CN109254041B - 一种辣椒中辣椒素的电化学检测方法 - Google Patents

一种辣椒中辣椒素的电化学检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种简便快速的辣椒素电化学检测方法。本发明结合吸附溶出伏安法可大幅提高检测灵敏度和示差脉冲伏安法可有效降低背景电流的优点，以未修饰丝网印刷碳电极为电极材料，采用示差脉冲‑吸附溶出伏安法，根据电化学响应信号与待测物浓度之间的线性关系，实现对辣椒素的简便、快速、准确的定量检测。该方法不依赖大型仪器设备，所用的未修饰丝网印刷碳电极制备简单、成本低廉，所述检测方法测定辣椒素灵敏度高、简便快速，可用于辣椒样品中辣椒素的测定，有望在辣椒素的检测分析及药用价值研究方面推广使用。

Description

一种辣椒中辣椒素的电化学检测方法
技术领域
本发明属于电化学检测领域，主要涉及一种简便快速的辣椒中辣椒素的电化学检测方法。
背景技术
辣椒素(又名辣椒碱)是从辣椒属植物中得到的活性成分，是一种亲脂、无色无味的生物碱。辣椒中的辣椒素主要有辣椒素、二氢辣椒素、降二氢辣椒素、高辣椒素、高二氢辣椒素等。其中，辣椒素和二氢辣椒素约占辣椒素总量的90％，也提供了约90％的辣感和热感。辣椒素来源于纯天然植物辣椒，不仅作为一种辣味剂被广泛地应用于食品工业，同时也因其具有镇痛、消炎、止痒、抗氧化、抗菌等多种药理生理学活性而被应用于医药行业。此外，辣椒素还被广泛应用于食品保健、军事、生物农药、化工涂料等领域。因辣椒素具有极高的食用药用价值和经济价值，其应用开发已成为国内外的研究热点。随着人类对辣椒素以及辣椒制品的需求量日益增加，对辣味食品辣度评定及辣椒素含量检测已经成为食品行业和制药工业等领域的重要工作。因此，建立一种简便快捷的检测辣椒素的方法，对于辣椒品种的选育、辣椒制品的品质和食用药用价值的研究具有重要意义。
目前，检测辣椒素的方法主要有紫外分光光度法、高效液相色谱-紫外检测法、高效液相色谱-荧光检测法、气相色谱-质谱联用法和液相色谱-质谱联用法。紫外分光光度法操作简单，耗时较短，但抗干扰能力较差。高效液相色谱-紫外检测法和荧光检测法具有良好的分离度，重复性好等优点，但仪器成本较高，体积大，不易实现微型化的现场检测。气相色谱-质谱和液相色谱-质谱联用法检测灵敏度高，但仪器昂贵，且对操作人员技术要求较高，维护保养麻烦，难以普及使用。以上检测方法受灵敏度、成本以及专业性操作等条件限制，难以在辣椒素的实际检测分析中广泛应用。因此，建立一种低成本、简便快捷的辣椒素检测方法是十分必要的。
电化学分析方法是仪器分析方法的重要组成部分之一。电化学分析方法是根据溶液中物质的电化学性质及变化规律，以电位、电导、电流和电量等电学量与被测物质量之间的计量关系为基础，对待测物进行定性和定量的仪器分析方法。应用电化学分析方法测定辣椒素有如下优点：设备简单、可移动性强，操作简便、检测快速，试剂和样品用量少，灵敏度高和选择性好等。目前，国内还没有关于采用未修饰丝网印刷碳电极(screen-printedcarbon electrode,SPCE)为电极材料和示差脉冲-吸附溶出伏安法(differential pulse-adsorptive stripping voltammetry,DP-AdSV)为检测方法定量辣椒素类物质的电化学方法的相关研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简便快速的辣椒素的电化学检测方法，并能用于辣椒样品中的辣椒素检测，解决了现有技术中存在的灵敏度低、检测成本高、检测时间长、操作步骤复杂等问题。
