CN111551537B - 一种基于表面增强拉曼技术检测牛奶中四环素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于表面增强拉曼技术检测牛奶中四环素的方法，属于拉曼光谱技术领域。本发明使用PDMS腔结构的纳米银基底作为拉曼增强基底，同时将4‑氨基‑1丁醇与SERS基底结合使用，使其SERS增强优于单独使用PDMS腔或者纳米银颗粒。4‑氨基‑1‑丁醇的加入使其SERS增强优于单独使用PDMS腔或者纳米银颗粒，四环素检测限可达到0.2μg/L。本发明中的PDMS等离子体腔可以作为SERS基底检测牛奶中的四环素，不需要进行牛奶样品的预处理，检测时间在十分钟内，检出限低至0.2μg/L，这对于监督四环素类抗生素的滥用和残留具有重要意义。

Description

一种基于表面增强拉曼技术检测牛奶中四环素的方法

技术领域

本发明涉及一种基于表面增强拉曼技术检测牛奶中四环素的方法，属于拉曼光谱技术领域。

背景技术

四环素是一种常用的兽药抗生素，在治疗和预防疾病方面具有抗菌活性。然而，四环素的滥用导致了耐药性基因在其他动物和人类中的广泛传播。在实际环境中，低浓度的四环素残留物仍然可能导致健康损害。最终四环素会通过牛奶和鸡蛋等食物在人体中富集，最终危害人体健康。

当前，检测牛奶中四环素的主要方法有:色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附法。这些方法具有较高的精度和可靠性，但其检测步骤大多比较复杂和耗时，需要样品预处理以及专业的仪器和人工。因此，急需寻找一种更加简单、快速、灵敏的四环素检测方法。

拉曼光谱是识别生物分子最常用的振动光谱。拉曼光谱能提供化学键相关的有价值的信息，在食品检测，药理分析中具有很大的潜力。此外，这是一种不需要对食品样品进行任何预处理的无损检测技术。表面增强拉曼光谱(SERS)技术由于结合了拉曼光谱的指纹识别能力和等离子体增强的高灵敏度特点，使其具有超灵敏检测的有效性。SERS技术已广泛应用于环境监测、化学和生物医学等领域。它具有无接触、检出限低、检测时间短等优点，更适合于抗生素的检测。此外，在抗生素检测领域，也有学者提出利用SERS技术检测水溶液中的四环素，但是SERS技术应用于牛奶中四环素检测的报道非常少并且检出限相对于传统方法不具优势。

发明内容

[技术问题]

目前检测牛奶中四环素的主要方法有:色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附法等，这检测步骤大多比较复杂和耗时，需要样品预处理以及专业的仪器和人工。同时，利用SERS技术检测牛奶中四环素的报道非常少并且检出限相对于传统方法不具优势。

[技术方案]

针对上述问题，本发明提供了一种基于表面增强拉曼技术检测牛奶中四环素的方法，本发明使用PDMS腔结构的纳米银基底作为拉曼增强基底，同时将4-氨基-1丁醇与SERS基底结合使用，使其SERS增强优于单独使用PDMS腔或者纳米银颗粒。

本发明提供了一种基于SERS技术检测四环素的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将硝酸银溶液滴入PDMS腔中，得到基于PDMS腔的纳米银SERS基底；

(2)稀释四环素母液，配置不同浓度梯度的标准溶液，将4-氨基-1丁醇与不同浓度梯度的标准溶液混合均匀得到样品液，将样品液滴入基于PDMS腔的纳米银SERS基底中，静置，然后测得基底中样品液的表面增强拉曼谱图；

(3)利用拉曼谱图中1560cm^-1±5cm^-1处特征峰与四环素浓度的构建线性模型；

(4)将待测物与4-氨基-1丁醇混合均匀得到待测样品，滴入基于PDMS腔的纳米银SERS基底中，静置，测得待测样品的表面增强拉曼谱图，根据步骤(3)中的线性模型，得到待测样品中四环素的浓度。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述PDMS腔的制备方法为：取道康宁Sylgard-184PDMS胶A部分与B部分混合后搅拌均匀，静置固化。

