CN106770172B - 一种牛奶中四环素残留表面增强拉曼光谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于适配体的牛奶中四环素残留表面增强拉曼光谱检测方法。该方法为：以制备的修饰对巯基苯胺标记分子的金纳米颗粒/二氧化硅核壳复合纳米材料作为表面增强拉曼基底，以加标回收率测定的方式实现牛奶中四环素残留的检测研究。制备的牛奶中四环素表面增强拉曼光谱检测方法，当四环素存在时，影响适配体在检测体系中的结构，与适配体发生特异性识别结合，从而引起不同浓度增强基底在不同浓度四环素存在下的释放，随后对检测体系进行磁性分离，将含有磁性微球‑适配体‑四环素复合物吸附至底，对含有不同浓度增强基底的上清液进行拉曼信号测定，依据不同拉曼强度的标记分子特征峰图谱，实现对牛奶中四环素残留灵敏间接检测的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于适配体的牛奶中四环素残留表面增强拉曼光谱检测方法，具体以制备修饰对巯基苯胺标记分子的金纳米颗粒/二氧化硅核壳复合纳米材料作为表面增强拉曼基底，结合能够与待检测目标物四环素发生特异性结合的核酸适配体，最终以加标回收率测定的方式实现牛奶中四环素残留的快速、灵敏、高效检测研究。
背景技术
四环素族四环素广泛作为畜牧业中饲料的药物添加剂,用于防治动物肠道感染和促生长。在奶牛养殖业中由于四环素的滥用和不遵从停药期规定，其可在肝肾组织富积并随乳汁分泌而排泄，并随食物链流入人体，其最明显的残留毒性是诱导耐药菌株的产生。为了保障消费者食品安全，欧盟等许多国家对于奶制品中四环素残留实施监控。常用的四环素残留分析方法目前主要有传统的微生物检验技术、分子生物学技术、仪器分析技术和免疫学技术。现有的这些分析方法虽各有优势，但都存在一定的局限性，或者前处理步骤复杂、时间长，或者仪器设备庞大昂贵等。因此，鉴于申请人在食品安全因子检测及拉曼光谱技术使用方面积累的良好的工作基础，本发明拟制备一种快速、灵敏、有效的检测方法，结合拉曼光谱技术实现牛奶中四环素残留的高效检测，为开创食品安全因子检测新途径提供理论基础。
目前，以优化修饰对巯基苯胺标记分子的金纳米颗粒/二氧化硅核壳复合纳米材料作为表面增强拉曼基底，结合能够与待检测目标物四环素发生特异性结合的核酸适配体对牛奶中四环素进行灵敏、有效检测仍未见报道。本发明作为一种新兴的四环素残留检测方法，从一定程度上实现了食品安全因子检测的新途径开发。
发明内容
本发明的目的是提供了一种基于适配体的牛奶中四环素残留表面增强拉曼光谱检测方法，其灵敏度高、可靠性强、检测速度快，实现对牛奶中四环素残留检测的目的，适用于食品安全、环境监测等技术领域。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案：制备检测方法，当四环素存在时，影响适配体在检测体系中的结构，与适配体发生特异性识别结合，从而引起不同浓度增强基底在不同浓度四环素存在下的释放，随后对检测体系进行磁性分离，将含有磁性微球-适配体-四环素复合物吸附至底，对含有不同浓度增强基底的上清液进行拉曼信号测定，依据不同拉曼强度的标记分子特征峰图谱，实现对牛奶中四环素残留灵敏间接检测的目的；该方法适用于食品安全、环境监测等技术领域。
上述的一种基于适配体的牛奶中四环素残留表面增强拉曼光谱检测方法，所述的增强基底为修饰对巯基苯胺(PATP)的金包二氧化硅核壳状纳米复合材料，与常用的增强基底金纳米颗粒、银纳米颗粒、金纳米棒、银纳米棒相比，具有极强的拉曼信号增强效果，同时，标记分子对巯基苯胺PATP固定在金核及二氧化硅壳之间成功避免外界环境的干扰，提高了获取拉曼信号的稳定性及重复性。
