CN108508203A - 一种检测晚期糖基化终末产物的方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测晚期糖基化终末产物的方法和应用。所述方法首先制备石墨烯‑壳聚糖/N(ε)羧甲基赖氨酸修饰的玻碳电极，然后基于戊糖素单克隆抗体能与多种晚期糖基化终末产物产生交叉免疫反应的原理，结合间接竞争法，可实现对包括N(ε)羧甲基赖氨酸、N(ε)羧乙基赖氨酸、戊糖素、丙酮醛咪唑啉酮和精氨嘧啶在内的五种晚期糖基化终末产物的多残留检测。本发明提供的检测方法解决了目前晚期糖基化终末产物检测方法只能检测单一物质的问题，并具有较高的灵敏度(检测限在0.06～0.1ng/mL之间)和较宽的线性范围(0.1～1000ng/mL)，操作简便，成本较低，完全适用于临床上人体AGEs检测的需要，具有重要的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明属于食品安全检测和分析化学技术领域，具体涉及一种检测晚期糖基化终末产物的方法和应用。
背景技术
晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)是人体内糖类化合物与蛋白质、脂质、氨基酸等发生一系列不可逆、非酶促反应的最终产物。AGEs与多种广受社会关注的慢性疾病的发展过程紧密相关，如糖尿病及其并发症、尿毒症、阿尔次海默症、白内障、原发性骨性关节炎、动脉粥样硬化病变等。因此，AGEs的临床检测对于上述疾病的早期诊断和预防具有相当重要的意义和价值。
AGEs的种类极其多样化，目前仅知其中少数几种，如N(ε)羧甲基赖氨酸(CML)、N(ε)羧乙基赖氨酸(CEL)、戊糖素(PEN)、丙酮醛咪唑啉酮(MG)及精氨嘧啶(ARGP)(结构见式1)等。
由于AGEs结构复杂，有些甚至无确定结构，导致目前临床上对AGEs的检测相当困难，甚至无法确定检测对象。现今能用于检测AGEs的主要方法有免疫组织化学法、酶免疫吸附试验法、流动注射分析法等，但这些方法检测通常只能对某一种确定的AGEs进行检测，使得相关疾病在进行早期诊断时要进行大量重复检测工作。因此，AGEs的多残留检测是进行早期诊断和预防相关疾病的强有效手段。
电化学传感技术以其轻便、灵巧、检测速度快、灵敏度高等众多优点在分析领域受到了广泛关注，并得以大量应用，但到目前为止，有关AGEs的传感器分析检测技术几乎为零。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种检测晚期糖基化终末产物的方法和应用，该方法解决了目前AGEs不存在高效率、多残留检测方法的问题，且具有较高的检测灵敏度和较宽的线性范围。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种检测晚期糖基化终末产物的方法，包括以下步骤：
步骤1)电化学免疫传感器的制备：首先在打磨并清洗过的玻碳电极表面滴涂石墨烯-壳聚糖，晾干后在其表面滴涂N(ε)羧甲基赖氨酸溶液，再晾干后即得到所述的电化学免疫传感器；
步骤2)标准溶液的配制：配制含有晚期糖基化终末产物的乙醇溶液作为标准溶液，将含有浓度为0的晚期糖基化终末产物的标准溶液作为空白标样；
步骤3)工作曲线的建立：将步骤1)制备的电化学免疫传感器浸入含有戊糖素单克隆抗体和步骤2)制备的标准溶液的磷酸缓冲溶液中恒温孵育，孵育后用磷酸缓冲溶液冲洗电化学免疫传感器，然后将其置于5mmol/L二茂铁的乙腈溶液中进行差分脉冲伏安扫描，以孵育前后响应电流变化值ΔI对标准溶液中晚期糖基化终末产物浓度的对数值logC作图，得ΔI-logC工作曲线，采用线性回归法获得ΔI-logC线性回归方程；
