CN116297397A - 一种基于edta驱动式纳米微胶囊sers传感体系的快速检测方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于EDTA驱动式纳米微胶囊SERS传感体系的快速检测方法及应用，属于抗生素检测技术领域，包括以下步骤：(1)适配体共轭识别诱导的三明治桥联夹心界面自组装；(2)EDTA驱动式纳米微胶囊刺激响应可控释放；(3)实际样品中抗生素的特异性高灵敏检测。本发明还提供了上述方法在肉制品抗生素检测中的应用，本发明首次合成具有有机‑无机杂化结构的多孔纳米微胶囊PEI‑CaCO3NMCs，通过优化反应配比及EDTA响应时间，调节微胶囊尺寸及孔径大小，显著提升了负载能力以及刺激响应速度，实现了高性能纳米微胶囊的可控合成，有效提高所构建生物传感器的选择性和敏感性，提高了检测准确性。
Description
技术领域
本发明属于抗生素检测技术领域，尤其涉及一种基于EDTA驱动式纳米微胶囊SERS传感体系的快速检测方法及应用。
背景技术
四环素(TTC)滥用导致耐药菌株逐渐增多，对全球经济发展和人类健康构成威胁。因此，开发一种可靠、灵敏、快速的复杂基质中TTC检测方法势在必行。近年来，表面增强拉曼光谱技术(SERS)由于其非破坏性、非侵入性和快速检测的特点而受到了广泛的关注。近年来，为了提高检测灵敏度，一些研究引入了一种新的DNA水凝胶作为响应式反应器，用于制造SERS生物传感器的“信号开启”策略。然而，成本和较低的释放速度限制了3D DNA水凝胶的可行性应用。因此，人们迫切希望引入一种新型多功能纳米材料，作为一种响应式反应器，以提高生物传感器的灵敏度，同时具有简单、低成本和便携性。
作为一种天然矿物，基于碳酸钙(CaCO3)的微胶囊可考虑用于这种生物传感器设计，因其具有高热稳定性、低氧化性、环保性质和成本效益。特别是CaCO3基微胶囊具有良好的吸附能力和易于修饰的多孔结构，这使其成为SERS生物传感器中原位包封和可控释放客体分子的高效响应反应器。同时，CaCO3基微胶囊可在pH值范围内被乙二胺四乙酸(EDTA)快速触发。
因此，如何提供一种简单、灵敏的微胶囊辅助SERS生物传感器在抗生素检测是本领域技术人员亟需解决的技术问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出了一种基于EDTA驱动式纳米微胶囊SERS传感体系的快速检测方法及应用。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
一种基于EDTA驱动式纳米微胶囊SERS传感体系的快速检测方法，包括以下步骤：
(1)适配体共轭识别诱导的三明治桥联夹心界面自组装：将磁性捕捉探针和信号探针以及抗生素标准溶液进行孵育，通过适配体特异性共轭识别作用，诱导形成三明治桥联夹心界面，磁分离之后，使用去离子水多次清洗，然后分散于PBS缓冲液中，得到溶液A；
(2)EDTA驱动式纳米微胶囊刺激响应可控释放：将EDTA标准溶液加入步骤(1)制备的溶液，震荡摇匀后反应，随后采集SERS光谱，根据不同浓度的抗生素标准液所对应的SERS强度信号特征值，绘制出TTC浓度相关标准曲线；
(3)实际样品中抗生素的特异性高灵敏检测：将食品样品加入至Na2EDTA-Mcilvaine缓冲液中，然后经TTC提取、离心、旋转蒸发、过膜、复溶，得到样品液；测定样品液的SERS强度信号特征值，根据步骤(2)所得的TTC检测标准曲线，计算食品样品中TTC的含量，以及加标回收率；
所述食品样品与Na2EDTA-Mcilvaine缓冲液添加量比为：5mg:20mL。
优选的，步骤(1)中所述磁性捕捉探针和信号探针的制备方法包括以下步骤：
S1.EDTA驱动式纳米微胶囊的制备：采用一锅共沉淀法制备四氨基苯硫酚，然后采用层层自组装技术，在碳酸钙核心层外构建PEI交联层以及适配体网络层；
S2.壳聚糖功能化磁纳米微珠的制备：在磁纳米微珠表面自组装壳聚糖层，形成壳聚糖功能化磁纳米微珠；
S3.磁性捕捉探针和信号探针构建：用戊二醛交联法通过氨基缩合作用分别在EDTA驱动式纳米微胶囊和壳聚糖功能化磁纳米微珠的表面组装适配体网络层，磁分离之后洗涤，并使用PBS定容，形成功能化磁性捕捉探针和信号探针。