上述的一种基于适配体的牛奶中四环素残留表面增强拉曼光谱检测方法，所述的核酸适配体序列为：5’-NH2-CGT ACG GAA TTC GCT AGC CCC CCG GCA GGC CAC GGC TTGGGT TGG TCC CAC TGC GCG TGG ATC CGA GCT CCA CGT G-NH2-3’。
上述的一种基于适配体的牛奶中四环素残留表面增强拉曼光谱检测方法，所述的核酸适配体及四环素的特异性结合能力利用圆二色谱(CD)进行表征。
上述的一种基于适配体的牛奶中四环素残留表面增强拉曼光谱检测方法，所述的磁性微球，由蒸馏沉淀聚合反应制备而成，具有高饱和磁化强度71.5emu/g及优良的生物相容性，有利于快速、较易的生物反应及磁性分离。此外，该磁性微球具有自由的羧基表面，使其尽可能多的与核酸适配体发生缩合反应。
上述的一种基于适配体的牛奶中四环素残留表面增强拉曼光谱检测方法，所述的检测方法，标记分子对巯基苯胺PATP最佳浓度为1mM，增强基底最佳尺寸为43nm，磁性微球及核酸适配体的最佳反应时间为50min，四环素在检测体系中的最佳培养时间为70min。
上述的一种基于适配体的牛奶中四环素残留表面增强拉曼光谱检测方法，该方法包括如下具体步骤：
1)磁性微球制备：利用溶剂热法合成磁性微球，首先，称取1.350gFeCl3·6H2O，3.854g醋酸钠，0.400g柠檬酸钠溶解在装有70mL乙二醇的250mL三口圆底烧瓶中，随后，上述溶液在氩气保护下加热到300℃，并持续反应1h，形成均匀的黑红色溶液。待溶液冷却至室温，将其转移到至100mL聚四氟乙烯内衬不锈钢反应釜中，在200℃下密封、加热反应17小时。最后，通过磁分离收集的方法，以乙醇和超纯水清洗多次，最后分散至10mL乙醇中，得到黑色磁性微球待用。随后在磁性微球表面修饰PMAA壳，修饰之前，首先在其表面修饰改性聚苯乙烯(MPS)，具体操作步骤为，将40mL乙醇、10mL超纯水、1.5mL氨水及0.3g MPS添加至上述10mL磁性微球乙醇溶液中，并在60℃水浴环境下磁力震荡反应24h。最后，利用蒸馏沉淀聚合法以甲基丙烯酸(AA)、甲叉双丙烯酰胺(MBA)作为交联剂，偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，在乙腈溶剂中制备表面修饰PMAA壳的磁性微球。
2)磁性微球-适配体制备：具有羧基表面的磁性微球和具有氨基表面的核酸适配体利用缩合反应制备得到磁性微球-适配体螯合物。具体操作步骤为：取1mL羧基化的磁性微球分散至2mL EDC水溶液中，随后，将含有1mL1μM核酸适配体的PBS溶液加入至上述溶液中混合反应12h，最终得到磁性微球-适配体捕捉探针。
3)增强基底制备：将制备的金纳米颗粒(AuNPs)与对巯基苯胺PATP(300μL,1mM)乙醇溶液室温下反应约4h，得到Au/PATP。随后，将APTMS(600μL 1mM)逐滴加入混合溶液中，反应15min后，将5mL硅酸钠((0.54％(w/w))加入溶液中，在90℃水浴环境下反应30min，得到增强基底待用。
4)核酸适配体互补链-增强基底制备：搅拌15分钟后，将增强基底进行离心分离，弃上层液体，获得的沉淀用乙醇和乙腈分别清洗三次，在60℃下干燥1h，随后与溶解在乙腈溶剂中的三聚氯氰(3mL，0.2M)连续搅拌反应4h。此后，将产物进行离心，弃上层液体，获得的沉淀用乙腈、超纯水、硼酸盐缓冲液(BBS)分别清洗3次。最终产物再分散在BBS溶液中(2ml，pH＝8.4)，将0.4mL核酸适配体互补链(5.6nmol/L)BBS溶液加入其中，室温下轻微震动连续反应过夜。