步骤4)晚期糖基化终末产物的测定：配置含有待测样品的乙醇溶液，按照与步骤3)相同的方法对所述电化学免疫传感器进行孵育和差分脉冲伏安扫描，记录响应电流变化值ΔIx，将其代入ΔI-logC线性回归方程，即可得出待测样品中晚期糖基化终末产物的浓度。
优选的，所述晚期糖基化终末产物为N(ε)羧甲基赖氨酸、N(ε)羧乙基赖氨酸、戊糖素、丙酮醛咪唑啉酮或精氨嘧啶。
优选的，以步骤2)所述空白标样的测定值标准偏差的3倍作为样品检测限，重复步骤3)可得出晚期糖基化终末产物样品的检测限。
优选的，步骤2)所述乙醇溶液中，乙醇与水的体积比为2:3。
一种检测晚期糖基化终末产物的方法在AGEs临床检测上的应用。
本发明的有益效果如下：
本发明提供的检测晚期糖基化终末产物的方法，首先制备石墨烯-壳聚糖/N(ε)羧甲基赖氨酸修饰的玻碳电极，基于戊糖素单克隆抗体能与多种晚期糖基化终末产物产生交叉免疫反应的原理，通过N(ε)羧甲基赖氨酸与待测液中晚期糖基化终末产物竞争结合戊糖素抗体，可实现对N(ε)羧甲基赖氨酸(CML)、N(ε)羧乙基赖氨酸(CEL)、戊糖素(PEN)、丙酮醛-咪唑啉酮(MG)和精氨嘧啶(ARGP)等多种晚期糖基化终末产物的检测。本发明提供的方法成本低、操作简单、稳定性好、灵敏度极高(检测限在0.06～0.1ng/mL之间)，线性范围非常宽(0.1～1000ng/mL)，完全适用于临床上人体AGEs检测的需要，具有重要的实际应用价值。
附图说明
图1为电化学免疫传感器对N(ε)羧甲基赖氨酸(CML)进行检测的DPV曲线图；
图2为响应电流的变化值ΔI与CML浓度对数值logCCML的工作曲线图；
图3为电化学免疫传感器对N(ε)羧乙基赖氨酸(CEL)进行检测的DPV曲线图；
图4为响应电流的变化值ΔI与CEL浓度对数值logCCEL的工作曲线图；
图5为电化学免疫传感器对戊糖素(PEN)进行检测的DPV曲线图；
图6为响应电流的变化值ΔI与PEN浓度对数值logCPEN的工作曲线图；
图7为电化学免疫传感器对丙酮醛咪唑啉酮(MG)进行检测的DPV曲线图；
图8为响应电流的变化值ΔI与MG浓度对数值logCMG的工作曲线图；
图9为电化学免疫传感器对精氨嘧啶(ARGP)进行检测的DPV曲线图；
图10为响应电流的变化值ΔI与ARGP浓度对数值logCARGP的工作曲线图。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明做进一步阐述。
实施例1电化学免疫传感器的制备
首先在打磨并清洗过的玻碳电极表面滴涂6μL石墨烯-壳聚糖溶液，晾干后在其表面滴涂10μL N(ε)羧甲基赖氨酸(CML)溶液，再晾干后即得到所述的电化学免疫传感器。
实施例2对N(ε)羧甲基赖氨酸(CML)的检测
配制含有一系列不同浓度(包括空白)的CML的乙醇溶液(乙醇与水的体积比为2:3)作为标准溶液。
以实施例1的方法制备电化学免疫传感器，将其置于5mmol/L二茂铁的乙腈溶液中进行差分脉冲伏安(DPV)扫描，记录响应电流，记为I0。然后将其浸入总体积为50μL的含有8μL的戊糖素单克隆抗体和一系列不同浓度的CML标准溶液的磷酸缓冲溶液中，置于恒温箱中于37℃孵育40min，用磷酸缓冲溶液冲洗干净后置于5mmol/L二茂铁的乙腈溶液中进行差分脉冲伏安(DPV)扫描，DPV曲线图如图1所示。图中曲线从上到下(a-i)浓度依次为1000ng/mL、300ng/mL、100ng/mL、30ng/mL、10ng/mL、3ng/mL、1ng/mL、0.3ng/mL、0.25ng/mL。测得孵育前后电流值I0和It，其差值(ΔI＝I0-It)与CML浓度成线性关系，工作曲线图如图2所示。采用线性回归法得到的ΔI-logCCML线性回归方程为ΔI(μA)＝38.6291-4.2231logCCML(ng/mL)，当CML浓度在0.25～1000ng/mL范围内其ΔI与logCCML成正比，线性相关系数为0.9989。以空白标样测定值标准偏差的3倍(3σ)作为样品检测限，重复10次实验得出，以上述方法检测CML的检测限为0.06ng/mL。
