CN106770173B - 一种用于抗生素检测的磁控适配体传感器制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于抗生素残留检测的MCNCs/PMAA磁控拉曼适配体传感器制备方法。该方法为：以制备的具有高饱和磁化率及生物相容性的磁性纳米微球MCNCs/PMAA螯合适配体作为捕获探针，包埋对巯基苯胺的Au@SiO2核壳纳米颗粒作为增强基底螯合适配体短链互补DNA作为信号分子，利用适配体技术结合表面增强拉曼光谱技术构建传感器实现抗生素残留检测研究。当抗生素存在时，影响适配体在检测体系中的结构，与适配体发生特异性识别结合，从而引起不同浓度信号分子在不同浓度抗生素存在下的释放，随后对检测体系进行磁力吸附，上清液中释放的自由信号分子可对拉曼信号进行不同程度的放大，依据不同拉曼强度的标记物拉曼特征峰图谱，实现抗生素残留灵敏间接检测的目的。

Description

一种用于抗生素检测的磁控适配体传感器制备方法
技术领域
本发明涉及一种用于抗生素残留检测的MCNCs/PMAA磁控拉曼适配体传感器制备方法，具体涉及将传感器技术、拉曼技术相结合，制备以MCNCs/PMAA磁性纳米微球螯合核酸适配体为捕捉分子，包埋对巯基苯胺(标记物)的Au@SiO2核壳纳米颗粒作为增强基底螯合适配体短链互补DNA作为信号分子，实现典型抗生素残留的快速、灵敏、有效检测研究。
背景技术
随着抗生素的广泛使用，其残留所带来的一系列问题也接踵而至，调查表明，动物性食品中残留抗生素是诱发儿童肥胖的一个重要因素，这就使得残留抗生素检测显得尤为重要。常用的抗生素残留分析方法目前主要有传统的微生物检验技术、分子生物学技术、仪器分析技术和免疫学技术。现有的这些分析方法虽各有优势，但都存在一定的局限性，或者前处理步骤复杂、时间长，或者仪器设备庞大昂贵等。因此，鉴于申请人在食品安全因子检测及拉曼光谱技术使用方面积累的良好的工作基础，本发明拟制备一种快速、灵敏、有效的传感器体系，结合拉曼光谱技术实现抗生素残留的高效检测，为开创食品安全因子检测新途径提供理论基础。
目前，用MCNCs/PMAA磁性纳米微球-适配体作为捕捉探针，cDNA-APS作为信号分子构建传感器体系对抗生素残留进行灵敏、有效检测仍未见报道。本发明作为一种新兴的抗生素残留检测方法，从一定程度上实现了影响人类食品安全因子检测的新途径开发。
发明内容
本发明的目的是提供了一种用于抗生素残留检测的MCNCs/PMAA磁控拉曼适配体传感器制备方法，其灵敏度高、可靠性强、检测速度快，实现对典型抗生素残留检测的目的，适用于食品安全、环境监测等技术领域。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案：制备适配体传感器，当抗生素存在时，影响适配体在检测体系中的结构，与适配体发生特异性结合，从而引起不同浓度信号分子在不同浓度抗生素存在下的释放，随后对检测体系进行磁力吸附，上清液中释放的自由信号分子对拉曼信号进行不同程度的放大，依据不同拉曼强度的标记物拉曼特征峰图谱，实现对痕量抗生素残留灵敏间接检测的目的；该方法适用于食品安全、环境监测等技术领域。
上述的一种用于抗生素残留检测的MCNCs/PMAA磁控拉曼适配体传感器制备方法，所述的MCNCs/PMAA纳米微球，由蒸馏沉淀聚合反应制备而成，具有高饱和磁化强度71.5emu/g及优良的生物相容性，有利于快速、较易的生物反应及磁性分离。此外，该纳米微球具有自由的羧基表面，使其尽可能多的与核酸适配体发生缩合反应生成捕捉探针。
上述的一种用于抗生素残留检测的MCNCs/PMAA磁控拉曼适配体传感器制备方法，所述的增强基底为包埋对巯基苯胺(PATP)的金包二氧化硅核壳状纳米复合材料，与常用的增强基底相比，标记物对巯基苯胺PATP固定在金核及二氧化硅壳之间成功避免外界环境的干扰，提高了获取拉曼信号的稳定性及重复性。
