CN105388150B - 一种基于色差对比的土霉素检测试纸、使用方法及制备方法 - Google Patents

一种基于色差对比的土霉素检测试纸、使用方法及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于色差对比的土霉素检测试纸、使用方法及制备方法，属于环境分析领域。该土霉素检测试纸包括结合区、显色区和吸水区，依次排布，以PVC胶板为底衬；试纸一端的结合区粘贴含有土霉素适配子的玻璃纤维素膜，试纸中间的显色区粘贴含有石墨烯/纳米铂的硝酸纤维素膜，试纸另一端的吸水区粘贴吸水纸，中间显色区的硝酸纤维素膜分别与结合区的玻璃纤维素膜和吸水区的吸水纸间有重叠；使用过程中，同时对标准水样与待测水样进行测定，通过对比试纸显色区颜色的差异，判断待测水样中土霉素含量是否超标。本发明具有制备简单，使用方便，性能稳定等优点，适用于水环境中土霉素的快速检测。

Description

一种基于色差对比的土霉素检测试纸、使用方法及制备方法
技术领域
本发明属于环境分析领域，涉及一种基于色差对比的土霉素检测试纸的制备与应用。
技术背景
土霉素(Oxytetracycline)是一种广谱抗菌剂，是目前使用最广泛的四环素类抗生素，因具有广谱抗菌、价格低廉的特点，常被用做畜禽药物以及饲料添加剂。然而，土霉素不能被人体或其他动物的代谢作用完全分解，会通过迁移转化进入自然环境中，影响生态环境稳定，导致抗药细菌的出现，对人类的健康和环境造成威胁。
目前对于抗生素检测的传统方法包括高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫法(ELISA)、毛细管电泳(CE)、表面增强拉曼光谱法(SERS)等。但上述方法存在设备昂贵，操作复杂耗时，需要专业人员等不足之处，故多用于实验室检测，难以实现商品化。
目前在市场上已经出现了一些基于酶联免疫法原理的抗生素快速检测产品，如ELISA试剂盒和胶体金快速检测卡，其检测原理都是通过标记抗体与抗原免疫反应来检测目标物。该方法的问题在于作为识别元件的抗体需要通过生物方法培养获得，制备过程复杂且在自然环境中容易受到影响，保存难度较大，在与酶或胶体金结合的过程中易失活，这会导致产品灵敏度下降，甚至出现假阳性现象，影响检测结果。
核酸适配子是一段人工合成的核酸序列，可以特异性结合靶标物质。相比于抗体，核酸序列可以通过体外合成获得，易于保存且稳定性更好，故利用适配子作为识别原件对土霉素进行检测具有实际应用方面上的优势，但目前市场上并未出现基于核酸适配子检测土霉素的试纸类产品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以核酸适配子为识别元件，基于色差对比的土霉素快速检测试纸。
本发明的技术方案：
一种基于色差对比的土霉素检测试纸，包括结合区、显色区和吸水区，依次排布，结合区、显色区和吸水区的面积比为2:1:4～3:1:9，以聚氯乙烯(PVC)胶板为底衬；试纸一端的结合区粘贴含有浓度为1～100μM的土霉素适配子的玻璃纤维素膜，试纸中间的显色区粘贴含有石墨烯/纳米铂的硝酸纤维素膜，试纸另一端的吸水区粘贴吸水纸，中间显色区的硝酸纤维素膜分别与其两端的结合区的玻璃纤维素膜和吸水区的吸水纸间有重叠；
与该土霉素检测试纸匹配的显色液为浓度0.2～20mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)溶液与过氧化氢溶液的混合液，且混合液pH值为2～6；
土霉素适配子序列：