5)拉曼光谱检测：首先，将制备的磁性微球-适配体与信号分子混合，37℃下连续震荡反应2h。随后，分别取200μL磁性微球-适配体/核酸适配体互补链-增强基底生物螯合物分装至一系列平行离心管中，随后，将100μL不同浓度的待检物四环素原液依次加入到上述离心管中，混合溶液37℃条件下连续震荡反应70min。以加有100μL超纯水的离心管作为对照组。反应结束后，利用磁铁进行磁性富集，同时利用拉曼光谱(785nm)在150cm-1-2000cm-1波长范围内对含有不同浓度增强基底的上清液拉曼强度进行测定。
6)牛奶中四环素加标回收率测定：利用加标回收结合本发明设计的检测方法实现液态牛奶样本中的四环素检测。检测前需要对样本进行预处理。首先取5ml牛奶于10℃，7000g转速下离心10min，弃去上层乳脂，将沉淀用超纯水稀释20倍，静置后将上清液用过滤器过滤，收集滤液。随后，分别在装有10mL滤液的离心管中加入不同浓度的四环素，然后取分别从每个离心管中取100μL混合液于分装有200uL检测体系的1.5mL离心管中，混合反应70min后，进行磁性分离，测定上清液拉曼光谱强度。
与现有的技术相比，本发明的优点在于：
本发明所制备的增强基底为修饰对巯基苯胺(PATP)的金包二氧化硅核壳状纳米复合材料，与常用的增强基底金纳米颗粒、银纳米颗粒、金纳米棒、银纳米棒相比，具有极强的拉曼信号增强效果，同时，标记分子对巯基苯胺PATP固定在金核及二氧化硅壳之间成功避免外界环境的干扰，提高了获取拉曼信号的稳定性及重复性。
本发明所制备的磁性微球，由蒸馏沉淀聚合反应制备而成，具有高饱和磁化强度71.5emu/g及优良的生物相容性，有利于快速、较易的生物反应及磁性分离。此外，该纳米微球具有自由的羧基表面，使其尽可能多的与核酸适配体发生缩合反应。
本发明制备的的检测方法用于牛奶中四环素残留检测灵敏度高，检测速度快，检测范围广，在食品安全、环境监测等技术领域广泛应用。
本发明所述的检测方法，过程参数全为优化所得，标记分子对巯基苯胺PATP最佳浓度为1mM，增强基底最佳尺寸为43nm，磁性微球及核酸适配体的最佳反应时间为50min，四环素在检测体系中的最佳培养时间为70min。
本发明利用圆二色谱(CD)对核酸适配体及四环素的特异性结合能力进行表征。
附图说明
图1为检测结果：(A)为不同浓度四环素拉曼光谱；(B)为标准曲线；
具体实施方式
实施实例1
为了进一步验证本发明所制备检测方法对牛奶中四环素残留检测的作用，本发明实例，以四环素(tetracycline)为例，具体操作步骤如下：
(1)磁性微球制备：利用溶剂热法合成磁性微球，首先，称取1.350gFeCl3·6H2O，3.854g醋酸钠，0.400g柠檬酸钠溶解在装有70mL乙二醇的250mL三口圆底烧瓶中，随后，上述溶液在氩气保护下加热到300℃，并持续反应1h，形成均匀的黑红色溶液。待溶液冷却至室温，将其转移到至100mL聚四氟乙烯内衬不锈钢反应釜中，在200℃下密封、加热反应17小时。最后，通过磁分离收集的方法，以乙醇和超纯水清洗多次，最后分散至10mL乙醇中，得到黑色磁性微球待用。随后在磁性微球表面修饰PMAA壳，修饰之前，首先在其表面修饰改性聚苯乙烯(MPS)，具体操作步骤为，将40mL乙醇、10mL超纯水、1.5mL氨水及0.3g MPS添加至上述10mL磁性微球乙醇溶液中，并在60℃水浴环境下磁力震荡反应24h。最后，利用蒸馏沉淀聚合法以甲基丙烯酸(AA)、甲叉双丙烯酰胺(MBA)作为交联剂，偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，在乙腈溶剂中制备表面修饰PMAA壳的磁性微球。
