CN109164097A - 基于智能手机拍照功能快速检测红酒中抗氧化剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于智能手机拍照功能快速检测红酒中抗氧化剂的方法，该方法基于MnO₂纳米片在氧气环境中能催化无色的3,3׳,5,5׳‑四甲基联苯胺（TMB）转化为蓝色的氧化态3,3׳,5,5׳‑四甲基联苯胺（oxTMB）的特性，并利用没食子酸将MnO₂纳米片还原成二价锰离子来抑制TMB催化显色，通过智能手机拍照功能并分析样品颜色与没食子酸浓度之间的关系，达到简便快速检测红酒中抗氧化剂浓度的目的。本发明将日常生活中使用的智能手机作为便携式检测仪器，并结合纳米探针材料的优异特性应用到食品功效评价中，开拓了智能手机与纳米技术在食品快速检测领域的新应用。

Description

基于智能手机拍照功能快速检测红酒中抗氧化剂的方法

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种基于智能手机拍照功能快速检测红酒中抗氧化剂的新方法。

背景技术

红酒是用新鲜葡萄或葡萄汁作为原料，经过全部或部分发酵酿造而成的酒精饮品。红酒的组成成分十分复杂，已有研究表明除了水和乙醇外，红酒中还含有其他物质超过1000种，其中在物理化学性质及保健功效上有重要作用并已经被定量鉴定的物质多达350种以上，包括由糖、甘油、多酚及果胶类物质组成的固形物；酒石酸、乳酸、苹果酸、琥珀酸等多种有机酸；钾、钙、铁、铜等多种矿物质等。红酒的抗氧化活性主要来源于其含量丰富的多酚类物质，由于酚类物质具有特殊的酚羟基结构，可以提供电子和活泼氢以捕捉多种自由基，从而阻止自由基对人体造成损伤。近年来，从各质检部门的报告可看到，市场上存在大量不合格的红酒，其中抗氧化剂含量偏低是主要问题之一。

食品中抗氧化剂含量检测的常用方法主要分为三大类：自由基清除率测定法、油脂抗氧化活性测定法、福林酚测定法。自由基清除率测定法的原理是自由基与抗氧化剂反应，通过测定对反应中任意一步生成物的清除率，就可一定程度上表征抗氧化剂的活性(郭金英等.红酒、啤酒和白酒抗氧化作用的研究[J].酿酒科技,2009,183(3):41-45)。油脂抗氧化活性测定法是通过食品所含的不饱和双键在氧化作用下能发生链式反应产生大量的自由基，同时机体内外的羟高铁血红素等也能起一定的催化作用，产生相同的自由基，然后测定对反应中任意一步生成物的清除率，就可在一定程度上表征其抗氧化活性(Bonilla Eet a1.Extraction of phenolic compounds from red grape marc for use as foodlipid antioxidants[J].Food Chemistry,2000,66:207-212)。福林酚法是通过多酚类化合物在碱性溶液中可被钨钼酸定量氧化，钨钼酸自身被还原(使W⁶⁺变为W⁵⁺)生成蓝色的化合物，蓝色的深浅程度与含酚基团的数目成正比，从而测定样品中总酚含量(徐梦梦.脱醇过程对红酒品质和抗氧化性能的影响[D].浙江工商大学,2013)。上述三种方法均需要依赖分光光度计作为检测仪器，同时测定所需时间较长，不利于广泛使用。因此，开发操作简便、快速、灵敏度高、实用性强的红酒中抗氧化剂含量检测新方法新技术具有十分重要的意义。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，本发明的目的在于提供一种基于智能手机拍照功能快速检测红酒中抗氧化剂的新方法，该方法操作简便、检测时间短、灵敏度高、实用性强。

二氧化锰(MnO₂)纳米片是一种典型的二维纳米材料，它由许多共边的‘MnO₆’八面体片成构成，具有很宽的吸收范围(200-600nm)且在380nm处的消光系数很大(9.6*103M^{- 1}cm^-1)。研究发现，MnO₂纳米片具有类似氧化酶活性，在氧气环境中能使无色的催化底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)转化成蓝色氧化态的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(oxTMB)。发明人进一步研究发现，利用智能手机拍照功能联合对MnO₂纳米片-TMB催化体系的颜色变化相关参数分析，可实现红酒中抗氧化剂的含量检测。该方法具有快速、便捷、灵敏度高的优点，且整个检测过程所需设备仅需一部常见的智能手机。

