CN104833811A - 己二烯雌酚抗体在多种雌酚同时检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种在同时检测三种雌性激素类似化合物，即己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚的免疫电化学检测方法中己二烯雌酚抗体的应用。所述的检测方法为：首先制备纳米金沉积并采用石墨烯/雌酚/壳聚糖复合物修饰的电化学传感器，然后以K3[Fe(CN)6]为探针，基于己二烯雌酚抗体对三种雌酚的交叉免疫反应，同时实现对三种雌酚的检测。本发明提供的方法检测己烯雌酚的检测限为0.2ng/mL，线性范围为1～4000ng/mL；检测己二烯雌酚的检测限为0.05ng/mL，线性范围为10～4000ng/mL；检测己烷雌酚的检测限为0.5ng/mL，线性范围为100～4000ng/mL。

Description

己二烯雌酚抗体在多种雌酚同时检测中的应用
技术领域
本发明属于食品安全检测和分析化学技术领域，涉及一种能同时识别三种雌性激素类似化合物，即己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚的己二烯雌酚抗体在三种雌酚同时检测中的应用，具体的说是一种基于抗体交叉反应的免疫电化学检测方法，以及对食品中含有的上述三种雌性激素类似化合物的同时检测中的应用。
背景技术
己烯雌酚(diethylstilbestrol,DES)、己二烯雌酚(dienestrol,DE)和己烷雌酚(hexestrol,HEX)(结构式见图1)属于1,2-二苯乙烯类药物，它们是人工合成的雌激素类物质。二苯乙烯类激素具有促进动物生长、提高饲料转化率和减少脂肪合成等作用，20世纪60年代曾为各国官方批准使用的促生长剂，用于畜牧业生产。但是滥用1,2-二苯乙烯类药物会导致动物生理系统功能失调甚至不可逆的病变，并通过食物链最终危害人类健康，长期摄入会干扰人体正常的激素平衡，导致机体代谢紊乱、发育异常肿瘤、女性乳腺癌和子宫内膜异位、胎儿畸形等严重的问题，在我国和欧美等国家都禁止在动物养殖过程中使用。
目前用于DES、DE和HEX残留检测的方法主要有气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、高效液相色谱法、毛细管电泳法等。但是这些分析方法需要大型分析仪器，过程操作繁琐，不能实现现场检测，有必要研究建立更加高效、快速、灵敏的快速检测方法。免疫分析是有效快速的重要检测方法之一，但是目前雌酚的免疫分析大都是特异性分析检测，即每种检测方法只能检测一种特定化合物，不适合快速初筛，因此，同时检测多种雌酚的多残留免疫分析方法就成为亟待发展的关键技术，其中，能同时识别多种雌酚的抗体是关键环节。
发明内容
本发明提供了一种基于己二烯雌酚抗体能同时检测三种雌性激素类似化合物，即己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚的免疫电化学检测方法，具有很低的检出限(己烯雌酚的检测限为0.2ng/mL，己二烯雌酚的检测限为0.05ng/mL，己烷雌酚的检测限为0.5ng/mL)和较宽的线性范围(己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚分别为1～4000ng/mL、10～4000ng/mL和100～4000ng/mL)。
所述的能共同检测己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚的免疫电化学检测方法包括以下步骤：
1)纳米复合物修饰的免疫电化学传感器的制备：首先对玻碳电极进行打磨、抛光和超声 清洗；然后用电化学方法在玻碳电极表面沉积金纳米粒子；最后将雌酚—石墨烯—壳聚糖混合液滴涂于纳米金沉积的电极表面制得所述的免疫电化学传感器；
2)标准溶液的配制：配制一组包括空白标样在内的含有不同浓度游离雌酚的PH为7.4的磷酸缓冲溶液为标准溶液，其中含有相同浓度的己二烯雌酚抗体；
3)工作曲线的建立：将所述免疫传感器分别浸入标准溶液中孵育，孵育后用磷酸缓冲溶液冲洗免疫传感器，在K3Fe(CN)6溶液中进行差分脉冲伏安(DPV)扫描，记录响应电流；空白标样的响应电流为I0，含有游离雌酚的标样的响应电流为Ix，响应电流的增加值ΔI等于含有游离雌酚的标样的响应电流Ix与空白标样的响应电流I0的差值。将所述ΔI与标准溶液中雌酚的浓度C绘制成ΔI-C工作曲线，采用线性回归法得到ΔI-C线性回归方程；
4)雌酚浓度的测定：将待测样品配制为含有与步骤2)相同浓度的己二烯雌酚抗体的磷酸缓冲溶液，按照步骤3)的方法对所述免疫传感器进行孵育和差分脉冲伏安扫描，记录响应电流；根据响应电流的增加值ΔI和ΔI-C线性回归方程，得到雌酚含量。
本发明有如下的有益效果：由于采用了对三种雌性激素类化合物即己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚都具有较高交叉反应率的己二烯雌酚抗体，因而能实现对上述三种雌性激素类化合物的共同检测。并且具有很低的检出限和较宽的线性范围。
附图说明
图1己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚的结构式。