5’-CGTACGGAATTCGCTAGCCGAGTTGAGCCGGGCGCGGTACGGGTACTGGTATGTGTGGGGATCCGAGCTCCACGTG-3’。
一种基于色差对比的土霉素检测试纸的使用方法为：取两条相同规格的试纸，将试纸结合区分别插入标准水样(已知浓度的土霉素水样)与待测水样(未知的浓度土霉素水样)中，待水样完全浸润显色区，上升至吸水区时，取出试纸静置1～2min；再将试纸插入显色液中，静置2～3min，对比两条试纸颜色变化情况；土霉素检测试纸的判别标准：若两条试纸显色区颜色相同，则判定待测水样中土霉素含量未超标；若两条试纸显色区颜色不同，且待测水样组显色区颜色较标准水样组颜色深，则判定待测水样中土霉素含量超标。
一种基于色差对比的土霉素检测试纸的制备方法，步骤如下：
(1)制备氧化石墨烯；
(2)制备石墨烯/纳米铂溶液：向浓度为0.5mg/mL的石墨烯氧化物水溶液加入浓度为10mM的氯铂酸和浓度为20mM的谷氨酸，石墨烯氧化物水溶液、氯铂酸和谷氨酸的体积比为20:6:1～30:15:1；将上述混合液稀释6～10倍，调节pH值至10～12；将混合液超声2～5h后，在180℃下水热反应8～16h；
(3)将硝酸纤维素膜浸入步骤(2)制备得到的石墨烯/纳米铂溶液中，浸渍石墨烯/纳米铂溶液的硝酸纤维素膜作为显色区；
(4)在玻璃纤维素膜中央滴加浓度为1～100μM的土霉素适配子溶液作为结合区；
(5)以PVC胶板为底衬，将结合区、显色区和吸水区按顺序粘贴在底衬上，中间显色区的硝酸纤维素膜分别与其两端的结合区的玻璃纤维素膜和吸水区的吸水纸间有重叠；
(6)将浓度为0.2～20mM的TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)溶液与过氧化氢溶液混合，作为与土霉素检测试纸配套的显色液，该显色液pH值为2～6。
石墨烯/纳米铂具有类过氧化氢酶的特性，可以有效催化过氧化氢酶底物TMB与过氧化氢反应，产生明显的颜色变化(由无色变为浅蓝再到深蓝，一段时间后继续反应至绿色，最终变为黄色)。土霉素适配子(单链DNA)可以通过π-π作用力吸附在石墨烯氧化物表面，与石墨烯/纳米铂形成复合结构，阻碍过氧化氢酶底物分子在石墨烯/纳米铂复合催化剂界面的扩散和结合，抑制催化反应的有效进行。当体系中存在靶物质(土霉素)时，适配子会首先与靶物质结合形成复合物，减弱与复合催化剂之间结合的作用力，从而减弱对于复合催化剂催化能力的抑制作用。
通过以上理论，可以将靶物质(土霉素)的量转化为复合催化剂石墨烯/纳米铂的催化能力，并通过显色剂(TMB/H2O2)的颜色体现出来。在本发明中，可通过标准水样与待测水样对于试纸显色区显色情况的不同进行判别，从而判断待测水样中土霉素含量是否超标。
本发明的有益效果：
(1)操作简单，效果直观，检测速度快，不需要大型仪器设备，3～5min即可完成对水样中土霉素的检测，可实现现场实时检测。
(2)选择性高，抗干扰能力强。本发明试纸采用土霉素适配子作为识别原件，避免了胶体金试纸所面临的抗体易失活问题。采用色差对比模式进行判别，动态比较，避免了因试纸上药品性能降低而导致的假阳性现象。
(3)灵敏度高，0.5mg/L～5mg/L的土霉素溶液均具有检出效果。
附图说明
图1为本发明检测试纸的主视结构示意图。
图2为本发明检测试纸的侧视结构示意图。
具体实施方式
本发明的土霉素检测试纸的一个实施例：
(1)氧化石墨烯的制备：