本发明所述的电化学方法检测原理为：因辣椒素苯环上的2-甲氧基和酚羟基可在电极表面被氧化为邻苯醌类物质，利用DPV法记录电化学反应过程中的i-V曲线，其氧化峰电流与辣椒素浓度在一定范围内呈线性关系。据此，可实现辣椒素的定量分析。
本发明中，所述SPCE包括一印制电极的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)基片、PET基片上印制的导线外绝缘层和基片上一端的接口。在基片上印制一个圆形工作区域，区域内包括碳工作电极、Ag/AgCl参比电极和碳糊对电极，各电极通过导线与接口相连，并在表面覆盖一层绝缘膜。制备的SPCE用3.0mol/L NaOH溶液处理1小时后，用超纯水反复冲洗，室温下晾干备用。
本发明的技术方案是：
一种简便快速的辣椒中辣椒素的电化学检测方法，具体操作步骤如下：
1)取新鲜辣椒研磨均质，准确称取0.2g加至12mL无水乙醇中，搅拌混匀。
2)将装有步骤1)处理的50mL混合物的容量瓶置于超声清洗仪中，超声处理20分钟后使用磁力搅拌器搅拌2小时，使辣椒与无水乙醇充分混匀。
3)将步骤2)得到的溶液在10000rpm、4℃离心10分钟，取上清液。用0.22μm滤膜过滤上清液，滤液涡旋混匀后取200μL至Ep管中，置于真空离心浓缩仪中干燥处理。
4)将步骤3)干燥后的提取物用4mL含有HCl和支持电解质K2SO4的溶液进行复溶，涡旋混匀，得到工作液。
5)所述SPCE与电化学工作站连接，将步骤4)得到的工作液置于10mL烧杯中。将SPCE的电极区域浸没于溶液中，施加-0.1V的富集电位，搅拌富集60s。停止搅拌并暂停13s后，使用DPV技术进行辣椒素的定量检测。DPV的参数设置为：低电位0.2V，高电位0.7V，振幅280mV，脉冲宽度0.03s，脉冲周期0.2s。
更优的，所述HCl溶液浓度为100.0mmol/L，pH值为1.0。所述支持电解质K2SO4溶液浓度为250.0mmol/L。
本发明所述辣椒素的电化学检测方法的有益效果如下：
1)本发明所述的电化学检测方法，通过使用SPCE配合电化学检测方法对辣椒素进行定量测定，操作简单，价格低廉。
2)本发明所述的电化学检测方法中所用的丝网印刷电极，制作成本低廉，制作过程简单、快速，可实现批量生产。SPCE为一次性使用电极，既避免了传统柱电极打磨抛光的时间精力损耗，又避免了柱电极重复使用过程中可能造成的实验交叉污染。
3)本发明所述电化学检测方法结合AdSV可大幅提高检测灵敏度和DPV可有效降低背景电流的优点，无需对SPCE电极进行修饰便可对辣椒素进行简便、准确的定量。
4)本发明所述的电化学检测方法，响应快速、操作简便，具有灵敏度高、精密度和准确度好的优点，可用于对辣椒素进行快速准确定量。
5)本发明所述的电化学检测方法有望发展为普及使用的辣椒素测量装置,对辣椒及其制品中辣椒素的检测分析具有重要意义。
附图说明
图1为本发明丝网印刷碳电极的结构图及所述方法的检测原理图。
图中1-工作电极，2-辅助电极，3-参比电极，4-绝缘膜，5-PET基板；虚线框中为所述方法的检测原理。
图2为本发明丝网印刷碳电极对辣椒素的电化学响应以及富集处理前后电化学响应信号放大作用的对比。
图中曲线a为稀释20倍的青椒样品超声提取物溶液的DPV曲线；曲线b为未富集处理的含10.0μmol/L的辣椒素溶液的DPV曲线；曲线c为在-0.1V的富集电位下搅拌富集60s后的含10.0μmol/L的辣椒素溶液的DPV曲线。
图3为本发明缓冲液pH值影响氧化峰电流的曲线图。
图中■代表辣椒素的氧化峰电流。
图4为本发明支持电解质种类对氧化峰电流的影响曲线图。