(2)磁性微球-适配体制备：具有羧基表面的磁性微球和具有氨基表面的核酸适配体利用缩合反应制备得到磁性微球-适配体螯合物。具体操作步骤为：取1mL羧基化的磁性微球分散至2mL EDC水溶液中，随后，将含有1mL1μM核酸适配体的PBS溶液加入至上述溶液中混合反应12h，最终得到磁性微球-适配体捕捉探针。
(3)增强基底制备：将制备的金纳米颗粒(AuNPs)与对巯基苯胺PATP(300μL,1mM)乙醇溶液室温下反应约4h，得到Au/PATP。随后，将APTMS(600μL 1mM)逐滴加入混合溶液中，反应15min后，将5mL硅酸钠((0.54％(w/w))加入溶液中，在90℃水浴环境下反应30min，得到增强基底待用。
(4)核酸适配体互补链-增强基底制备：搅拌15分钟后，将增强基底进行离心分离，弃上层液体，获得的沉淀用乙醇和乙腈分别清洗三次，在60℃下干燥1h，随后与溶解在乙腈溶剂中的三聚氯氰(3mL，0.2M)连续搅拌反应4h。此后，将产物进行离心，弃上层液体，获得的沉淀用乙腈、超纯水、硼酸盐缓冲液(BBS)分别清洗3次。最终产物再分散在BBS溶液中(2ml，pH＝8.4)，将0.4mL核酸适配体互补链(5.6nmol/L)BBS溶液加入其中，室温下轻微震动连续反应过夜。
(5)拉曼光谱检测：首先，将制备的磁性微球-适配体与信号分子混合，37℃下连续震荡反应2h。随后，分别取200μL磁性微球-适配体/核酸适配体互补链-增强基底生物螯合物分装至一系列平行离心管中，随后，将100μL不同浓度的待检物四环素原液依次加入到上述离心管中，混合溶液37℃条件下连续震荡反应70min。以加有100μL超纯水的离心管作为对照组。反应结束后，利用磁铁进行磁性富集，同时利用拉曼光谱(785nm)在150cm-1-2000cm-1波长范围内对含有不同浓度增强基底的上清液拉曼强度进行测定。图1为检测结果：(A)为不同浓度四环素拉曼光谱；(B)为标准曲线
(6)牛奶中四环素加标回收率测定：利用加标回收结合本发明设计的检测方法实现液态牛奶样本中的四环素检测。检测前需要对样本进行预处理。首先取5ml牛奶于10℃，7000g转速下离心10min，弃去上层乳脂，将沉淀用超纯水稀释20倍，静置后将上清液用过滤器过滤，收集滤液。随后，分别在装有10mL滤液的离心管中加入不同浓度的四环素，然后取分别从每个离心管中取100μL混合液于分装有200uL检测体系的1.5mL离心管中，混合反应70min后，进行磁性分离，测定上清液拉曼光谱强度。最后采用本试验设计方法检测牛奶中四环素浓度，并与所添加的浓度作对比，结果如表1所示：
表1本发明设计方法用于牛奶样本中四环素的检测
综上，制备的牛奶中四环素表面增强拉曼光谱检测方法，当四环素存在时，影响适配体在检测体系中的结构，与适配体发生特异性识别结合，从而引起不同浓度增强基底在不同浓度四环素存在下的释放，随后对检测体系进行磁性分离，将含有磁性微球-适配体-四环素复合物吸附至底，对含有不同浓度增强基底的上清液进行拉曼信号测定，依据不同拉曼强度的标记分子特征峰图谱，实现对牛奶中四环素残留灵敏间接检测的目的；该方法适用于食品安全、环境监测等技术领域。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏大学
<120> 一种基于适配体的牛奶中四环素残留表面增强拉曼光谱检测方法
<130> 一种基于适配体的牛奶中四环素残留表面增强拉曼光谱检测方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgtacggaat tcgctagccc cccggcaggc cacggcttgg gttggtccca ctgcgcgtgg 60