石墨烯氧化物采用改进的Hummers化学法制备。具体步骤如下：称取1.0g石墨粉缓慢加入到25mL浓硫酸中，充分搅拌后，在0℃冰水浴中缓慢加入3g KMnO4，缓慢加入同时充分搅拌，然后连续超声12h后，得到深褐色溶液，然后缓慢加入46mL去离子水，加热煮沸15min后，再依次加入140mL高纯水和10mL双氧水终止反应，得到亮黄色的石墨烯氧化物水溶液。3000r/min离心分离后，用5％的稀盐酸10000r/min离心洗涤2次去除杂质，然后用高纯水10000r/min离心洗涤5次去除稀盐酸。洗涤后取出纯化的石墨氧化物，最后40℃真空干燥得到固体石墨烯氧化物。
(2)石墨烯/纳米铂的制备：
取2.5mL配置好的0.5mg/mL的石墨烯氧化物水溶液于烧杯中，加入1mL配制好的10mM氯铂酸，再加入100μL 20mM的谷氨酸，用高纯水稀释到25mL同时用NaOH溶液调节至pH＝11。将混合液置于超声清洗器中超声3h后取出。将该溶液加入聚四氟乙烯水热反应釜中，放入电热恒温鼓风干燥箱中在180℃下水热反应12h。
(3)试纸显色区的制备
将硝酸纤维素膜裁剪成7mm×7mm尺寸大小，浸入稀释20倍后的步骤(2)中制备的石墨烯/纳米铂溶液中，完全浸透后抽真空干燥待用。
(4)试纸结合区的制备
将玻璃纤维素膜裁剪成15mm×7mm尺寸大小，在每块玻璃纤维素膜的中央滴加5μM浓度的土霉素适配子溶液10μL，真空干燥待用。
(5)试纸吸水区的制备
将吸水纸裁剪成40mm×7mm尺寸大小待用。
(6)试纸的组装
将带有粘性底衬的PVC胶板裁剪成600mm×7mm尺寸大小，在胶板上的一端粘贴步骤(4)中制备的结合区，在胶板的中间粘贴步骤(3)中制备的显色区，在胶板的另一端粘贴步骤(5)中制备的吸水区。其中结合区与吸水区分别与显色区交叠1mm×7mm面积的区域。
(7)显色液的制备
取150μL浓度为2.9mM的TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)溶液(pH＝4)与0.5μL30％的过氧化氢混合，加入到2mL的离心管中，密封待用。
(8)检测过程
取两条相同规格的试纸1和2，将试纸结合区部分分别插入水样1(超纯水)与水样2(5mg/L土霉素溶液)中，待水样完全浸润显色区，上升至吸水区时，取出试纸静置2min。然后将试纸插入显色液之中，静置3min，对比两条试纸颜色变化情况。
(9)检测结果
试纸1与试纸2呈现明显可见的颜色差异：试纸2呈现深蓝色，试纸1呈现浅蓝色。故判定水样2中土霉素含量超标。
本发明的土霉素检测试纸的另一个实施例：
(1)氧化石墨烯的制备：
石墨烯氧化物采用改进的Hummers化学法制备。具体步骤如下：称取1.0g石墨粉缓慢加入到25mL浓硫酸中，充分搅拌后，在0℃冰水浴中缓慢加入3g KMnO4，缓慢加入同时充分搅拌，然后连续超声12h后，得到深褐色溶液，然后缓慢加入46mL去离子水，加热煮沸15min后，再依次加入140mL高纯水和10mL双氧水终止反应，得到亮黄色的石墨烯氧化物水溶液。3000r/min离心分离后，用5％的稀盐酸10000r/min离心洗涤2次去除杂质，然后用高纯水10000r/min离心洗涤5次去除稀盐酸。洗涤后取出纯化的石墨氧化物，最后40℃真空干燥得到固体石墨烯氧化物。
(2)石墨烯/纳米铂的制备：
取2.5mL配置好的0.5mg/mL的石墨烯氧化物水溶液于烧杯中，加入1mL配制好的10mM氯铂酸，再加入100μL 20mM的谷氨酸，用高纯水稀释到25mL同时用NaOH溶液调节至pH＝11。将混合液置于超声清洗器中超声3h后取出。将该溶液加入聚四氟乙烯水热反应釜中，放入电热恒温鼓风干燥箱中在180℃下水热反应12h。