在本发明的一种实施方式中，道康宁Sylgard-184PDMS胶A部分与B部分的质量比为10：1。

在本发明的一种实施方式中，静置固化的方法为：在恒温箱内固化，时间为60～72h。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述硝酸银溶液浓度为10～100μg/mL。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述硝酸银溶液浓度为50μg/mL。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述标准溶液的配制方法为配置100mg/L的四环素母液，并取母液分别稀释至10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，150，200μg/L。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)、(4)中将样品液或待测样品滴入基于PDMS腔的纳米银SERS基底中，静置3～8min后抽出。

本发明提供了一种基于SERS技术检测牛奶中四环素的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将硝酸银溶液滴入PDMS腔中，得到基于PDMS腔的纳米银SERS基底；

(2)稀释四环素母液，配置不同浓度梯度的标准溶液，将4-氨基-1丁醇与标准溶液混合均匀得到样品液，将样品液滴入基于PDMS腔的纳米银SERS基底中，静置，然后测得基底中样品液的表面增强拉曼谱图；

(3)利用拉曼谱图中1560cm^-1处特征峰与四环素浓度的构建线性模型；

(4)将待测牛奶与4-氨基-1丁醇混合均匀得到待测牛奶样品，滴入基于PDMS腔的纳米银SERS基底中，静置，测得待测牛奶样品的表面增强拉曼谱图，根据步骤(3)中的线性模型，得到待测牛奶样品中四环素的浓度。

本发明提供了上述方法在检测蛋类中四环素中的应用。

本发明提供了上述方法在食品检测领域的应用。

[有益效果]：

1、本发明使用PDMS腔结构的纳米银基底作为拉曼增强基底，其碗状立体的结构以及PDMS材料本身的吸附性，加强了基底对待测目标分子的抓取，提高了检测能力。

2、本发明中的纳米银颗粒具有表面等离子体共振性能，起到增强拉曼信号的作用。

3、本发明将4-氨基-1丁醇与SERS基底结合使用，4-氨基-1-丁醇的加入使其SERS增强优于单独使用PDMS腔或者纳米银颗粒，四环素检测限可达到0.2μg/L。原因在于：带负电荷的银表面与带正电荷的4-氨基-1-丁醇氨基相连。4-氨基-1-丁醇的羟基与四环素的氨基相连。同时，4-氨基-1-丁醇的碳链结构有助于在银表面富集更多的四环素分子。

4、本发明中的PDMS等离子体腔可以作为SERS基底检测牛奶中的四环素，不需要进行牛奶样品的预处理，检测时间在十分钟内，检出限低至0.2μg/L，这对于监督四环素类抗生素的滥用和残留具有重要意义。

附图说明

图1为基于SERS技术检测牛奶中四环素的流程图。

图2为实施例1中1560cm^-1/490cm^-1特征峰相对强度和四环素浓度关系点线图。

图3为实施例1中1560cm^-1/490cm^-1特征峰相对强度和四环素浓度的线性拟合图。

图4为实施例1中配制的待测牛奶样品的SERS光谱图。

图5为对比例1中没有添加4-氨基-1-丁醇的PDMS腔检测不同浓度的四环素水溶液的SERS光谱。

图6为对比例2中4-氨基-1-丁醇及其类似物SERS增强四环素的效果对比图；其中，1号点为tris，2号点为4-氨基-1-丁醇，3号点为3-氨基-1-丙醇。

图7为对比例3中1619cm^-1/490cm^-1特征峰相对强度和四环素浓度的线性拟合图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

【实施例1】

1、制备基于PDMS腔的SERS基底

(1)制备硝酸银溶液

a.配制浓度为50μg/mL的硝酸银水溶液；

(2)制备PDMS胶

a.取质量比为10：1的道康宁Sylgard-184PDMS胶A部分与B部分，迅速剧烈搅拌，排尽气泡；

b.置于23℃恒温箱内固化72h。

(3)制备基于PDMS腔的SERS基底

a.取配置的100μL硝酸银溶液用移液枪滴入固化好的PDMS胶中；

b.将滴入硝酸银溶液的PDMS基底置于23℃恒温箱内固化72h。

2、基于PDMS腔SERS基底检测四环素

(1)稀释四环素母液，配置完整浓度梯度标准溶液，将浓度为0.25mol/L4-氨基-1丁醇与标准溶液混合均匀得到四环素浓度为10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，150，200μg/L样品液，将样品液滴入基于PDMS腔的纳米银SERS基底中，静置6min后抽出，然后测得基底中样品液的表面增强拉曼谱图；