atccgagctc cacgtg 76
Claims (6)
1.一种基于适配体的牛奶中四环素残留表面增强拉曼光谱检测方法，其特征在于，该方法包括如下具体步骤：
1)磁性微球制备：利用溶剂热法合成磁性微球，首先，称取1.350gFeCl3·6H2O，3.854g醋酸钠，0.400g柠檬酸钠溶解在装有70mL乙二醇的250mL三口圆底烧瓶中，随后，上述溶液在氩气保护下加热到300℃，并持续反应1h，形成均匀的黑红色溶液；待溶液冷却至室温，将其转移到至100mL聚四氟乙烯内衬不锈钢反应釜中，在200℃下密封、加热反应17小时；最后，通过磁分离收集的方法，以乙醇和超纯水清洗多次，最后分散至10mL乙醇中，得到黑色磁性微球待用；随后在磁性微球表面修饰PMAA壳，修饰之前，首先在其表面修饰改性聚苯乙烯MPS，具体操作步骤为，将40mL乙醇、10mL超纯水、1.5mL氨水及0.3g MPS添加至上述10mL磁性微球乙醇溶液中，并在60℃水浴环境下磁力震荡反应24h；最后，利用蒸馏沉淀聚合法以甲基丙烯酸AA、甲叉双丙烯酰胺MBA作为交联剂，偶氮二异丁腈AIBN为引发剂，在乙腈溶剂中制备表面修饰PMAA壳的磁性微球；
2)磁性微球-适配体制备：具有羧基表面的磁性微球和具有氨基表面的核酸适配体利用缩合反应制备得到磁性微球-适配体螯合物；具体操作步骤为：取1mL羧基化的磁性微球分散至2mL EDC水溶液中，随后，将含有1mL1μM核酸适配体的PBS溶液加入至上述溶液中混合反应12h，最终得到磁性微球-适配体捕捉探针；
3)增强基底制备：将制备的金纳米颗粒AuNPs与对巯基苯胺PATP乙醇溶液室温下反应约4h，得到Au/PATP；随后，将APTMS逐滴加入混合溶液中，反应15min后，将5mL硅酸钠加入溶液中，在90℃水浴环境下反应30min，得到增强基底待用；
4)核酸适配体互补链-增强基底制备：搅拌15分钟后，将增强基底进行离心分离，弃上层液体，获得的沉淀用乙醇和乙腈分别清洗三次，在60℃下干燥1h，随后与溶解在乙腈溶剂中的三聚氯氰连续搅拌反应4h；此后，将产物进行离心，弃上层液体，获得的沉淀用乙腈、超纯水、硼酸盐缓冲液BBS分别清洗3次；最终产物再分散在BBS溶液中，将0.4mL核酸适配体互补链BBS溶液加入其中，室温下轻微震动连续反应过夜；
5)拉曼光谱检测：首先，将制备的磁性微球-适配体与信号分子混合，37℃下连续震荡反应2h；随后，分别取200μL磁性微球-适配体/核酸适配体互补链-增强基底生物螯合物分装至一系列平行离心管中，随后，将100μL不同浓度的待检物四环素原液依次加入到上述离心管中，混合溶液37℃条件下连续震荡反应70min；以加有100μL超纯水的离心管作为对照组；反应结束后，利用磁铁进行磁性富集，同时利用拉曼光谱在150cm-1-2000cm-1波长范围内对含有不同浓度增强基底的上清液拉曼强度进行测定；
6)牛奶中四环素加标回收率测定：利用加标回收结合基于适配体的牛奶中四环素残留表面增强拉曼光谱检测方法实现液态牛奶样本中的四环素检测；检测前需要对样本进行预处理；首先取5ml牛奶于10℃，7000g转速下离心10min，弃去上层乳脂，将沉淀用超纯水稀释20倍，静置后将上清液用过滤器过滤，收集滤液；随后，分别在装有10mL滤液的离心管中加入不同浓度的四环素，然后取分别从每个离心管中取100μL混合液于分装有200uL检测体系的1.5mL离心管中，混合反应70min后，进行磁性分离，测定上清液拉曼光谱强度。