本发明的目的是这样实现的：

一种基于智能手机拍照功能快速检测红酒中抗氧化剂的方法，其特征在于：红酒中抗氧化剂可以将MnO₂纳米片部分或全部还原成二价的锰离子，使其类氧化酶活性受到抑制，即降低TMB转变为oxTMB的转化率，使得溶液由蓝色变浅，同时做空白试验；根据智能手机拍照功能捕获图片，由手机APP分析得到的R、B、G或Gray值与抗氧化剂(以没食子酸作为抗氧化剂标准物质)浓度之间的线性关系来计算红酒中抗氧化剂的含量。

本发明所述红酒中抗氧化剂为多酚类抗氧化剂，在检测多酚类抗氧化剂时，以没食子酸(3,4,5-三羟基苯甲酸)来标定。

在一个实施方案中，上述智能手机分析图片的APP为Color Piker-Play。更进一步，上述基于智能手机拍照功能快速检测红酒中抗氧化剂的方法，根据智能手机APP ColorPiker-Play分析捕获图片的R值与没食子酸浓度存在的线性关系计算红酒中抗氧化剂的含量。

在另一个实施方案中，上述基于智能手机拍照功能快速检测红酒中抗氧化剂的方法，其特征在于：将MnO₂纳米片溶液与红酒(或红酒稀释液)混合均匀，加入醋酸-醋酸钠缓冲液和TMB进行化学反应，反应结束后用智能手机拍照功能拍摄样品图片，再用APP ColorPiker-Play分析图片中样品的R值，同时做空白试验；根据R值与没食子酸浓度建立标准曲线，即可算出红酒中抗氧化剂的含量。

进一步，上述基于智能手机拍照功能快速检测红酒中抗氧化剂的方法，其特征在于，采用如下步骤：取0.6mg/10mL MnO₂纳米片溶液与红酒原液直接稀释100倍的红酒稀释液充分混匀5分钟后依次加入蒸馏水、pH＝5的醋酸钠-醋酸缓冲液和0.4mM TMB，待反应15分钟后用智能手机拍照功能拍摄样品图片，再用APP Color Piker-Play分析图片中样品的R值，同时做空白试验；所述红酒中抗氧化剂含量按下式计算：

y＝10.5967x+3.6723，r＝0.9847；

式中，x为红酒中抗氧化剂浓度，单位μmol/L；y为智能手机APP Color Piker-Play分析得到的R值；r为所建立标准曲线的相关系数。

更进一步，上述基于智能手机拍照功能快速检测红酒中抗氧化剂的方法，其特征在于，采用如下步骤：

(1)标准曲线的绘制

取0.6mg/10mL MnO₂溶液800μL于4mL的离心管中加入800μL浓度分别为0.6μM、1μM、2μM、3μM、4μM、6μM、8μM、10μM、12μM、15μM的没食子酸，充分混匀5分钟后依次加入800μL蒸馏水、800μL pH＝5的醋酸钠-醋酸缓冲液和800μL0.4mM的TMB溶液，待反应15分钟后用智能手机捕获样品图片，再用APP Color Piker-Play分析图片中各标准样品对应的R值，根据R值与没食子酸浓度建立标准曲线；

(2)样品检测

取0.6mg/10mL MnO₂纳米片溶液800μL于4mL的离心管中加入800μL由红酒原液直接稀释100倍的红酒稀释液，充分混匀5分钟后依次加入800μL蒸馏水、800μL pH＝5的醋酸钠-醋酸缓冲液和800μL 0.4mM的TMB溶液，待反应15分钟后用智能手机拍照功能拍摄样品图片，再用APP Color Piker-Play分析图片中样品的R值，同时做空白试验；

(3)结果计算

红酒中抗氧化剂含量按下式计算：

y＝10.5967x+3.6723，r＝0.9847；

式中，x为红酒中抗氧化剂浓度，单位为μmol/L；y为智能手机APP Color Piker-Play分析得到的R值；r为所建立标准曲线的相关系数。

有益效果：

本发明将日常生活中使用的智能手机作为便携式检测仪器，并结合纳米探针材料的优异特性应用到食品功效评价中，开拓了智能手机与纳米技术在食品快速检测领域的新应用。本发明利用MnO₂纳米片在氧气环境中能使无色的催化底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)转化成蓝色氧化态的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(oxTMB)的特性，以没食子酸作为还原剂，将MnO₂纳米片还原成二价锰离子，由于二价锰离子在氧气环境中不能使TMB显色，从而没食子酸浓度在一定范围内与TMB显色呈线性关系，进而可以通过比色法达到简便快速检测没食子酸浓度目的。在实际操作过程中，凭肉眼辨色来估计红酒中抗氧化剂含量会导致误差过大，发明人创造性地利用智能手机拍照功能联合对MnO₂纳米片-TMB催化体系的颜色变化相关性分析，从而检测红酒中抗氧化剂的含量，整个检测过程不需要依赖分光光度计，只需一部常见的智能手机就能实现，同时操作简便、快速、灵敏度高、实用性强，对于红酒中抗氧化剂含量的检测具有十分重要的意义。