有益效果：本发明合成高性能可控释放微胶囊以及高磁滞特性磁纳米微珠，并通过适配体共轭诱导的靶桥作用自组装形成三明治夹心复合体，通过引入EDTA实现了微胶囊可控溶解释放，成功制备了高性能EDTA驱动式纳米微胶囊SERS传感器，实现了对肉制品中四环素特异性高灵敏检测。
本发明中的EDTA驱动式纳米微胶囊具有独特的多孔结构承载能力大、无毒、绿色经济、生物相容性等显著性优势，经过PEI修饰能够显著提升水溶性及稳定性，并且易功能化，为信号分子探针之间的相互作用提供了更多的界面和活性位点。
本发明中的EDTA驱动式纳米微胶囊采用简单的一锅共沉淀法对4-ATP进行封装，并通过致密的PEI交联层以及适配体网络层，锁定核心层信号分子，具有优质负载效果。
其次，本发明中的EDTA驱动式纳米微胶囊具有丰富的有机配体氨基基团使PEI-CaCO3NMCs易于与各种分子和适配体材料功能化，这些特性使PEI-CaCO3NMCs成为功能化核酸适配体包覆制造生物传感器的理想载体，有效提高所构建生物传感器的选择性和敏感性，克服了介孔二氧化硅、多孔有机金属框架、水凝胶等纳米负载容器价格昂贵、制作复杂、生物相容性差等局限性，有效规避了孔径调节的难题。
此外，本发明中的磁纳米微珠能够辅助检测体系快速分离和富集，相较于修饰磁纳米微珠，在水溶性，稳定性，磁滞饱和特性等方面都有显著提升，能够显著提升分离和富集效率，简化实验操作。
优选的，步骤S1具体包括以下步骤：
将CaCl2溶液、Na2CO3溶液和4-ATP溶液混合后搅拌，然后经离心、洗涤，并储存过夜，得到CaCO3-4-ATP，然后将所述CaCO3-4-ATP与PEI溶液超声混合后离心、洗涤，分散至PBS缓冲液中，得到所述EDTA驱动式纳米微胶囊；
所述CaCl2溶液的浓度为1mol/L；
Na2CO3溶液的浓度为1mol/L；
所述CaCl2溶液、Na2CO3溶液与4-ATP溶液加入体积比为0.615mL：0.615mL：0.1mL；
所述4-ATP溶液浓度为0.5-0.8mg/mL；
所述CaCO3-4-ATP与PEI溶液的添加量之比为：2mg:2mL；
PEI溶液浓度为0.5-1％。
有益效果：本发明通过优化反应配比以及反应时间，显著提升PEI-CaCO3NMCs的水溶性，以及信号分子装载与释放效率。
优选的，步骤S3中所述信号探针的制备方法包括以下步骤：
在溶液中加入精确体积的戊二醛，并将混合物置于恒温搅拌器中，在25℃下搅拌2.0小时，以激活氨基；离心除去多余的戊二醛，加入60μL适配体(100μM)，在25℃下缓慢震荡6h，得到PEI-CaCO3NMCs-4-ATP-Apt，最后，将溶液混合物用PBS和洗涤三次，分散在500μL体积相同的缓冲溶液中，并保存在4℃的冰箱中；
所述PEI-CaCO3NMCs与适配体添加量之比为2mg:60μL；所述戊二醛体积浓度为20-30％，适配体浓度为80-120μM，孵育温度为室温，孵育时间为6～8h。
有益效果：本发明通过在PEI-CaCO3NMCs胶囊表面包覆PEI分子交联层，合成了富含丰富氨基的微胶囊，有利于适配体功能化。
优选的，步骤S2具体包括以下步骤：
将三氯化铁和乙二醇的混合物与NaAc和CS混合，然后搅拌30分钟。接下来，将其转移到反应釜中反应，然后经洗涤，得到壳聚糖功能化磁纳米微珠；
所述乙二醇、FeCl3、NaAc、CS的添加量之比为(30-50)mL∶0.82g:3.6g:0.5g；
所述反应温度为180-220℃，反应时间10-14h。
有益效果：本发明中的CS在磁纳米微珠的表面进行自组装，显著提升了材料的水溶性、稳定性以及生物相容性。
优选的，步骤S3中所述磁性捕捉探针的制备方法包括以下步骤：
将戊二醛溶液与壳聚糖功能化磁纳米微珠混合后振荡，然后用磁棒收集激活的CS-Fe3O4MNPs并洗涤，将适配体添加到激活的CS-Fe3O4MNPs中并摇床中保存12h后离心，洗涤三次后加入至PBS缓冲液中保存；
所述戊二醛溶液与壳聚糖功能化磁纳米微珠的添加量之比为1mL∶2mg；
所述戊二醛溶液浓度为20-30％。
优选的，步骤(1)中所述抗生素标准溶液磁性捕捉探针和信号探针的体积比为10.0μL∶10.0μL∶10.0μL；
所述孵育时间为30-50min。
有益效果：本发明中的CS-Fe3O4MNPs表面富含丰富的氨基，提高了适配体的包覆效率。优选的，步骤(2)中所述EDTA(pH＝7.0)浓度为0.1mol/L，体积为8-12μL；
