから、光増感剤 およびＣＣは、ポリスチレン粒子に深くインターカレートするという結論が引き 出される。 実施例２ 光増感剤、化学発光化合物およびエネルギー受容体 を含有するポリスチレン粒子の製造 試行Ａ．試薬：（１）０.１７５μＣＭＬ（１０％水性懸濁液）１ｍｌ、（２ ）反応媒体（Ｘ₂がＮ（ＣＨ₃）₂である１０ｍＭジオキセン１０、２０ｍＭユウ ロピウムテノイルトリフルオロ酢酸（ＥｕＴＴＡ）、６０ｍＭトリオクチルホス フィン酸化物（ＴＯＰＯ）を含むエトキシエタノール１ｍｌ）および（３）光増 感剤貯蔵溶液（ベンジルアルコール２.５ｍｇ／ｍｌ（分子量１１８０）、およ そ２. １ｍＭの分離溶液から製造したテトラｎＣ₁₀フタロシアニン（実施例１参照）（ ｎＣ₁₀ＰＣ）） ＣＭＬ粒子１ｍｌをエトキシエタノール１ｍｌと合わせ、油浴で約１００℃に 温めた。激しく撹拌しながら、上記反応媒体１ｍｌを粒子に加えた。この直後に ｎＣ₁₀ＰＣ（１０、２５または５０μｌ）を加えた。混合物を水の沸点よりわず かに低く保つよう努力したが、時々沸騰が観測された。 試行Ｂ．上記Ａと同様の方法は、クロロフィル（クロルａ）が光増感剤貯蔵溶 液でｎＣ₁₀ＰＣのかわりの光増感剤である粒子を製造するのに使用した。光増感 剤貯蔵溶液のクロルａの濃度はベンジルアルコール中５ｍＭであった。１０、２ ５および５０μｌのクロルａを使用した。 １０分間の加熱に続いて、混合物を油浴から除去し、室温まで冷却した。混合 物をその後エタノール６ｍｌで希釈し、３０分間１５Ｋで遠心分離した。上清を 廃棄し、ペレットを５０％エタノール溶液で音波処理することにより再懸濁した 。遠心分離を繰り返し、続いて５０％エタノールで別に洗浄した。遠心分離の最 終ペレットを１０％エタノール溶液で再懸濁させて、１重量％、すなわち１０ｍ ｇ／ｍｌ（１ｍｌあたり３.３５×１０¹²粒子）の粒子濃度を得た。 上記で製造した粒子の化学発光を調査した。粒子（試行Ａまたは試行Ｂ）を０ .１Ｍトリス０.３ＭＮａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡｐＨ８ .２の１０μｇ／ｍｌで希釈した。希釈した混合物０.１ｍｌを６１０ｎｍのロン グパスフイルターを装備したハロゲンランプで６０秒間照射した。化学発光の最 初の２０秒インテグラルをターナーＴＤ２０ｅ発光計で記録した。結果は、第３ 表で要約される。 粒子の検出能力：１μｇ＝３.３５×１０⁸粒子または５.５６×１０^-16モル。 検出能力をＩＲＬＵと定義し、その後上記粒子（試行Ａ）の１０^-18モルが検出 できる。これは、１ミクロン粒子よりわずか少ない。 およそ１ｍｇ／ｍｌでの粒子（試行Ａ）懸濁液をハロゲンランプおよび６１０ ｎｍフィルターで３０秒間照射した。粒子をその後蛍光計に置き、放射した波長 を走査した。わずかなジオキサン１０の放射が約４２０ｎｍで観測されるが、放 射した光の大部分は、約６１３ｎｍでのＥｕＴＴＡからのものであった。 同じ実験が試行Ｂからの粒子で実施され、同様な結果が得られた。 実施例３ 甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）のアッセイ 略語： Ａｂ₁−ビオチン −ＴＳＨのビオチルニル化抗体 Ａｂ₂−フルオレセイン（ＡＢ₂−Ｆ） −フルオレセインがコンジュゲートする ＴＳＨのモノクローナル抗体 Ａｂ_FまたはＩＧ（Ａｂ_F） −上記で引用したような標準ハイブリッド細胞技術 により製造したセルライン３Ｇ１からのフルオレセインの抗体 ＢＳＡ −ウシ血清アルブミン、シグマ・ケミカル・カンパニー、セント・ルイ ス、ミズーリ、カタログ番号Ａ−７８８８ Ｄ−Ｈ₂Ｏ −脱イオン水 ＥＤＡＣ −１−エチル−３−（３−ジメメチルアミノプロピル）カルボジイミ ド塩酸塩、シグマ・ケミカル・カンパニー ＧＢ−アビジン −アビジンで被覆したガラスビーズ（直径０.