实施例3对N(ε)羧乙基赖氨酸(CEL)的检测
配制含有一系列不同浓度(包括空白)的CEL的乙醇溶液(乙醇与水的体积比为2:3)作为标准溶液。
以实施例1的方法制备电化学免疫传感器，将其置于5mmol/L二茂铁的乙腈溶液中进行差分脉冲伏安(DPV)扫描，记录响应电流，记为I0。然后将其浸入总体积为50μL的含有8μL的戊糖素单克隆抗体和一系列不同浓度的CEL标准溶液的磷酸缓冲溶液中，置于恒温箱中于37℃孵育40min，用磷酸缓冲溶液冲洗干净后置于5mmol/L二茂铁的乙腈溶液中进行差分脉冲伏安(DPV)扫描，DPV曲线图如图3所示。图中曲线从上到下(a-i)浓度依次为3000ng/mL、1000ng/mL、300ng/mL、100ng/mL、30ng/mL、10ng/mL、3ng/mL、1ng/mL、0.3ng/mL。测得孵育前后电流值I0和It，其差值(ΔI＝I0-It)与CEL浓度成线性关系，工作曲线图如图4所示。采用线性回归法得到的ΔI-logCCEL线性回归方程为ΔI(μA)＝15.3476-4.1653logCCEL(ng/mL)，当CEL浓度在0.2～1000ng/mL范围内其ΔI与logCCEL成正比，线性相关系数为0.9996。以空白标样测定值标准偏差的3倍(3σ)作为样品检测限，重复10次实验得出，以上述方法检测CEL的检测限为0.09ng/mL。
实施例4对戊糖素(PEN)的检测
配制含有一系列不同浓度(包括空白)的PEN的乙醇溶液(乙醇与水的体积比为2:3)作为标准溶液。
以实施例1的方法制备电化学免疫传感器，将其置于5mmol/L二茂铁的乙腈溶液中进行差分脉冲伏安(DPV)扫描，记录响应电流，记为I0。然后将其浸入总体积为50μL的含有8μL的戊糖素单克隆抗体和一系列不同浓度的PEN标准溶液的磷酸缓冲溶液中，置于恒温箱中于37℃孵育40min，用磷酸缓冲溶液冲洗干净后置于5mmol/L二茂铁的乙腈溶液中进行差分脉冲伏安(DPV)扫描，DPV曲线图如图5所示。图中曲线从上到下(a-i)浓度依次为1000ng/mL、300ng/mL、100ng/mL、30ng/mL、10ng/mL、3ng/mL、1ng/mL、0.3ng/mL、0.1ng/mL。测得孵育前后电流值I0和It，其差值(ΔI＝I0-It)与PEN浓度成线性关系，工作曲线图如图6所示。采用线性回归法得到的ΔI-logCPEN线性回归方程为ΔI(μA)＝21.5835-4.1316logCPEN(ng/mL)，当PEN浓度在0.1～1000ng/mL范围内其ΔI与logCPEN成正比，线性相关系数为0.9978。以空白标样测定值标准偏差的3倍(3σ)作为样品检测限，重复10次实验得出，以上述方法检测PEN的检测限为0.08ng/mL。
实施例5对丙酮醛咪唑啉酮(MG)的检测
配制含有一系列不同浓度(包括空白)的MG的乙醇溶液(乙醇与水的体积比为2:3)作为标准溶液。
以实施例1的方法制备电化学免疫传感器，将其置于5mmol/L二茂铁的乙腈溶液中进行差分脉冲伏安(DPV)扫描，记录响应电流，记为I0。然后将其浸入总体积为50μL的含有8μL的戊糖素单克隆抗体和一系列不同浓度的MG标准溶液的磷酸缓冲溶液中，置于恒温箱中于37℃孵育40min，用磷酸缓冲溶液冲洗干净后置于5mmol/L二茂铁的乙腈溶液中进行差分脉冲伏安(DPV)扫描，DPV曲线图如图7所示。图中曲线从上到下(a-i)浓度依次为1000ng/mL、300ng/mL、100ng/mL、30ng/mL、10ng/mL、3ng/mL、1ng/mL、0.3ng/mL、0.15ng/mL。测得孵育前后电流值I0和It，其差值(ΔI＝I0-It)与MG浓度成线性关系，工作曲线图如图8所示。采用线性回归法得到的ΔI-logCMG线性回归方程为ΔI(μA)＝15.5141-3.4486logCMG(ng/mL)，当PEN浓度在0.3～1000ng/mL范围内其ΔI与logCMG成正比，线性相关系数为0.9921。以空白标样测定值标准偏差的3倍(3σ)作为样品检测限，重复10次实验得出，以上述方法检测MG的检测限为0.1ng/mL。