上述的一种用于抗生素残留检测的MCNCs/PMAA磁控拉曼适配体传感器制备方法，所述的痕量抗生素为四环素，核酸适配体序列为：5’-NH2-CGT ACG GAA TTC GCT AGC CCCCCG GCA GGC CAC GGC TTG GGT TGG TCC CAC TGC GCG TGG ATC CGA GCT CCA CGT G-NH2-3’，核酸适配体短链互补DNA为：5’-NH2-CAA CGT GCT AGC GAA-3’。
上述的一种用于抗生素残留检测的MCNCs/PMAA磁控拉曼适配体传感器制备方法，所述的核酸适配体及四环素的特异性结合能力利用圆二色谱(CD)进行表征。
上述的一种用于抗生素残留检测的MCNCs/PMAA磁控拉曼适配体传感器制备方法，所述所制备的适配体传感器，标记物对巯基苯胺PATP最佳浓度为1mM，核酸适配体短链互补DNA及增强基底的最优反应时间为24h，MCNCs/PMAA磁性纳米微球及核酸适配体的最佳反应时间为50min，四环素在适配体传感器体系中的最佳培养时间为70min。
上述的一种用于抗生素残留检测的MCNCs/PMAA磁控拉曼适配体传感器制备方法，该方法包括如下具体步骤：
1)MCNCs/PMAA磁性纳米微球制备：利用溶剂热法合成MCNCs，首先，称取1.350gFeCl3·6H2O，3.854g醋酸钠，0.400g柠檬酸钠溶解在装有70mL乙二醇的250mL三口圆底烧瓶中，随后，上述溶液在氩气保护下加热到300℃，并持续反应1h，形成均匀的黑红色溶液。待溶液冷却至室温，将其转移到至100mL聚四氟乙烯内衬不锈钢反应釜中，在200 ℃下密封、加热反应17小时。最后，通过磁分离收集的方法，以乙醇和超纯水清洗多次，最后分散至10mL乙醇中，得到黑色MCNCs纳米微球待用。随后在MCNCs表面修饰PMAA壳，修饰之前，首先在其表面修饰改性聚苯乙烯(MPS)，具体操作步骤为，将40mL乙醇、10mL超纯水、1.5mL氨水及0.3g MPS添加至上述10mL MCNCs乙醇溶液中，并在60℃水浴环境下磁力震荡反应24h。最后，利用蒸馏沉淀聚合法以甲基丙烯酸(AA)、甲叉双丙烯酰胺(MBA)作为交联剂，偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，在乙腈溶剂中制备MCNCs/PMAA磁性纳米微球。
2)MCNCs/PMAA-适配体捕捉探针制备：具有羧基表面的MCNCs/PMAA磁性纳米微球和具有氨基表面的核酸适配体利用缩合反应制备得到MCNCs/PMAA-适配体螯合物。具体操作步骤为：取1mL羧基化的MCNCs/PMAA分散至2mL EDC水溶液中，随后，将含有1mL 1μM核酸适配体的PBS溶液加入至上述溶液中混合反应12h，最终得到MCNCs/PMAA-适配体捕捉探针。
3)增强基底APS制备：将制备的金纳米颗粒(40nm)与对巯基苯胺PATP(300μL,1mM)乙醇溶液室温下反应约4h，得到Au/PATP。随后，将APTMS(600μL 1mM)逐滴加入混合溶液中，反应15min后，将5mL硅酸钠((0.54％(w/w))加入溶液中，在90℃水浴环境下反应30min，得到增强基底待用。
4)信号分子cDNA-APS制备：搅拌15分钟后，将增强基底进行离心分离，弃上层液体，获得的沉淀用乙醇和乙腈分别清洗三次，在60℃下干燥1h，随后与溶解在乙腈溶剂中的三聚氯氰(3mL，0.2M)连续搅拌反应4h。此后，将产物进行离心，弃上层液体，获得的沉淀用乙腈、超纯水、硼酸盐缓冲液(BBS)分别清洗3次。最终产物再分散在BBS溶液中(2ml，pH＝8.4)，将0.4mL cDNA(5.6nmol/L)BBS溶液加入其中，室温下轻微震动连续反应过夜。