５ｃｍ）、ニコ ルズ・インスティテュート・ダイアグノスティクス、サン・ジュアン・カピスト ラノ、カリフォルニア Ｎａｐｉ −リン酸ナトリウム ＰＢＳ −リン酸緩衝生理食塩水、０.０２Ｍ ＮａＰｉ、０.１５Ｍ ＮａＣｌ 、ｐＨ７.３ ＲＬＵ −相対光ユニット ＳＡＴＡ −Ｓ−アセチルチオグリコール酸−ＮＨＳエステル、シグマ・ケミカ ル・カンパニー スルフォ−ＮＨＳ −スルフォ−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド、ピアース・ケ ミカル・カンパニー βＴＳＨおよびフルオレセイン（Ａｂ₂−Ｆ）の抗体のコンジュゲートの製造： Ａ.物質： ６−カルボキシフルオレセイン（コダック、ロチェスター、ニューヨーク）； ４,９−ジオサ−１,１２−ドデカンジアミン、アルドリッチ・ケミカル・コーポ レイション、ミルウォーキー、ウイスコンシン）；酸化カルシウムから蒸留した 乾燥ＤＭＦ；Ａｇ−ＭＰ−１（Ｃ１^-）陰イオン交換樹脂、バイオラド・ラボラ トリーズ、リッチモンド、カリフォルニア）；ケラーおよびミリシュタイン、ネ ィチャー、第２６５巻、第４９５−４９７号（１９７５年）により記載された方 法と同様の方法を使用して標準ハイブリッド細胞培養技術により製造したハイブ リッドセルライン９Ｇ３からのＴＳＨ（Ａｂ₂）のモノクローナル抗体。 Ｂ.フルオレセインアミン塩酸塩（Ｆ−ＬＣ−アミン）： ６−カルボキシフルオレセイン（１０ｇ、２６.６モル）を乾燥ジメチルホル ムアミド（ＤＭＦ）（２５ｍｌ）に溶解した。Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（ ＮＨＳ）（シグマ・ケミカル・カンパニー）（３.２２ｇ、２８ミリモル）を、 固体としてＤＭＦ溶液に加え、溶解させた。混合物をその後氷浴で冷却した。ジ シクロヘキシルカルボジイミド（アルドリッチ・ケミカル・コーポレイション） （５.８ｇ、２８ミリモル）を乾燥ＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解して、直ちに全部 を冷ＤＭＦ溶液に加えた。混合物を３０分間氷浴の温度で撹拌し、室温にもどし た。反応の経過を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（１％酢酸を含む１０％メ タノール−ＣＨ₂Ｃｌ₂）で追った。３時間後、フルオレセインＮＨＳエステルの 形成が完全であった。 ４,９−ジオキサ−１,１２−ドデカンジアミン（２５.５ｇ、１２５ミリモル ）を乾燥ＤＭＦ（１０ｍｌ）で希釈した。フルオレセインＮＨＳエステル反応混 合物をアルゴン気流下氷で冷却し、ジアミン溶液を５分間にわたって滴下して加 えた。冷却浴を除去し、室温で撹拌を続けた。反応の経過を上記系を使用したｔ ｌｃで追った。反応が完全であると判断したとき、混合物を水（１００ｍｌ）で 希釈し、氷で冷却して、ジシクロヘキシル尿素を沈殿させて、濾過により除去し た。 濾液をＡＧ−ＭＰ−１（Ｃ１−）陰イオン交換樹脂でスラリーし、クロマトグ ラフィーカラムに注いだ。遊離アミンがニンヒドリンによってこれ以上検出され なくなるまで、樹脂を５０％水性メタノールで洗浄した。樹脂をその後５０％水 性メタノールで０.１Ｎ塩酸で溶出した。フルオレセインアミン塩酸塩を最初に 溶出し、続いて６−カルボキシフルオレセインを溶出した。純画分を貯蔵し、回 転エバポレーター（ロートバップ）で乾燥させた。高圧で乾燥後、純フルオレセ インアミン塩酸塩３.４ｇを回収した。 Ｃ．