实施例6对精氨嘧啶(ARGP)的检测
配制含有一系列不同浓度(包括空白)的ARGP的乙醇溶液(乙醇与水的体积比为2:3)作为标准溶液。
以实施例1的方法制备电化学免疫传感器，将其置于5mmol/L二茂铁的乙腈溶液中进行差分脉冲伏安(DPV)扫描，记录响应电流，记为I0。然后将其浸入总体积为50μL的含有8μL的戊糖素单克隆抗体和一系列不同浓度的ARGP标准溶液的磷酸缓冲溶液中，置于恒温箱中于37℃孵育40min，用磷酸缓冲溶液冲洗干净后置于5mmol/L二茂铁的乙腈溶液中进行差分脉冲伏安(DPV)扫描，DPV曲线图如图9所示。图中曲线从上到下(a-h)浓度依次为1000ng/mL、300ng/mL、100ng/mL、30ng/mL、10ng/mL、3ng/mL、1ng/mL、0.3ng/mL。测得孵育前后电流值I0和It，其差值(ΔI＝I0-It)与ARGP浓度成线性关系，工作曲线图如图10所示。采用线性回归法得到的ΔI-logCARGP线性回归方程为ΔI(μA)＝29.3966-5.3296logCARGP(ng/mL)，当ARGP浓度在0.15～1000ng/mL范围内其ΔI与logCARGP成正比，线性相关系数为0.9970。以空白标样测定值标准偏差的3倍(3σ)作为样品检测限，重复10次实验得出，以上述方法检测ARGP的检测限为0.07ng/mL。
Claims (5)
1.一种检测晚期糖基化终末产物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)电化学免疫传感器的制备：首先在打磨并清洗过的玻碳电极表面滴涂石墨烯-壳聚糖，晾干后在其表面滴涂N(ε)羧甲基赖氨酸溶液，再晾干后即得到所述的电化学免疫传感器；
步骤2)标准溶液的配制：配制含有晚期糖基化终末产物的乙醇溶液作为标准溶液，将含有浓度为0的晚期糖基化终末产物的标准溶液作为空白标样；
步骤3)工作曲线的建立：将步骤1)制备的电化学免疫传感器浸入含有戊糖素单克隆抗体和步骤2)制备的标准溶液的磷酸缓冲溶液中恒温孵育，孵育后用磷酸缓冲溶液冲洗电化学免疫传感器，然后将其置于5mmol/L二茂铁的乙腈溶液中进行差分脉冲伏安扫描，以孵育前后响应电流变化值ΔI对标准溶液中晚期糖基化终末产物浓度的对数值logC作图，得ΔI-logC工作曲线，采用线性回归法获得ΔI-logC线性回归方程；
步骤4)晚期糖基化终末产物的测定：配置含有待测样品的乙醇溶液，按照与步骤3)相同的方法对所述电化学免疫传感器进行孵育和差分脉冲伏安扫描，记录响应电流变化值ΔIx，将其代入ΔI-logC线性回归方程，即可得出待测样品中晚期糖基化终末产物的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种检测晚期糖基化终末产物的方法，其特征在于，所述晚期糖基化终末产物为N(ε)羧甲基赖氨酸、N(ε)羧乙基赖氨酸、戊糖素、丙酮醛咪唑啉酮或精氨嘧啶。
3.根据权利要求1所述的一种检测晚期糖基化终末产物的方法，其特征在于，以步骤2)所述空白标样的测定值标准偏差的3倍作为样品检测限，重复步骤3)可得出晚期糖基化终末产物样品的检测限。
4.根据权利要求1所述的一种检测晚期糖基化终末产物的方法，其特征在于，步骤2)所述乙醇溶液中，乙醇与水的体积比为2:3。
5.权利要求1～4任一项所述的检测晚期糖基化终末产物的方法在AGEs临床检测上的应用。
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