图中曲线A为在100.0mmol/L、pH 1.0的HCl溶液中测得的辣椒素DPV曲线；曲线B为在添加250.0mmol/L KCl的100.0mmol/L、pH 1.0的HCl溶液中测得的辣椒素DPV曲线；曲线C为在添加250.0mmol/L K2SO4的100.0mmol/L、pH 1.0的HCl溶液中测得的辣椒素DPV曲线。
图5为本发明富集电位对氧化峰电流的影响曲线图。
图中■代表辣椒素的氧化峰电流。
图6为本发明富集时间对氧化峰电流的影响曲线图。
图中■代表辣椒素的氧化峰电流。
图7为本发明中氧化峰电流对辣椒素浓度的标准曲线图。
图中■代表辣椒素的氧化峰电流，c代表辣椒素浓度。
具体实施方式
本发明电化学工作站仅以CHI852C电化学工作站为例，其购自于上海辰华仪器有限公司。辣椒素和二氢辣椒素标准品购自于上海标准生物科技有限公司。
实施例1：本发明所述丝网印刷碳电极的制备
本发明所述丝网印刷碳电极是在PET基板上依次印刷碳浆、Ag/AgCl浆和绝缘浆。具体包括如下步骤：
1)清洗PET基板，晾干后在PET基板上印刷碳浆，制作碳工作电极和碳糊辅助电极，常温干燥；
2)在上述PET基板上印刷含有氯化银的银浆，制成Ag/AgCl参比电极，常温干燥；
3)避开圆形工作区域，在上述PET基板上印刷绝缘浆，将导线覆盖住；
4)上述工作电极、辅助电极和参比电极形成一圆形工作区域，各电极通过绝缘膜下的导线与接口相连，然后于30～40℃烘干，保存备用。
5)电极使用前需用3.0mol/L NaOH溶液预处理1小时，用超纯水反复冲洗干净，室温下晾干备用。
实施例2：辣椒中辣椒素的电化学检测方法
1)配制溶液：用超纯水配制100.0mmol/L、pH 1.0的HCl溶液置于容器中备用。
2)样品预处理：取新鲜辣椒研磨均质，准确称取0.2g加至12mL无水乙醇中，搅拌混匀。
3)将装有步骤2)处理的50mL混合物的容量瓶置于超声清洗仪中，超声处理20分钟后使用磁力搅拌器搅拌2小时，使辣椒与无水乙醇充分混匀。
4)将步骤3)得到的溶液在10000rpm、4℃离心10分钟，留取上清液。用0.22μm滤膜过滤上清液，滤液涡旋混匀后取200μL至Ep管中，置于真空离心浓缩仪中干燥处理。
5)将步骤4)干燥的提取物用4mL含有HCl和支持电解质K2SO4的溶液进行复溶，涡旋混匀，得到工作液。
6)所述SPCE与电化学工作站连接，将步骤5)得到的工作液置于10mL烧杯中。将SPCE的电极区域浸没于溶液中，施加-0.1V的富集电位，搅拌富集60s。停止搅拌并暂停13s后，使用DPV技术(参数设置为：低电位0.2V，高电位0.7V，振幅280mV，脉冲宽度0.03s，脉冲周期0.2s)进行辣椒素的检测，其氧化峰电流与辣椒素的浓度在一定范围内呈良好的线性关系，从而可实现对辣椒样品中辣椒素的定量分析。
实施例3：
本实施例是对所述电化学方法检测原理的验证，结果见图2。图中曲线a为空白溶液的DPV曲线；曲线b为未富集处理的含10.0μmol/L的辣椒素溶液的DPV曲线；曲线c为在-0.1V的富集电位下搅拌富集60s后的含10.0μmol/L的辣椒素溶液的DPV曲线。由图2可见，曲线a中未观察到明显的电化学响应信号；曲线b中在0.39V处产生了一个氧化峰电流信号，表明所得的电化学信号为辣椒素被氧化产生。对比曲线b和c可知，富集处理后辣椒素的电化学响应信号显著提高，表明富集处理有效提高了检测灵敏度。
实施例4：