(2)利用拉曼谱图中1560cm^-1处特征峰与四环素浓度的构建线性模型。

图1为基于SERS技术检测牛奶中四环素的流程图。

图2为I₁₅₉₀/I₄₉₀特征峰相对强度与四环素浓度之间关系的点线图，测量配置好的10～200μg/L的样品液的拉曼谱图，根据检测得到的拉曼光谱，计算I₁₅₉₀/I₄₉₀特征峰相对强度，绘制整个浓度梯度内I₁₅₉₀/I₄₉₀特征峰相对强度与四环素浓度关系的点线图。由图2可以看出，随着浓度的增加，相对强度先增大后减小，且在15μg/L-55μg/L的范围内线性度较好，所以在该范围内作线性拟合。

图3为I₁₅₉₀/I₄₉₀特征峰相对强度与四环素浓度的线性拟合图，拟合方程y＝-0.51885+0.05358x，相关系数为0.99768，y为1560cm^-1拉曼峰相对强度，x为四环素浓度，单位μg/L。选择1560cm^-1处数据进行线性拟合，计算得到四环素检测限为0.2μg/L，线性范围是15-55μg/L。

3、实际样本检测

将待测牛奶样品与4-氨基-1丁醇混合均匀，滴入基于PDMS腔的纳米银SERS基底中，静置，测得待测牛奶样品的表面增强拉曼谱图，根据步骤(3)中的线性模型，得到牛奶样品中四环素的浓度。

利用上述检测方法，对牛奶样品中含四环素15μg/L的待测样进行检测，其拉曼图谱如4所示，待测样品再特征峰1560cm^-1处的相对强度值为0.27577，经过线性模型计算得到待测样中的四环素浓度为14.83065μg/L，回收率为98.87％。

利用上述检测方法，对牛奶样品中含四环素30μg/L的待测样进行检测，其拉曼图谱如4所示，待测样品再特征峰1560cm^-1处的相对强度值为1.09958，经过线性模型计算得到待测样中的四环素浓度为30.20597μg/L，回收率为100.68％。

利用上述检测方法，对牛奶样品中含四环素55μg/L的待测样进行检测，其拉曼图谱如4所示，待测样品再特征峰1560cm^-1处的相对强度值为2.79907，经过线性模型计算得到待测样中的四环素浓度为61.94023μg/L，回收率为112.61％。

【对比例1】

1、制备基于PDMS腔的SERS基底：与实施例1相同；

2、基于PDMS腔SERS基底检测四环素：

(1)配置1000mg/L的四环素水溶液母液，并分别稀释成浓度为5，25，50，100，200mg/L的四环素，将样品液滴入基于PDMS腔的纳米银SERS基底中；

(2)静置6min后抽出，然后测得基底中样品液的表面增强拉曼谱图。

同时测试四环素粉末的拉曼特征峰，观察PDMS腔未加4-氨基-1-丁醇时检测四环素的增强效果。

图5为本对比例中没有添加4-氨基-1-丁醇的PDMS腔检测不同浓度的四环素水溶液的SERS光谱，可以得知未添加4-氨基-1-丁醇的PDMS腔对四环素也有SERS增强效果，且在一些浓度，例如5mg/L时能观察到较为明显特征峰。但是检测的浓度范围过高，只能在四环素浓度为毫克每升的浓度范围内检测；四环素浓度更低时，SERS增强效果差。实施例1中的μg/L,10^-6数量级的检测限远远低于对比例1中的检测限。此时未加4-氨基-1-丁醇的PDMS腔检测四环素水溶液时，检测浓度在mg/L，10^-3这一数量级。通过对比例1和实施例1的比对，证明了4-氨基-1-丁醇的加入大大提高了SERS增强倍数。