附图说明

图1为利用智能手机APP比色检测流程图。

图2为不同浓度没食子酸标准样品的溶液照片图。

图3为用智能手机分析不同浓度没食子酸标准样品溶液照片所得到的R、B、G及Gray值。

图4为红酒样品中抗氧化剂含量比色分析及加标回收实验样品溶液的照片图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。本发明所有原料及试剂均为市售产品。

仪器与试剂

氯化锰(MnCl₂·4H₂O，阿拉丁试剂公司)；30％双氧水(H₂O₂，阿拉丁试剂公司)；四甲基氢氧化铵(阿拉丁试剂公司)；3,3′,5,5′-四甲基联苯胺二盐酸盐(TMB，阿拉丁试剂公司)；没食子酸(C₇H₆O₅，西亚试剂公司)；醋酸钠(NaAc，西亚试剂公司)；冰醋酸(HAc，西亚试剂公司)；红酒为长城干红葡萄酒(经典·彩标)；所有试剂均为分析纯，所有水均为超纯水。

实施例1MnO₂纳米片的制备

室温条件下，15秒内将2mL 30％的双氧水、18mL超纯水和2.1748g四甲基氢氧化铵充分混合，再加入10mL H₂O和0.5937g MnCl₂.4H2O快速搅拌一夜，反应过程中会产生棕色沉淀，随后将棕色溶液离心，取沉淀用超纯水和甲醇各洗两次，以1000转/分钟的速度离心10分钟，然后将沉淀在50摄氏度下烘干，于干燥条件下保存备用。

实施例2标准曲线的绘制

(1)将实施例1制得的MnO₂纳米片配置成1mg/10mL的溶液，超声2小时，以2000转/分钟离心10分钟。使用前再以2000转/分钟离心20分钟，然后稀释成浓度为0.6mg/10mL的MnO₂纳米片溶液。

(2)称取40mg TMB溶入盛有40mL无水乙醇的离心管中配成1mg/1mL的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺二盐酸盐(TMB)溶液于冰箱中冷藏，使用时用水稀释为0.4mM。

(3)用醋酸钠与冰醋酸配制成0.01M(pH＝5)的醋酸钠-醋酸缓冲液。

(4)称取没食子酸配成浓度为0μM、0.1μM、0.2μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、1μM、2μM、3μM、4μM、6μM、8μM、10μM、12μM、15μM的溶液备用。

(5)分别取800μ0.6mg/10mL MnO₂纳米片溶液于4mL的离心管中，加入800μL不同浓度没食子酸充分混匀，15分钟后加入800μL水、800μL醋酸钠-醋酸缓冲液(pH＝5)和800μL0.4mM 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺二盐酸盐(TMB)，室温条件下反应，待反应10分钟后取样品进行拍照记录。打开手机(iphone 7)App(Color Piker-Play)后将准心对准样品，在每个样品中间部位取点，记录R、B、G以及灰度值。手机APP比色分析的流程如图1，其中a为本发明所用app(Color Picker-Play)，打开后其界面如b所示，添加样品图片后会出现c的界面，将准心放到不同的点上会得到相应的R、B、G及Gray值，打开d界面能得到样品图片详细的R、B、G及Gray值。为减小实验误差，每张样品图片取R、B、G及Gray值时，平行取9次再求平均值，取点位置如e所示。图2为不同浓度没食子酸标准样品的溶液照片图，对应的没食子酸浓度从左向右依次为0、0.6μM、1μM、2μM、3μM、4μM、6μM、8μM、10μM、12μM、15μM，从图2中明显看出随着没食子酸浓度的增加样品颜色由深到浅。图3为用智能手机分析不同浓度没食子酸标准样品溶液照片所得到的相应R、B、G及Gray值，从图3明显看出，样品R、G、B与Gray值随着没食子酸浓度的增加而增加，其中R值变化的趋势最明显。

(6)选取线性较好的浓度区间，以没食子酸浓度为横坐标，R、G、B与Gray值为纵坐标，拟合线性曲线如表1。

表1以R、B、G及Gray值拟合的线性方程以及相关系数

从表1中明显看出，根据四种不同方法拟合出的线性方程都有较好的相关系数，其中R值法的线性方程有较大的斜率，相比其它三种检测方法更灵敏。

实施例3红酒中抗氧化剂含量的检测

取0.6mg/10mL MnO₂溶液800μL于4mL的离心管中，加入800μL红酒稀释液(由红酒原液直接稀释100倍)，充分混匀5分钟后依次加入800μL蒸馏水、800μL醋酸钠-醋酸缓冲液(pH＝5)和800μL0.4mM TMB溶液，待反应15分钟后用智能手机捕获样品图片，再用APPColor Piker-Play分析图片中样品的R值。按照下式计算红酒中抗氧化剂含量：

y＝10.5967x+3.6723，r＝0.9847。

式中，x为红酒中抗氧化剂浓度，单位为μmol/L；y为智能手机拍照功能APP得到的图片R值；r为所建立标准曲线的相关系数。测得红酒稀释液样品图片R值为102.667，通过上式计算红酒稀释液(稀释100倍)中抗氧化剂浓度为9.34μmol/L。