Ｆ−ＬＣ−ジクリコレート（Ｆ−ＬＣ₁₈−ＣＯＯＨ）の製造： 上記Ｂで記載したように製造したＦ−ＬＣアミン（５００ｍｇ、０.８７ミリ モル）をＤＭＦ６ｍｌに溶解した。トリエチルアミン（ＴＥＡ）（１２１μ、０ .８７ミリモル）をＤＭＦ溶液に加えた。ジグリコール無水物（アルドリッチ・ ケミカル・コーポレイション）（１０１ｍｇ、０.８７ミリモル）をＤＭＦ１ｍ ｌに溶解して、混合物に加えた。さらにジグリコール無水物２５ｍｇを余分に、 シリカゲルＴＬＣ、メタノール−ジクロロメタン−酢酸（２０：７９：１）によ り判断して、反応が完了となるまで加えた。 溶媒をロートバップで除去して、残留物をメタノールに溶解した。メタノール 溶液をポリスチレンバイオビーズＳＭ−２（バイオラド・ラボラトリーズ）でス ラリー化した。ビーズを水で洗浄して、ジグリコール酸およびＴＥＡを除去した 。生成物をその後大量のメタノールでバイオビーズから取り除いた。ロートバッ プでのメタノールの除去後、生成物５６０ｍｇを回収した。この物質は、さらに 精製またはキャラクタリゼイションせずに使用した。 Ｄ．Ｆ−ＬＣ₁₉−ＮＨＳエステルの製造 Ｆ−ＬＣ₁₉−ＮＨＳエステルを、Ｆ−ＬＣ₁₈−ＣＯＯＨ（上記Ｃに記載したよ うに製造した無水ＤＭＦ３００μ）と、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣ Ｃ）（無水ＤＭＦ１００μ）１２ｍｇとの混合により製造した。反応混合物を、 堅く密閉したバイアルで、５時間室温で静かに撹拌した。その後、反応混合物を ガラスウールに通して濾過して、シクロヘキシル尿素（本反応の副産物）を除去 した。濾過した反応混合物を、（未反応ＤＣＣを除去するために）ヘキサン２ｍ １で抽出した。Ｆ−ＬＣ₁₉−ＮＨＳの形成は、ジクロロメタン：メタノール（８ ０：２０）溶媒系を使用したＴＬＣで確証した。 Ｅ．Ａｂ₂−Ｆ Ａｂ₂ＩｇＧは、標準方法により、免疫したプロテインＡ（リプリゲン・イン コーポレイテッド、ケンブリッジ、マサチュセッツ）によるＡｂ₂の精製により 製造した。Ａｂ₂−Ｆは、室温で２時間、０.０５ＭＮａＰｉ、０.１ＭＮａＣｌ ／ｐＨ７.６の５.６ｍｇ／ｍｌＡｂ₂ＩｇＧ１ｍｌと、Ｆ−ＬＣ₁₉−ＮＨＳ（Ｉ ｇＧ：Ｆ−ＬＣ₁₉−ＮＨＳ＝１：２０）を含む無水ＤＭＦ２０μとの反応により 製造した。その後、反応混合物を、０.０２ＭＮａｐｉ、０.１５ＭＮａＣｌ、ｐ Ｈ７.４で平衡させたセファデックスＧ−２５（１.５×２０ｃｍ）カラムにより 精製した。ハプテン数は、標準方法により測定し、２.９（ＩｇＧあたり２.９フ ルオレセイン分子）であると見出した。最終生成物を分割して冷凍保存した。 ＴＳＨのビオチニル化抗体（Ａｂ₁−ビオチン）の製造 ベータ−ＴＳＨの抗体（Ａｂ₁）は、ビイオスパシフィック、４０５ハーレン ・ストリート、エマリービル、カリフォルニアからのハイブリッドセルライン２ １０１からのものであった。ＴＳＨの抗体（Ａｂ₁、０.０５ＭＮａＰｉ、０.０ ５ＭＮａＣｌ／ｐＨ７.８中約２−２.５ｍｇ／ｍｌ）およびビオチン−ＬＣ₇− ＮＨＳ（ピアース・ケミカル・コーポレイション、ロックフォード、イリノイ） （ＤＭＦで最初溶解させて、反応として少量使用する）を共に混合して、４℃で ３時間インキュベートした。反応混合物では、反応物のモル比は、Ａｂ₁：ビオ チン−ＬＣ₇−ＮＨＳ＝１：２５であった。未結合ビオチンをセファデックス（ 商標）Ｇ−２５カラムにより除去した。最終コンジュゲートを０.０５ＭＮａＰ ｉ、０. ００１％チメロサール／ｐＨ＝７.４で、４℃または冷凍貯蔵した。 粒子で被覆した抗フルオレセイン抗体の製造： 本実施例で使用した粒子は、シングレット酸素受容体染料Ｃ₁₈ベンザルアクリ ダン、および実施例１で記載したようにして製造したシングレット発生剤または 増感染料（ｎＣ₁₀ＰＣ）をもつ、０.