所述反应温度为室温，反应时间为15～30min；
所述SERS光谱为200～2000cm-1。
有益效果：本发明通过EDTA与钙离子的螯合效应实现快速可控溶解释放，具有优异的将信号分子探针封装在微胶囊核心层和快速释放信号分子探针的能力。
优选的，所述适配体序列为；5’-NH2-CGTACGGAATTCGCTAGCCCCCCG GCAGGCCACGGCTTGGGTTGGTCCCACTGCGCGTGGATCCGAGCTCCACG TG-3’。
一种基于EDTA驱动式纳米微胶囊SERS传感体系的快速检测方法在肉制品检测中的应用。
优选的，所述肉制品包括猪肉。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：
1、本发明首次合成具有有机-无机杂化结构的多孔纳米微胶囊PEI-CaCO3NMCs，通过优化反应配比及EDTA响应时间，调节微胶囊尺寸及孔径大小，显著提升了负载能力以及刺激响应速度，实现了高性能纳米微胶囊的可控合成。
2、本发明中的PEI-CaCO3NMCs具有独特的多孔结构承载能力大、无毒、绿色经济、生物相容性等显著性优势，经过PEI修饰能够显著提升水溶性及稳定性，丰富的有机配体氨基基团使PEI-CaCO3NMCs易于与各种分子和适配体材料功能化，为信号分子探针之间的相互作用提供了更多的界面和活性位点。
3、本发明提供的PEI-CaCO3NMCs具有优异的将信号分子探针封装在微胶囊核心层和快速释放信号分子探针的能力，并且，本发明中的PEI-CaCO3NMCs可以作为功能化核酸适体包覆制造生物传感器的理想载体，有效提高所构建生物传感器的选择性和敏感性。
4、本发明中的磁纳米微珠能够辅助检测体系快速分离和富集，相较于修饰磁纳米微珠，在水溶性，稳定性，磁滞饱和特性等方面都有显著提升，能够显著提升分离和富集效率，简化实验操作。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1为实施例1所得PEI-CaCO3NMCs的扫描电镜图；
图2为实施例1所得CS，Fe3O4及CS-Fe3O4MNPs傅里叶中红外衍射图；
图3为实施例1中基于EDTA驱动式纳米微胶囊的靶向响应SERS传感平台的不同浓度TTC定量检测光谱图；
图4为实施例1中EDTA驱动式纳米微胶囊的靶向响应SERS检测方法的原理图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
本发明实施例中的原料均通过市售途径购买获得。
本发明实施例中的适配体序列为；5’-NH2-CGTACGGAATTCGCTAGCCCC CCGGCAGGCCACGGCTTGGGTTGGTCCCACTGCGCGTGGATCCGAGCTCC ACGTG-3’。
实施例1
一种基于EDTA驱动式纳米微胶囊SERS传感体系的快速检测方法，包括以下步骤：
(1)EDTA驱动式纳米微胶囊(PEI-CaCO3NMCs-4-ATP)的制备：
(1-1)将0.615mL CaCl2(1M)、0.615mL Na2CO3(1M)和0.1mL浓度为0.06mg/ml的4-ATP溶液混合在一起，搅拌半小时，形成的颗粒溶液，离心后用去离子水洗涤，然后在60℃下储存过夜，得到CaCO3-4-ATP；图1为所制备PEI-CaCO3NMCs的扫描电镜图，图中显示，所制备PEI-CaCO3NMCs为规则的立方体形貌，尺寸约1μm，分散度良好。
(1-2)将2mg的CaCO3-4-ATP与PEI溶液(2.0mL,1％)超声混合10.0Min，之后，将混合物离心(8000rmp,5分钟)，用超纯洗涤多次以去除多余的PEI，并分散在2mL PBS(10mM,pH7.4)中，得到PEI-CaCO3NMCs-4-ATP分散液。
(2)水热法合成壳聚糖功能化磁纳米微珠(CS-Fe3O4MNPs)
首先，将0.82g FeCl3·6H2O在强烈搅拌下溶于40mL乙二醇中直至溶液变澄清，在连续搅拌条件下加入3.6g NaAC和0.5g CS到上述溶液，持续搅拌20min。随后，将上述溶液转移至100mL反应釜中，在200℃下加热反应12小时，将所得产物用PBS缓冲液冲洗三次，得到CS-Fe3O4MNPs。