5)基于拉曼光谱的四环素残留检测：首先，将制备的MCNCs/PMAA-aptamer捕捉探针与cDNA-APS信号分子混合，37℃下连续震荡反应2h。随后,分别取200μL MCNCs/PMAA-aptamer/cDNA-APS生物螯合物分装至一系列平行离心管中，随后，将100μL不同浓度的待检物抗生素原液依次加入到上述离心管中，混合溶液37℃条件下连续震荡反应70min。以加有100μL超纯水的离心管作为对照组。反应结束后，利用磁铁进行MCNCs/PMAA-aptamer-抗生素磁性富集，同时利用拉曼光谱(785nm)在150cm-1-2000cm-1波长范围内对含有不同浓度信号分子的上清液拉曼强度进行测定。
与现有的技术相比，本发明的优点在于：
本发明所制备的MCNCs/PMAA磁性纳米微球，由蒸馏沉淀聚合反应制备而成，具有高饱和磁化强度71.5emu/g及优良的生物相容性，有利于快速、较易的生物反应及磁性分离。此外，该纳米微球具有自由的羧基表面，使其尽可能多的与核酸适配体发生缩合反应生成捕捉探针。
本发明制备的的MCNCs/PMAA磁控拉曼适配体传感器体系用于抗生素残留检测灵敏度高，检测速度快，检测范围广，在食品安全、环境监测等技术领域广泛应用。
本发明涉及的增强基底为包埋对巯基苯胺(PATP)的金包二氧化硅核壳状纳米复合材料，与常用的增强基底相比，标记物对巯基苯胺PATP固定在金核及二氧化硅壳之间成功避免外界环境的干扰，提高了获取拉曼信号的稳定性及重复性。
本发明利用圆二色谱(CD)对核酸适配体及四环素的特异性结合能力进行表征。
附图说明
图1为磁性纳米微球表征图：(A)为磁性纳米微球XRD表征；(B)为为磁性纳米微球中红外表征；
图2为检测结果：(A)为试验检测的不同浓度四环素的拉曼光谱；(B)为标准曲线；
具体实施方式
实施实例1
为了进一步验证本发明所制备传感器对抗生素残留检测的作用，本发明实例，以四环素(tetracycline)为例，具体操作步骤如下：
(1)MCNCs/PMAA磁性纳米微球制备：利用溶剂热法合成MCNCs，首先，称取1.350gFeCl3·6H2O，3.854g醋酸钠，0.400g柠檬酸钠溶解在装有70mL乙二醇的250mL三口圆底烧瓶中，随后，上述溶液在氩气保护下加热到300℃，并持续反应1h，形成均匀的黑红色溶液。待溶液冷却至室温，将其转移到至100mL聚四氟乙烯内衬不锈钢反应釜中，在200℃下密封、加热反应17小时。最后，通过磁分离收集的方法，以乙醇和超纯水清洗多次，最后分散至10mL乙醇中，得到黑色MCNCs纳米微球待用。随后在MCNCs表面修饰PMAA壳，修饰之前，首先在其表面修饰改性聚苯乙烯(MPS)，具体操作步骤为，将40mL乙醇、10mL超纯水、1.5mL氨水及0.3g MPS添加至上述10mL MCNCs乙醇溶液中，并在60℃水浴环境下磁力震荡反应24h。最后，利用蒸馏沉淀聚合法以甲基丙烯酸(AA)、甲叉双丙烯酰胺(MBA)作为交联剂，偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，在乙腈溶剂中制备MCNCs/PMAA磁性纳米微球。图1为磁性纳米微球表征图：(A)为磁性纳米微球XRD表征；(B)为为磁性纳米微球中红外表征
(2)MCNCs/PMAA-适配体捕捉探针制备：具有羧基表面的MCNCs/PMAA磁性纳米微球和具有氨基表面的核酸适配体利用缩合反应制备得到MCNCs/PMAA-适配体螯合物。具体操作步骤为：取1mL羧基化的MCNCs/PMAA分散至2mL EDC水溶液中，随后，将含有1mL 1μM核酸适配体的PBS溶液加入至上述溶液中混合反应12h，最终得到MCNCs/PMAA-适配体捕捉探针。
(3)增强基底APS制备：将制备的金纳米颗粒(40nm)与对巯基苯胺PATP(300μL,1mM)乙醇溶液室温下反应约4h，得到Au/PATP。随后，将APTMS(600μL 1mM)逐滴加入混合溶液中，反应15min后，将5mL硅酸钠((0.54％(w/w))加入溶液中，在90℃水浴环境下反应30min，得到增强基底待用。