０４μカルボキシル化ポリスチレンビーズ であった。 ＥＤＡＣ／スルフォ−ＮＨＳコンジュゲーション化学は、Ａｂ_Fをこれらのポ リスチレンビーズ（Ａｂ_F−ビーズ）に結合させるのに使用される。典型的には 、実施例１からのカルボキシル化したポリスチレンビーズ６ｍｇ／ｍｌ、および スルフォ−ＮＨＳ（ｐＨ５.５に調整）１１ｍｇ／ｍｌを含む、０.０２ＭＮａＰ ｉ１０ｍｌを、新しく製造したＤ−Ｈ₂Ｏ中ＥＤＡＣ２００ｍｇ／ｍｌ１ｍｌと 混合した。室温（暗所）で２５分間インキョベートした後、ビーズを遠心分離に かけて、余剰ＥＤＡＣを除去した（ＥＤＡＣはこれらのビーズの微量凝集を引き 起こすため、１５０００ｒｐｍでＳＡ−６００ローターを使用したソルバル遠心 分離機を用いる通常の遠心分離により、それらをペレットにすることができる） 。ペレットにしたビーズを、音波処理により０.００５ＭＮａｐｉ／５.８の３ｍ ｌで再懸濁し、その後０.０２Ｍボラックス（シグマ・ケミカル・カンパニー） １５ｍｌ、０.０８ＭＮａＣｌ、３Ｇ１ＩｇＧ（Ａｂ_F）の２ｍｇ／ｍｌ、および ＢＳＡ／ｐＨ８.９の８ｍｇ／ｍｌを含む撹拌した蛋白質溶液中に移した。混合 物を４℃で一晩静かに（撹拌しないで）混合した。ビーズ上の残留する反応基（ もしあれば）は、ｐＨ８.９、４℃で６０分間０.０８３ＭグリシンおよびＢＳＡ １５ｍｇ／ｍｌで処理して遮蔽した。未結合蛋白質をｐＨ７.６で０.０５ＭＮａ Ｐｉ、０.１５ＭＮａＣｌで連続して洗浄することにより除去した。最終ペレッ トを洗浄する緩衝液で再懸濁して、音波処理して、４℃で貯蔵した。これらのビ ーズの最終サイズは１４０ｎｍであった。 ＴＳＨアッセイ： ＴＳＨアッセイは、ＴＳＨ遊離血清（０、０.１、１、１０および１００ｎｇ ／ｍｌ）のＴＳＨ検定２００μｌを、１２×７５ｎｍグラス試験管に移し、続い てアッセイ緩衝液（０.０５ＭＮａｐｉ、０.１５ＭＮａＣｌ、ＢＳＡ／ｐＨ７. ６ ４ｍｇ／ｍｌ）のＡｂ₁−ビオチン２μｇ／ｍｌおよびＡｂ₂−フルオレセイ ン（９Ｇ３）１μｇ／ｍｌにより実施した。この混合物を室温で１時間インキュ ベートした。この混合物に、１ＭＮａ₃クエン酸／ｐＨ７.１７の１００μｌを加 え、続いてアッセイ緩衝液の１.０ｍｇ／ｍｌＡｂ_F−ビーズ１.０ｍｇ／ｍｌの １００μｌを加えた。形成した免疫複合体を、アビジンで被覆した０.５ｃｍガ ラスビーズにより未結合画分から分離した（使用した試験管あたり１グラスビー ズ）。アッセイ混合物を室温で２.５時間ガラスビーズでインキュベートした（ 暗所で撹拌）。インキュベーション後、各ガラスビーズをＰＢＳ１ｍｌ、１％ト リトンＸ−１００、０.５ＭＮａＣｌ／ｐＨ７.２で４回洗浄した。最終的に、各 ガラスビーズを１分間照射して、放射した光をターナー・デザインズ、モデル２ ０ｅの発光計を使用して２０秒ごと計測した。 第４表に要約した結果は、ＴＳＨに関連した特異的シグナルが発生していたこ とを示す（検定中０.１−０.５ｎｇ／ｍｌＴＳＨの感度） 以上の発明は、明瞭化ならびに理解の目的で、例示的に、かつ実施例としてか なり詳細に記載されているが、添付する請求の範囲内で変更または修飾して実施 できることは明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウェグナー、ダニエル・ビー アメリカ合衆国94087カリフォルニア州、 サニーベイル、ティコンデロガ951番 (72)発明者 ウルマン、エドウィン・エフ アメリカ合衆国94025カリフォルニア州、 アサートン、セルビー・レーン135番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．