本实施例是考察缓冲液pH值对辣椒素的氧化峰电流(氧化峰电流用■表示)的影响，结果见图3。pH为1.0的缓冲液由100.0mmol/L HCl溶液制备；pH值为2.0至5.0的缓冲液由不同比例的100.0mmol/L磷酸二氢钠和磷酸氢二钠溶液制备。在pH 1.0～5.0的范围内，pH值为3.0与pH值为1.0的氧化峰电流较大，但pH值为3.0的测量误差较大。随着pH值进一步从3.0增加至5.0，氧化峰电流逐渐减小。缓冲液的pH值是辣椒素检测的关键影响因素。pH值为1.0测量误差小且氧化峰电流大，故缓冲液的pH值选为1.0。
实施例5：
本实施例是考察支持电解质种类对辣椒素的氧化峰电流的影响，结果见图4。图中曲线A为在100.0mmol/L、pH＝1.0的HCl溶液中含辣椒素的DPV曲线；曲线B为在添加250.0mmol/L KCl的100.0mmol/L、pH 1.0的HCl溶液中含辣椒素的DPV曲线；曲线C为在添加250.0mmol/L K2SO4的100.0mmol/L、pH 1.0HCl溶液中含辣椒素的DPV曲线。在HCl溶液中添加盐溶液作为支持电解质可以增强溶液的离子强度和提高电导率，因此探索了两种盐溶液(KCl和K2SO4)对辣椒素氧化峰电流强度的影响。对比曲线A、B、C可知，添加250.0mmol/LK2SO4的100.0mmol/L、pH 1.0的HCl溶液氧化峰电流最高。因此，选择250.0mmol/L K2SO4加至100.0mmol/L、pH 1.0的HCl溶液中作为支持电解质。
实施例6：
本实施例是考察富集电位对辣椒素的氧化峰电流(氧化峰电流用■表示)的影响，结果见图5。辣椒素检测混合液中HCl浓度为100.0mmol/L、pH值为1.0、体积为4mL，添加的支持电解质K2SO4溶液浓度为250.0mmol/L，辣椒素浓度为10.0μmol/L，基于以上条件探索了从-0.3V到0.1V之间不同的富集电位对氧化峰电流的影响。富集电位是影响辣椒素电化学响应信号的重要因素。结果显示，随着富集电位从-0.3V增加至-0.1V，氧化峰电流逐渐增加，并在-0.1V达到最大值。当电位进一步增加至0.1V时，氧化峰电流逐渐减小。因此，富集电位设定为-0.1V。
实施例7：
本实施例是考察富集时间对辣椒素的氧化峰电流(氧化峰电流用■表示)的影响，结果见图6。本实施例的检测条件在实施例6的基础上进行。结果显示，在0～120s的富集时间范围内，随着从0到60s的累积时间的增加，辣椒素的氧化峰电流显著增加，表明电极表面富集的辣椒素逐步增多。随着富集时间从60s增加到120s，氧化峰电流增加非常缓慢，这可能表明60s的富集时间已达到了电极有效检测面积所能负载的最大检测量。综合考虑灵敏度和分析时间两个方面，富集时间设定为60s。
实施例8：
本实施例是考察所述电化学检测方法用于定量辣椒素浓度与氧化峰电流(氧化峰电流用■表示)之间的相关性，结果见图7。青椒样品中辣椒素含量甚微，其超声提取物经20倍稀释后无法检测，可作为空白基质。在空白基质中加入不同浓度的辣椒素标准溶液以配制0.16～16.37μmol/L的系列工作液，在最佳实验条件下，采用DPV技术对辣椒素进行定量检测。辣椒素在0.16～16.37μmol/L范围内的浓度与电化学响应信号有较好的线性关系，辣椒素的标准曲线为I＝0.5737c+0.5375(R2＝0.9978)。该方法测定辣椒素在信噪比为3(S/N＝3)时其最低检测限为0.05μmol/L，表明该方法的灵敏度较高。
实施例9：
本实施例是考察本发明所述电化学方法用于测定辣椒素的精密度。在稀释20倍的青椒样品超声提取物中分别加入低浓度(0.20μmol/L)、中浓度(1.50μmol/L)和高浓度(15.00μmol/L)的辣椒素，日内重复测定5次，同一样品连续测定5天，分别计算不同浓度辣椒素日内和日间的变异系数，进行精密度考察，结果见表1。日内和日间变异系数分别小于5.0％和8.6％，表明本发明所述电化学检测方法具有良好的精密度。