(4)信号分子cDNA-APS制备：搅拌15分钟后，将增强基底进行离心分离，弃上层液体，获得的沉淀用乙醇和乙腈分别清洗三次，在60℃下干燥1h，随后与溶解在乙腈溶剂中的三聚氯氰(3mL，0.2M)连续搅拌反应4h。此后，将产物进行离心，弃上层液体，获得的沉淀用乙腈、超纯水、硼酸盐缓冲液(BBS)分别清洗3次。最终产物再分散在BBS溶液中(2ml，pH＝8.4)，将0.4mL cDNA(5.6nmol/L)BBS溶液加入其中，室温下轻微震动连续反应过夜。
(5)基于拉曼光谱的四环素残留检测：MCNCs/PMAA磁控拉曼适配体传感器用于四环素残留检测原理图如图1所示，具体检测步骤为，首先，将制备的MCNCs/PMAA-aptamer捕捉探针与cDNA-APS信号分子混合，37℃下连续震荡反应2h。随后,分别取200μL MCNCs/PMAA-aptamer/cDNA-APS生物螯合物分装至一系列平行离心管中，随后，将100μL不同浓度的待检物四环素原液依次加入到上述离心管中，混合溶液37℃条件下连续震荡反应70min。以加有100μL超纯水的离心管作为对照组。反应结束后，利用磁铁进行MCNCs/PMAA-aptamer-抗生素磁性富集，同时利用拉曼光谱(785nm)在150cm-1-2000cm-1波长范围内对含有不同标记分子的上清液拉曼强度进行测定。图2(A)为试验检测的不同浓度四环素的拉曼光谱；(B)为标准曲线；
综上，本发明涉及一种用于抗生素残留检测的MCNCs/PMAA磁控拉曼适配体传感器制备方法。该方法为：以抗生素为研究对象，以制备的具有高饱和磁化率及生物相容性的磁性纳米微球MCNCs/PMAA螯合适配体(Aptamer)作为捕获探针，包埋对巯基苯胺(标记物)的Au@SiO2核壳纳米颗粒作为增强基底螯合适配体短链互补DNA作为信号分子，利用适配体技术结合表面增强拉曼光谱技术构建传感器实现典型抗生素残留的快速、灵敏、有效检测研究。制备一种MCNCs/PMAA磁控拉曼适配体传感器，当抗生素存在时，影响适配体在检测体系中的结构，与适配体发生特异性识别结合，从而引起不同浓度信号分子在不同浓度抗生素存在下的释放，随后对检测体系进行磁力吸附，上清液中释放的自由信号分子可对拉曼信号进行不同程度的放大，依据不同拉曼强度的标记物拉曼特征峰图谱，实现对痕量抗生素残留灵敏间接检测的目的；该方法适用于食品安全、环境监测等技术领域。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏大学
<120> 一种用于抗生素残留检测的MCNCs/PMAA磁控拉曼适配体传感器制备方法
<130> 一种用于抗生素残留检测的MCNCs/PMAA磁控拉曼适配体传感器制备方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgtacggaat tcgctagccc cccggcaggc cacggcttgg gttggtccca ctgcgcgtgg 60
atccgagctc cacgtg 76
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caacgtgcta gcgaa 15

Claims (5)

1.一种用于抗生素残留检测的MCNCs/PMAA磁控拉曼适配体传感器制备方法，其特征在于，该方法包括如下具体步骤：
1)MCNCs/PMAA磁性纳米微球制备：利用溶剂热法合成MCNCs，首先，称取1.350g FeCl3·6H2O，3.854g醋酸钠，0.400g柠檬酸钠溶解在装有70mL乙二醇的250mL三口圆底烧瓶中，随后，上述溶液在氩气保护下加热到300℃，并持续反应1h，形成均匀的黑红色溶液；待溶液冷却至室温，将其转移到至100mL聚四氟乙烯内衬不锈钢反应釜中，在200℃下密封、加热反应17小时；最后，通过磁分离收集的方法，以乙醇和超纯水清洗多次，最后分散至10mL乙醇中，得到黑色MCNCs纳米微球待用；随后在MCNCs表面修饰PMAA壳，修饰之前，首先在其表面修饰改性聚苯乙烯MPS，具体操作步骤为，将40mL乙醇、10mL超纯水、1.5mL氨水及0.3g MPS添加至上述10mL MCNCs乙醇溶液中，并在60℃水浴环境下磁力震荡反应24h；最后，利用蒸馏沉淀聚合法以甲基丙烯酸AA、甲叉双丙烯酰胺MBA作为交联剂，偶氮二异丁腈AIBN为引发剂，在乙腈溶剂中制备MCNCs/PMAA磁性纳米微球；