(3)试纸显色区的制备
将硝酸纤维素膜裁剪成7mm×7mm尺寸大小，浸入稀释10倍后的步骤(2)中制备的石墨烯/纳米铂溶液中，完全浸透后抽真空干燥待用。
(4)试纸结合区的制备
将玻璃纤维素膜裁剪成15mm×7mm尺寸大小，在每块玻璃纤维素膜的中央滴加10μM浓度的土霉素适配子溶液10μL，真空干燥待用。
(5)试纸吸水区的制备
将吸水纸裁剪成40mm×7mm尺寸大小待用。
(6)试纸的组装
将带有粘性底衬的PVC胶板裁剪成600mm×7mm尺寸大小，在胶板上的一端粘贴步骤(4)中制备的结合区，在胶板的中间粘贴步骤(3)中制备的显色区，在胶板的另一端粘贴步骤(5)中制备的吸水区。其中结合区与吸水区分别与显色区交叠1mm×7mm面积的区域。
(7)显色液的制备
取150μL浓度为5.8mM的TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)溶液(pH＝4)与1μL 30％的过氧化氢混合，加入到2mL的离心管中，密封待用。
(8)检测过程
取两条相同规格的试纸1和2，将试纸结合区部分分别插入水样1(超纯水)与水样2(0.5mg/L土霉素溶液)中，待水样完全浸润显色区，上升至吸水区时，取出试纸静置2min。然后将试纸插入显色液之中，静置3min，对比两条试纸颜色变化情况。
(9)检测结果
试纸1与试纸2呈现明显可见的颜色差异：试纸2呈现深蓝色，试纸1呈现浅蓝色。故判定水样2中土霉素含量超标。
本发明的土霉素检测试纸的另一个实施例：
(1)氧化石墨烯的制备：
石墨烯氧化物采用改进的Hummers化学法制备。具体步骤如下：称取1.0g石墨粉缓慢加入到25mL浓硫酸中，充分搅拌后，在0℃冰水浴中缓慢加入3g KMnO4，缓慢加入同时充分搅拌，然后连续超声12h后，得到深褐色溶液，然后缓慢加入46mL去离子水，加热煮沸15min后，再依次加入140mL高纯水和10mL双氧水终止反应，得到亮黄色的石墨烯氧化物水溶液。3000r/min离心分离后，用5％的稀盐酸10000r/min离心洗涤2次去除杂质，然后用高纯水10000r/min离心洗涤5次去除稀盐酸。洗涤后取出纯化的石墨氧化物，最后40℃真空干燥得到固体石墨烯氧化物。
(2)石墨烯/纳米铂的制备：
取2.5mL配置好的0.5mg/mL的石墨烯氧化物水溶液于烧杯中，加入1mL配制好的10mM氯铂酸，再加入100μL 20mM的谷氨酸，用高纯水稀释到25mL同时用NaOH溶液调节至pH＝11。将混合液置于超声清洗器中超声3h后取出。将该溶液加入聚四氟乙烯水热反应釜中，放入电热恒温鼓风干燥箱中在180℃下水热反应12h。
(3)试纸显色区的制备
将硝酸纤维素膜裁剪成7mm×7mm尺寸大小，浸入稀释5倍后的步骤(2)中制备的石墨烯/纳米铂溶液中，完全浸透后抽真空干燥待用。
(4)试纸结合区的制备
将玻璃纤维素膜裁剪成15mm×7mm尺寸大小，在每块玻璃纤维素膜的中央滴加20μM浓度的土霉素适配子溶液10μL，真空干燥待用。
(5)试纸吸水区的制备
将吸水纸裁剪成40mm×7mm尺寸大小待用。
(6)试纸的组装
将带有粘性底衬的PVC胶板裁剪成600mm×7mm尺寸大小，在胶板上的一端粘贴步骤(4)中制备的结合区，在胶板的中间粘贴步骤(3)中制备的显色区，在胶板的另一端粘贴步骤(5)中制备的吸水区。其中结合区与吸水区分别与显色区交叠1mm×7mm面积的区域。
(7)显色液的制备