实施例4加标回收实验

为了验证本发明方法用于检测红酒中抗氧化剂含量的可靠性，参照实施例3，发明人进行了实际样品加标回收实验。手机捕获的样品图片如图4，从左往右依次为空白样品、红酒稀释液样品、红酒稀释液+1μM GA、红酒稀释液+2μM GA、红酒稀释液+4μM GA。按图1取点方法，根据表1中拟合曲线计算出样品中没食子酸浓度及回收率，如表2。

表2红酒中抗氧化剂含量测定及加标回收实验结果

从表2中可看出，本发明R值法对红酒样品抗氧化剂含量检测的加标回收率实验结果令人满意，其回收率范围为91％-96％。

Claims (6)

1.一种基于智能手机拍照功能快速检测红酒中抗氧化剂的方法，其特征在于：红酒中抗氧化剂可以将MnO₂纳米片部分或全部还原成二价的锰离子，使其类氧化酶活性受到抑制，即降低TMB转变为oxTMB的转化率，使得溶液由蓝色变浅，同时做空白试验；根据智能手机拍照功能捕获图片，由手机APP分析得到的R、B、G或Gray值与抗氧化剂(以没食子酸作为抗氧化剂标准物质)浓度之间的线性关系来计算红酒中抗氧化剂的含量。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述智能手机分析图片的APP为ColorPiker-Play。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：根据智能手机APP Color Piker-Play分析捕获图片的R值与没食子酸浓度存在的线性关系计算红酒中抗氧化剂的含量。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：将MnO₂纳米片溶液与红酒或红酒稀释液混合均匀，加入醋酸-醋酸钠缓冲液和TMB进行化学反应，反应结束后用智能手机拍照功能拍摄样品图片，再用APP Color Piker-Play分析图片中样品的R值，同时做空白试验；根据R值与没食子酸浓度建立标准曲线，即可算出红酒中抗氧化剂的含量。

5.一种基于智能手机拍照功能快速检测红酒中抗氧化剂的方法，其特征在于，采用如下步骤：取0.6mg/10mL MnO₂纳米片溶液与红酒原液直接稀释100倍的红酒稀释液充分混匀5分钟后依次加入蒸馏水、pH＝5的醋酸钠-醋酸缓冲液和0.4mM TMB，待反应15分钟后用智能手机拍照功能拍摄样品图片，再用APP Color Piker-Play分析图片中样品的R值，同时做空白试验；所述红酒中抗氧化剂含量按下式计算：

y＝10.5967x+3.6723，r＝0.9847；

式中，x为红酒中抗氧化剂浓度，单位为μmol/L；y为智能手机APP Color Piker-Play分析得到的R值；r为所建立标准曲线的相关系数。

6.一种基于智能手机拍照功能快速检测红酒中抗氧化剂的方法，其特征在于，采用如下步骤：

(1)标准曲线的绘制

取0.6mg/10mL MnO₂溶液800μL于4mL的离心管中加入800μL浓度分别为0.6μM、1μM、2μM、3μM、4μM、6μM、8μM、10μM、12μM、15μM的没食子酸，充分混匀5分钟后依次加入800μL蒸馏水、800μL pH＝5的醋酸钠-醋酸缓冲液和800μL 0.4mM的TMB溶液，待反应15分钟后用智能手机捕获样品图片，再用APP Color Piker-Play分析图片中各标准样品对应的R值，根据R值与没食子酸浓度建立标准曲线；

(2)样品检测

取0.6mg/10mL MnO₂纳米片溶液800μL于4mL的离心管中加入800μL由红酒原液直接稀释100倍的红酒稀释液，充分混匀5分钟后依次加入800μL蒸馏水、800μL pH＝5的醋酸钠-醋酸缓冲液和800μL 0.4mM的TMB溶液，待反应15分钟后用智能手机拍照功能拍摄样品图片，再用APP Color Piker-Play分析图片中样品的R值，同时做空白试验；

(3)结果计算

红酒中抗氧化剂含量按下式计算：

y＝10.5967x+3.6723，r＝0.9847；

式中，x为红酒中抗氧化剂浓度，单位为μmol/L；y为智能手机APP Color Piker-Play分析得到的R值；r为所建立标准曲线的相关系数。