物質を、（ａ）照射時にシングレット酸素を発生することができる光増感 剤、および（ｂ）シングレット酸素により活性化することができる化学発光化合 物と合わせることを含んでなり、ただし、該光増感剤および化学発光化合物は、 非粒子状固体基質または粒子状基質中に含められているものである、該物質を検 出する方法。 ２．該方法が、さらに、 （ａ）上記物質を波長２００−１０００ｎｍの光で照射し、 および （ｂ）上記化学発光化合物により放射した光を検出する ことを含んでなる、請求の範囲第１項記載の方法。 ３．（ａ）照射時にシングレット酸素を発生することができる光増感剤、およ び（ｂ）シングレット酸素により活性化することができる化学発光化合物、を含 めた固体または粒子状基質を含んでなる組成物を、照射する段階を含む、遅延し た発光を発生させる方法。 ４．（１）分析物を含む可能性のある媒体、（２）活性化時にシングレット酸 素を発生することができる光増感剤、および該光増感剤の活性化時にシングレッ ト酸素を発生して化学発光化合物を活性化するようなシングレット酸素により活 性化することができる化学発光化合物、を有する粒子とアソシエートするする第 １特異的結合対（ｓｂｐ）メンバー、ただし、上記第１ｓｂｐメンバーは、上記 分析物または第２ｓｂｐメンバーに結合して、上記分析物の存在に相関する複合 体を形成するものである、を含む標識試薬との組み合わせを提供し、 上記光増感剤を活性化し、さらに 上記化学発光化合物により発生する、ただし、その量が上記媒体中の分析物の量 に相関するものである、発光量を検出することを含んでなる、分析物を測定する 方法。 ５．該光増感剤が、メチレンブルー、ローズベンガル、ポルフィリン、クロロ フィルおよびフタロシアニン類からなる群から選択される染料である、請求の範 囲第４項記載の方法。 ６．該化学発光化合物が、オレフィン基、および該オレフィンとのコンジュゲ ーションにおいて電子供与する１つまたはそれ以上の置換基を含有する、請求の 範囲第４項記載の方法。 ７．該化学発光化合物が、９−アルキリデン−Ｎ−メチルアクリダン、エノー ルエーテル類およびエナミン類からなる群から選択される、請求の範囲第４項記 載の方法。 ８．活性化時にシングレット酸素を発生することができる光増感剤、およびシ ングレット酸素により活性化することができる化学発光化合物を含ませた固体基 質を含んでなる組成物。 ９．活性化時にシングレット酸素を発生することができる光増感剤、およびシ ングレット酸素により活性化することができる化学発光化合物を含ませた油滴、 リポソームおよび乳化剤からなる群から選択される流体粒子を含んでなる組成物 。 １０． （ａ）請求の範囲第８項の組成物、および （ｂ）特異的結合対のメンバー、 または、 （ａ）請求の範囲第９項の組成物、および （ｂ）特異的結合対のメンバー を含んでなるキット。 １１． （ａ）照射時に光を放射することができる発光組成物および請求の範囲第８項の 組成物、ただし、該組成物の１つは、光によって活性化する場合に、他方の衰退 時間より実質的に長い光放射の衰退時間を有するものである、を媒体中で合わせ 、 （ｂ）該発光組成物および請求の範囲第８項の組成物を活性化させるために該媒 体を照射し、 （ｃ）短い方の衰退時間を有する活性化組成物の衰退中に放射した光の強度を測 定し、 （ｄ）段階（ｃ）の上記測定後および短い方の衰退時間を有する活性化組成物の 少なくとも部分的な衰退の後の放射光強度を測定し、さらに （ｅ）短い方の衰退時間を有する活性化組成物の衰退中に放射した光の強度と、 内部検定を提供するための段階（ｄ）で放射した光強度とを比較する、 各段階を含んでなる、発光組成物により放射した光強度を検定する方法。