取150μL浓度为11.6mM的TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)溶液(pH＝4)与2μL 30％的过氧化氢混合，加入到2mL的离心管中，密封待用。
(8)检测过程
取两条相同规格的试纸1和2，将试纸结合区部分分别插入水样1(超纯水)与水样2(5mg/L土霉素溶液)中，待水样完全浸润显色区，上升至吸水区时，取出试纸静置2min。然后将试纸插入显色液之中，静置3min，对比两条试纸颜色变化情况。
(9)检测结果
试纸1与试纸2呈现明显可见的颜色差异：试纸2呈现深蓝色，试纸1呈现浅蓝色。故判定水样2中土霉素含量超标。

Claims (3)

1.一种基于色差对比的土霉素检测试纸，其特征在于，所述的土霉素检测试纸包括结合区、显色区和吸水区，依次排布，结合区、显色区和吸水区的面积比为2:1:4～3:1:9，以聚氯乙烯胶板为底衬；试纸一端的结合区粘贴含有浓度为1～100μM的土霉素适配子的玻璃纤维素膜，试纸中间的显色区粘贴含有石墨烯/纳米铂的硝酸纤维素膜，试纸另一端的吸水区粘贴吸水纸，中间显色区的硝酸纤维素膜分别与其两端的结合区的玻璃纤维素膜和吸水区的吸水纸间有重叠；
与该土霉素检测试纸匹配的显色液为浓度0.2～20mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液与过氧化氢溶液的混合液，且混合液pH值为2～6；
所述的土霉素适配子序列：
5’-CGTACGGAATTCGCTAGCCGAGTTGAGCCGGGCGCGGTACGGGTACTGGTATGTGTGGGGATCCGAGCTCCACGTG-3’。
2.权利要求1所述的土霉素检测试纸的使用方法，其特征在于，将两条相同规格的土霉素检测试纸的结合区分别插入已知浓度的土霉素的标准水样与未知的浓度土霉素的待测水样中，待水样完全浸润显色区，上升至吸水区时，取出试纸静置1～2min；再将试纸结合区插入显色液中，静置2～3min，对比两条土霉素检测试纸颜色变化情况；土霉素检测试纸的判别标准：若两条试纸显色区颜色相同，则判定待测水样中土霉素含量未超标；若两条试纸显色区颜色不同，且待测水样显色区颜色较标准水样颜色深，则判定待测水样中土霉素含量超标。
3.权利要求1所述的土霉素检测试纸的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)制备氧化石墨烯水溶液；
(2)制备石墨烯/纳米铂溶液：向浓度为0.5mg/mL的石墨烯氧化物水溶液中加入浓度为10mM的氯铂酸和浓度为20mM的谷氨酸，石墨烯氧化物水溶液、氯铂酸和谷氨酸的体积比为20:6:1～30:15:1；将上述混合液稀释6～10倍，调节pH值至10～12；将混合液超声2～5h后，在180℃下水热反应8～16h；
(3)将硝酸纤维素膜浸入步骤(2)制备得到的石墨烯/纳米铂溶液中，浸渍石墨烯/纳米铂溶液的硝酸纤维素膜作为显色区；
(4)在玻璃纤维素膜中央滴加浓度为1～100μM的土霉素适配子溶液作为结合区；
(5)以PVC胶板为底衬，将结合区、显色区和吸水区按顺序粘贴在底衬上，中间显色区的硝酸纤维素膜分别与其两端的结合区的玻璃纤维素膜和吸水区的吸水纸间有重叠；
(6)将浓度为0.2～20mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液与过氧化氢溶液混合，作为与土霉素检测试纸配套的显色液，该显色液pH值为2～6。
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