2)MCNCs/PMAA-适配体捕捉探针制备：具有羧基表面的MCNCs/PMAA磁性纳米微球和具有氨基表面的核酸适配体利用缩合反应制备得到MCNCs/PMAA-适配体螯合物；具体操作步骤为：取1mL羧基化的MCNCs/PMAA分散至2mL EDC水溶液中，随后，将含有1mL 1μM核酸适配体的PBS溶液加入至上述溶液中混合反应12h，最终得到MCNCs/PMAA-适配体捕捉探针；
3)增强基底APS制备：将制备的金纳米颗粒与对巯基苯胺PATP乙醇溶液室温下反应约4h，得到Au/PATP；随后，将APTMS逐滴加入混合溶液中，反应15min后，将5mL硅酸钠加入溶液中，在90℃水浴环境下反应30min，得到增强基底待用；
4)信号分子cDNA-APS制备：搅拌15分钟后，将增强基底进行离心分离，弃上层液体，获得的沉淀用乙醇和乙腈分别清洗三次，在60℃下干燥1h，随后与溶解在乙腈溶剂中的三聚氯氰连续搅拌反应4h；此后，将产物进行离心，弃上层液体，获得的沉淀用乙腈、超纯水、硼酸盐缓冲液BBS分别清洗3次；最终产物再分散在BBS溶液中，将0.4mL cDNA BBS溶液加入其中，室温下轻微震动连续反应过夜；
5)基于拉曼光谱的四环素残留检测：首先，将制备的MCNCs/PMAA-aptamer捕捉探针与cDNA-APS信号分子混合，37℃下连续震荡反应2h；随后,分别取200μL MCNCs/PMAA-aptamer/cDNA-APS生物螯合物分装至一系列平行离心管中，随后，将100μL不同浓度的待检物抗生素原液依次加入到上述离心管中，混合溶液37℃条件下连续震荡反应70min；以加有100μL超纯水的离心管作为对照组；反应结束后，利用磁铁进行MCNCs/PMAA-aptamer-抗生素磁性富集，同时利用拉曼光谱在150cm-1-2000cm-1波长范围内对含有不同浓度信号分子的上清液拉曼强度进行测定。
2.根据权利要求1所述的一种用于抗生素残留检测的MCNCs/PMAA磁控拉曼适配体传感器制备方法，其特征在于，所述的MCNCs/PMAA纳米微球，由蒸馏沉淀聚合反应制备而成，具有高饱和磁化强度71.5emu/g及优良的生物相容性，有利于快速、较易的生物反应及磁性分离；此外，该纳米微球具有自由的羧基表面，使其尽可能多的与核酸适配体发生缩合反应生成捕捉探针。
3.根据权利要求1所述的一种用于抗生素残留检测的MCNCs/PMAA磁控拉曼适配体传感器制备方法，其特征在于，所述的抗生素为四环素，核酸适配体序列为：5’-NH2-CGT ACGGAA TTC GCT AGC CCC CCG GCA GGC CAC GGC TTG GGT TGG TCC CAC TGC GCG TGG ATCCGA GCT CCA CGT G-NH2-3’，核酸适配体短链互补DNA为：5’-NH2-CAA CGT GCT AGC GAA-3’。
4.根据权利要求1所述的一种用于抗生素残留检测的MCNCs/PMAA磁控拉曼适配体传感器制备方法，其特征在于，所述的核酸适配体及四环素的特异性结合能力利用圆二色谱CD进行表征。
5.根据权利要求1所述的一种用于抗生素残留检测的MCNCs/PMAA磁控拉曼适配体传感器制备方法，其特征在于，所制备的适配体传感器，标记物对巯基苯胺PATP最佳浓度为1mM，核酸适配体短链互补DNA及增强基底的最优反应时间为24h，MCNCs/PMAA磁性纳米微球及核酸适配体的最佳反应时间为50min，四环素在适配体传感器体系中的最佳培养时间为70min。
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