2.根据权利要求1所述的一种基于适配体的牛奶中四环素残留表面增强拉曼光谱检测方法，其特征在于，所述增强基底为修饰对巯基苯胺PATP的金包二氧化硅核壳状纳米复合材料，与常用的增强基底金纳米颗粒、银纳米颗粒、金纳米棒、银纳米棒相比，具有极强的拉曼信号增强效果，同时，标记分子对巯基苯胺PATP固定在金核及二氧化硅壳之间成功避免外界环境的干扰，提高了获取拉曼信号的稳定性及重复性。
3.根据权利要求1所述的一种基于适配体的牛奶中四环素残留表面增强拉曼光谱检测方法，其特征在于，所述核酸适配体序列为：5’-NH2-CGT ACG GAA TTC GCT AGC CCC CCGGCA GGC CAC GGC TTG GGT TGG TCC CAC TGC GCG TGG ATC CGA GCT CCA CGT G-NH2-3’。
4.根据权利要求1所述的一种基于适配体的牛奶中四环素残留表面增强拉曼光谱检测方法，其特征在于，所述的核酸适配体及四环素的特异性结合能力利用圆二色谱CD进行表征。
5.根据权利要求1所述的一种基于适配体的牛奶中四环素残留表面增强拉曼光谱检测方法，其特征在于，所述的磁性微球，由蒸馏沉淀聚合反应制备而成，具有高饱和磁化强度71.5emu/g及优良的生物相容性，有利于快速、较易的生物反应及磁性分离，此外，该磁性微球具有自由的羧基表面，使其尽可能多的与核酸适配体发生缩合反应。
6.根据权利要求1所述的一种基于适配体的牛奶中四环素残留表面增强拉曼光谱检测方法，其特征在于，所述的检测方法，标记分子对巯基苯胺PATP最佳浓度为1mM，增强基底最佳尺寸为43nm，磁性微球及核酸适配体的最佳反应时间为50min，四环素在检测体系中的最佳培养时间为70min。
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| CN102012372A (zh) * | 2010-11-10 | 2011-04-13 | 吉林大学 | 利用磁性印迹表面增强拉曼光谱技术检测药物分子的方法 |
| CN102183507A (zh) * | 2011-03-01 | 2011-09-14 | 吉林大学 | 一种长程表面等离子体激励表面增强拉曼散射的方法 |
| CN103411955A (zh) * | 2013-08-21 | 2013-11-27 | 天津大学 | 基于拉曼光谱的头孢类抗生素混合溶液的浓度检测方法 |
| CN105911042A (zh) * | 2016-06-21 | 2016-08-31 | 吉林大学 | 非标记核酸适配体荧光传感器检测四环素 |
-
2017
- 2017-01-05 CN CN201710006302.3A patent/CN106770172B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102012372A (zh) * | 2010-11-10 | 2011-04-13 | 吉林大学 | 利用磁性印迹表面增强拉曼光谱技术检测药物分子的方法 |
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| CN105911042A (zh) * | 2016-06-21 | 2016-08-31 | 吉林大学 | 非标记核酸适配体荧光传感器检测四环素 |
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| Title |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106770172A (zh) | 2017-05-31 |
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