表1.精密度(n＝5)
Figure BDA0001843102470000061
实施例10：
本实施例是考察本发明所述电化学方法用于测定辣椒素的回收率，在美人椒样品中加入低浓度(0.20μmol/L)、中浓度(1.50μmol/L)和高浓度(15.00μmol/L)的辣椒素标准溶液后，通过测量加入辣椒素标准溶液前后美人椒中辣椒素的浓度进行回收实验，相对回收率＝(加标样品辣椒素的浓度－未加标样品辣椒素浓度)/加入辣椒素标准品的浓度×100％，结果见表2。不同浓度辣椒素的回收率在95.5％～107.7％之间，变异系数最大为8.9％，表明本发明所述电化学检测方法具有较好的准确度。
表2.回收率(n＝5)
Figure BDA0001843102470000071
实施例11
本实施例是考察本发明所述电化学方法用于测定辣椒素的抗干扰能力。葡萄糖和抗坏血酸通常被认为是检测植物样品组分的内源性干扰物质。除这两项外，一些与植物生长相关的常见离子也被纳入干扰试验。干扰实验测定未加干扰物的样本辣椒素浓度(XC)和加入干扰物后的样品辣椒素浓度(XT)。干扰值(表示为XT－XC)在本发明方法的1.96S(即95％可信度)范围内为无显著干扰(用N表示)，如干扰值超过1.96S，则为有显著干扰(用I表示)。结果见表3。1000倍的Fe3+，Cu2+，K+，Na+，Ga2+，Cl-，SO4 2-和葡萄糖以及100倍的Mg2+不影响辣椒素测定的准确性，当加入抗坏血酸的浓度超过82.50μmol/L时，存在显著的干扰。通常情况下，实际样品中的抗坏血酸和相关离子的浓度均远低于上述干扰值，表明本发明所述的电化学检测方法具有较好的抗干扰能力。
表3.干扰实验(n＝5)
Figure BDA0001843102470000072

Claims (2)

1.一种辣椒中辣椒素的电化学检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)对丝网印刷碳电极进行预处理；
2)辣椒的前处理：取新鲜辣椒研磨均质，准确称取0.2g加至12mL无水乙醇中，搅拌混匀；将处理后的混合物转移至50mL容量瓶并置于超声清洗仪中，超声处理20分钟后使用磁力搅拌器搅拌2小时，使辣椒与无水乙醇充分混匀；将得到的溶液在10000rpm、4℃离心10分钟，取上清液；用0.22μm滤膜过滤上清液，滤液涡旋混匀后取200μL至Ep管中，置于真空离心浓缩仪中干燥处理；用4mL含有盐酸和支持电解质K2SO4的溶液进行复溶，涡旋混匀，得到工作液；
3)所述丝网印刷碳电极与电化学工作站连接，将得到的工作液置于10mL烧杯中，将丝网印刷碳电极的电极区域浸没于溶液中，设定富集电位和富集时间，并用磁力搅拌器搅拌，停止搅拌并暂停13s后，使用示差脉冲伏安法进行辣椒素的检测；
其中，步骤1) 中所述丝网印刷碳电极的预处理为用3.0mol/L NaOH溶液处理1小时后，用超纯水反复冲洗，室温下晾干备用；
步骤2) 中所述盐酸溶液浓度为100.0mmol/L，pH值为1.0；所述支持电解质K2SO4溶液浓度为250.0mmol/L；
步骤3) 中所述富集电位设定为-1.0V，富集时间设定为60s。
2.根据权利要求1所述的电化学检测方法，其特征在于，步骤3) 中所述示差脉冲伏安法参数设置为：低电位0.2V，高电位0.7V，振幅280mV，脉冲宽度0.03s，脉冲周期0.2s。
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