【对比例2】

1、制备基于PDMS腔的SERS基底：与实施例1相同；

2、基于PDMS腔SERS基底检测四环素：

(1)制备tris溶液，3-氨基-1-丙醇溶液，4-氨基-1-丁醇溶液，四环素水溶液

a.配制浓度为0.1mol/L的3-氨基-1-丙醇水溶液，0.1mol/L的4-氨基-1-丁醇溶液和0.1mol/L tris溶液；

b.配置100μg/L四环素的水溶液。

(2)配置待测溶液：

将(1)b中配置的四环素水溶液分别与0.1mol/L的3-氨基-1-丙醇水溶液，0.1mol/L tris溶液和0.1mol/L的4-氨基-1-丁醇溶液混合。

(3)检测拉曼光谱，构建线性模型：

将(2)中配置好的混合溶液进行拉曼光谱检测，比较类似物增强同一浓度四环素时1560cm^-1特征峰的拉曼强度大小。

图6为4-氨基-1-丁醇及其类似物SERS增强四环素的效果对比图，通过检测国家标准要求的100μg/L的同一浓度四环素溶液，对比丁醇及其类似物能否和PDMS基底产生同样强的SERS增强效果。经过对比最终得知：3-氨基-1-丙醇和tris仅能观察到1560cm^-1处的四环素特征峰，且强度弱于4-氨基-1-丁醇增强后的特征峰强度。4-氨基-1-丁醇能观察到包括1560cm^-1在内的多个四环素特征峰，且强度高于类似物，峰形更优，因而选择4-氨基-1-丁醇和PDMS等离子体腔结合作为基底。

【对比例3】

1、制备基于PDMS腔的SERS基底：与实施例1相同；

2、基于PDMS腔SERS基底检测四环素：

确定1619cm^-1拉曼特征峰相对强度和四环素浓度的线性关系，其他条件均与实施例1相同，在origin软件中对数据进行线性拟合。

图7为1619cm^-1/490cm^-1特征峰相对强度和四环素浓度的线性拟合图，拟合方程为y＝-0.13868+0.03948x，相关系数为0.99109，y为拉曼峰强度，x为四环素浓度，单位μg/L。利用1619cm^-1/490cm^-1特征峰相对强度和四环素浓度的关系建立方程，其相关系数0.99107小于1560cm^-1处数据拟合的相关系数0.99768，且拟合方程斜率0.03948小于1560cm^-1处数据的拟合方程的斜率0.05358。所以1619cm^-1处数据的拟合程度劣于1560cm^-1处数据的拟合程度，并且斜率小，检测灵敏度更小。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种基于SERS技术检测四环素的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)配置硝酸银的浓度为50μg/mL，取配置的100μL硝酸银溶液用移液枪滴入固化好的PDMS胶中，之后将滴入硝酸银溶液的PDMS基底置于23℃恒温箱内固化72h，得到基于PDMS腔的纳米银SERS基底；

(2)稀释四环素母液，配置不同浓度梯度的标准溶液，将4-氨基-1丁醇与不同浓度梯度的标准溶液混合均匀得到样品液，将样品液滴入基于PDMS腔的纳米银SERS基底中，静置，然后测得基底中样品液的表面增强拉曼谱图；

(3)利用拉曼谱图中1560cm^-1±5cm^-1处特征峰与四环素浓度构建线性模型；

(4)将待测物与4-氨基-1丁醇混合均匀得到待测样品，滴入基于PDMS腔的纳米银SERS基底中，静置，测得待测样品的表面增强拉曼谱图，根据步骤(3)中的线性模型，得到待测样品中四环素的浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述PDMS腔的制备方法为：取道康宁Sylgard-184PDMS胶A部分与B部分混合后搅拌均匀，静置固化。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，道康宁Sylgard-184PDMS胶A部分与B部分的质量比为10：1。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，静置固化的方法为：在恒温箱内固化，时间为60～72h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述硝酸银溶液浓度为10～100μg/mL。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述硝酸银溶液浓度为50μg/mL。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)、(4)中将样品液或待测样品滴入基于PDMS腔的纳米银SERS基底中，静置3～8min后抽出。

8.一种基于SERS技术检测牛奶中四环素的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将硝酸银溶液滴入PDMS腔中，得到基于PDMS腔的纳米银SERS基底；

(2)稀释四环素母液，配置不同浓度梯度的标准溶液，将4-氨基-1丁醇与标准溶液混合均匀得到样品液，将样品液滴入基于PDMS腔的纳米银SERS基底中，静置，然后测得基底中样品液的表面增强拉曼谱图；

(3)利用拉曼谱图中1560cm^-1处特征峰与四环素浓度构建线性模型；

(4)将待测牛奶与4-氨基-1丁醇混合均匀得到待测牛奶样品，滴入基于PDMS腔的纳米银SERS基底中，静置，测得待测牛奶样品的表面增强拉曼谱图，根据步骤(3)中的线性模型，得到待测牛奶样品中四环素的浓度。

9.权利要求1～7任一项所述的方法在检测蛋类中四环素的应用。

10.权利要求1～7任一项所述的方法在食品检测领域的应用。

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