图2为纳米金/己烯雌酚/石墨烯/壳聚糖复合物修饰的免疫电化学传感器在含有效价浓度为1：6400的己二烯雌酚抗体和不同浓度的游离的己烯雌酚(a)纳米金/石墨烯/己烯雌酚/壳聚糖修饰电极修饰电极，在含有相同浓度的己二烯雌酚抗体和不同浓度的游离的己烯雌酚(b)4000ng/mL，(c)3000ng/mL，(d)1000ng/mL，(e)500ng/mL，(f)100ng/mL，(g)50ng/mL，(h)1ng/mL，(i)0ng/mL的孵育液中孵育后，在2mM的K3[Fe(CN)6]的PBS溶液中的DPV曲线图。插入图为响应电流的变化ΔI与己烯雌酚浓度的线性曲线图。
图3为纳米金/己二烯雌酚/石墨烯/壳聚糖复合物修饰的免疫电化学传感器在含有效价浓度为1：6400的己二烯雌酚抗体和不同浓度的游离的己二烯雌酚(a)纳米金/石墨烯/己二烯雌酚/壳聚糖修饰电极修饰电极，在含有相同浓度的己二烯雌酚抗体和不同浓度的游离的己二烯雌酚(b)4000ng/mL，(c)3000ng/mL，(d)2000ng/mL，(e)1000ng/mL，(f)500ng/mL，(g)100ng/mL，(h)50ng/mL，(i)10ng/mL，(j)0ng/mL的孵育液中孵育后，在2mM的K3[Fe(CN)6]的PBS溶液中的DPV曲线图。插入图为响应电流的变化ΔI与己二烯雌酚浓度的 线性曲线图。
图4为纳米金/己烷雌酚/石墨烯/壳聚糖复合物修饰的免疫电化学传感器在含有效价浓度为1：6400的己二烯雌酚抗体和不同浓度的游离的己烷雌酚(a)纳米金/石墨烯/己烷雌酚/壳聚糖修饰电极修饰电极，在含有相同浓度的己二烯雌酚抗体和不同浓度的游离的己烷雌酚(b)4000ng/mL，(c)3000ng/mL，(d)2000ng/mL，(e)1000ng/mL，(f)500ng/mL，(g)100ng/mL，(h)0ng/mL的孵育液中孵育后，在2mM的K3[Fe(CN)6]的PBS溶液中的DPV曲线图。插入图为响应电流的变化ΔI与己烷雌酚浓度的线性曲线图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例做详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施给出了详细的实施方案和具体的操作过程。但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1对己烯雌酚的检测
将纳米金/己烯雌酚/石墨烯/壳聚糖复合物修饰的免疫电化学传感器浸入总体积为50μL的含有不同浓度的游离己烯雌酚，和效价浓度为1：6400的己二烯雌酚抗体的磷酸缓冲溶液中，在37℃孵育30分钟，用磷酸缓冲溶液冲洗后于2mmol/L的K3[Fe(CN)6]溶液中进行差分脉冲伏安(DPV)扫描。
将在己烯雌酚浓度为0的孵育液中孵育后的修饰电极的DPV峰电流定义为I0，在含有不同浓度己烯雌酚的孵育液孵育后的修饰电极的DPV峰电流定义为IX，计算ΔI＝IX-I0，以ΔI对己烯雌酚浓度(C)作图可得ΔI-C工作曲线。采用线性回归法得到ΔI-C线性回归方程，己烯雌酚的浓度在1～4000ng/mL范围内与ΔI成正比，线性相关系数为0.98532。以大于噪音信号3倍的电流信号对应的浓度为最低检出限，重复5次以上实验得出，上述方法的最低检测限为0.2ng/mL。
实施例2对己二烯雌酚的检测
将纳米金/己二烯雌酚/石墨烯/壳聚糖复合物修饰的免疫电化学传感器浸入总体积为50μL的含有不同浓度的游离己二烯雌酚，和效价浓度为1：6400的己二烯雌酚抗体的磷酸缓冲溶液中，在37℃孵育40分钟，用磷酸缓冲溶液冲洗后于2mmol/L的K3[Fe(CN)6]溶液中进行差分脉冲伏安(DPV)扫描。
将在己二烯雌酚浓度为0的孵育液中孵育后的修饰电极的DPV峰电流定义为I0，在含有不同浓度己二烯雌酚的孵育液孵育后的修饰电极的DPV峰电流定义为IX，计算ΔI＝IX-I0，以ΔI对己二烯雌酚浓度(C)作图可得ΔI-C工作曲线。采用线性回归法得到ΔI-C线性回归方程，己二烯雌酚的浓度在10～4000ng/mL范围内与ΔI成正比，线性相关系数为0.98324。以 大于噪音信号3倍的电流信号对应的浓度为最低检出限，重复5次以上实验得出，上述方法的最低检测限为0.05ng/mL。
实施例3猪肉样品中加标己烷雌酚的测定
1)猪肉样品的处理：称取1±0.0050g猪肉于到10mL的样品管中，加入己烯雌酚标准液，和3mL乙腈-丙酮提取液(V：V＝4:1)，混合物超声振荡30分钟，于2000r/m下离心10分钟，将上清液转移至氮吹管中，残渣用3mL的相同提取液重复提取1次，上清液合并在氮吹管中。提取物在氮吹条件下于50℃温度下浓缩蒸发，浓缩物加入1mL的pH为7.4磷酸缓冲溶液溶解后用于电化学分析。
2)猪肉样品中加标己烷雌酚的测定：分别取等量的不同猪肉提取液样品，和己二烯雌酚抗体溶液及磷酸缓冲溶液混合配成孵育液，使得总体积为50μL，且己二烯雌酚抗体浓度均相等。将纳米金/己烷雌酚/石墨烯/壳聚糖复合物修饰的免疫电化学传感器浸入孵育液中，在37℃孵育50分钟，用磷酸缓冲溶液冲洗后于2mmol/L的K3[Fe(CN)6]溶液中进行差分脉冲伏安(DPV)扫描。定义空白样品的峰电流为I0，其他样品的峰电流IX，计算△I＝IX-I0。通过采用与实施例1中相同的方法得到的DPV峰电流差值ΔI与己烷雌酚的浓度C的ΔI-C工作曲线，得到己烷雌酚的浓度，检测回收率结果如表1。
表1为免疫传感器检测加标猪肉中的己烷雌酚浓度的回收率

Claims (5)

1.己二烯雌酚抗体在同时检测三种雌性激素类似化合物，即己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，进行三种雌性激素类似化合物的检测时，所采用的抗体均为己二烯雌酚抗体。
3.用于权利要求1所述应用的检测溶液配制：配制一组包括空白标样在内的含有不同浓度游离雌酚的PH为7.4的磷酸缓冲溶液为标准溶液，其特征在于含有相同浓度的己二烯雌酚抗体。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于通过电化学免疫传感器检测，传感器制备：在打磨、抛光和超声清洗后的玻碳电极表面沉积金纳米粒子；然后滴涂雌酚—石墨烯—壳聚糖混合液制得。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，进行三种雌性激素类似化合物的检测时，所采用的免疫电化学传感修饰有三种雌性激素类似化合物，即己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚中的任何一种雌酚。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106841639A (zh) * 2017-01-06 2017-06-13 南京师范大学 一种基于双抗体夹心法检测雌酚和双酚a的方法
CN106841348A (zh) * 2017-01-06 2017-06-13 南京师范大学 检测雌酚和双酚a的电化学免疫传感器及其制备方法和应用
CN108508203A (zh) * 2018-03-30 2018-09-07 南京师范大学 一种检测晚期糖基化终末产物的方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1967247A (zh) * 2006-05-18 2007-05-23 李季 一种适用于己烯雌酚残留分析的酶联免疫吸附检测试剂盒
CN101914157A (zh) * 2010-07-06 2010-12-15 华南农业大学 一种己烯雌酚抗体的制备方法
CN102262125A (zh) * 2011-07-28 2011-11-30 南京师范大学 检测己烯雌酚的电化学免疫传感器及其制备方法和应用
CN103472118A (zh) * 2013-09-26 2013-12-25 南京师范大学 一种检测雌酚的电化学免疫检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1967247A (zh) * 2006-05-18 2007-05-23 李季 一种适用于己烯雌酚残留分析的酶联免疫吸附检测试剂盒
CN101914157A (zh) * 2010-07-06 2010-12-15 华南农业大学 一种己烯雌酚抗体的制备方法
CN102262125A (zh) * 2011-07-28 2011-11-30 南京师范大学 检测己烯雌酚的电化学免疫传感器及其制备方法和应用
CN103472118A (zh) * 2013-09-26 2013-12-25 南京师范大学 一种检测雌酚的电化学免疫检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张琴等: "己烯雌酚单克隆抗体免疫亲和柱的制备及应用", 《中国兽医杂志》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106841639A (zh) * 2017-01-06 2017-06-13 南京师范大学 一种基于双抗体夹心法检测雌酚和双酚a的方法
CN106841348A (zh) * 2017-01-06 2017-06-13 南京师范大学 检测雌酚和双酚a的电化学免疫传感器及其制备方法和应用
CN106841348B (zh) * 2017-01-06 2019-06-21 南京师范大学 检测雌酚和双酚a的电化学免疫传感器及其制备方法和应用
CN108508203A (zh) * 2018-03-30 2018-09-07 南京师范大学 一种检测晚期糖基化终末产物的方法和应用

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