图2为实施例1所得CS，Fe3O4,及CS-Fe3O4MNPs傅里叶中红外衍射图。可以看出，未修饰的Fe3O4在3403(O-H和N-H拉伸振动)、1655(N-H弯曲)、1425(C-N拉伸振动)和1082cm-1处(C-O-C反对称拉伸)显示出特征峰。在Fe3O4上修饰CS后，在568cm-1处出现一条新的衍射峰，这与Fe-O振动有关，表明CS成功地组装到Fe3O4的表面上。
(3)磁性捕捉探针和信号探针构建：
(3-1)信号探针：在溶液中加入精确体积的戊二醛(1.0mL,25％)，并将混合物置于恒温搅拌器中，在25℃下搅拌2.0小时，以激活氨基，然后离心除去多余的戊二醛，加入60μL适配体(100μM)，在25℃下缓慢震荡6h，得到信号探针PEI-CaCO3NMCs-4-ATP-Apt。最后，将溶液混合物用PBS缓冲液洗涤三次，分散在500μL体积相同的缓冲溶液中，并保存在4℃的冰箱中。
(3-2)磁性捕捉探针将1.0mL戊二醛溶液(2.5％)与2.0mg CS-Fe3O4MNPs在25℃条件下混合振荡2小时，再用磁棒收集激活的CS-Fe3O4MNPs，用PBS缓冲液冲洗三次，将25μL的适配体添加到CS-Fe3O4MNPs中，最终溶液(1.0mL)在25℃的摇床中保存一夜后离心，将产物洗涤三次后，得到磁性捕捉探针，并将其在500μL PBS缓冲液中保存于4℃条件下。
(4)适配体共轭识别诱导的三明治桥联夹心界面自组装：
将不同浓度的TTC标准溶液(10.0μL，0.01～100ng/mL)与CS-Fe3O4MNPs-Apt溶液(10.0μL)在室温下孵卵40.0min后混合，然后经磁选，再加入10.0μL PEI-CaCO3-4-ATP-Apt，在室温下孵育40min，孵育结束后将所得产物用PBS洗涤3次，再分散到30μL的PBS溶液中。
(5)EDTA驱动式纳米微胶囊刺激响应可控释放：
加入EDTA(10.0μL,0.1M,pH＝7.0)与步骤(4)所得分散液中搅拌20.0min后，进行SERS光谱采集，由于EDTA和Ca2+的螯合作用，CaCO3微胶囊溶解后立即释放4-ATP，因此产生了强烈的“信号开启”(如图4所示)。随后在200～2000cm-1室温下测量SERS强度，根据不同浓度的TTC标准液所对应的SERS强度信号特征值，绘制出TTC浓度相关标准曲线。
图3为实施例1中基于EDTA驱动式纳米微胶囊的靶向响应SERS传感平台的不同浓度TTC定量检测光谱图。从图中可以看出，SERS强度和TTC浓度呈现明显的线性相关关系。
(6)实际样品中TTC的特异性高灵敏检测：
将绞碎、均质后的猪肉样品(5-10g)加入到Na2EDTA-Mcilvaine缓冲液(0.1M)中，然后加入至三氯乙酸(3％)以及环己烷(10-20mL)的混合液中充分搅拌得到混合液，随后将以上混合液转移到含有不同TTC浓度(1、10、100ng/mL)的离心管中。在超声半小时诱导高效提取前，对样品进行强涡流处理1.0min，最后，将溶液在4℃(5000rpm,10分钟)下离心，重复TTC提取三次，并收集上清液并将其组合成提取液。滤液经旋转蒸发器在35℃下蒸发至干燥，最终残渣溶解于10mL超纯水中，得到不同浓度的TTC溶液(100、10和1ng/mL)，随后进行SERS检测。
实际猪肉样本加标回收检测结果如下表1所示：
表1
以上，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种基于EDTA驱动式纳米微胶囊SERS传感体系的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)适配体共轭识别诱导的三明治桥联夹心界面自组装：将磁性捕捉探针和信号探针以及抗生素标准溶液进行孵育，通过适配体特异性共轭识别作用，诱导形成三明治桥联夹心界面，磁分离之后洗涤，然后分散于PBS缓冲液中，得到溶液A；
(2)EDTA驱动式纳米微胶囊刺激响应可控释放：将EDTA标准溶液加入步骤(1)制备的溶液A，震荡摇匀后反应，随后采集SERS光谱，根据不同浓度的抗生素标准液所对应的SERS强度信号特征值，绘制出TTC浓度相关标准曲线；
(3)实际样品中抗生素的特异性高灵敏检测：将食品样品加入至Na2EDTA-Mcilvaine缓冲液中，然后经TTC提取、离心、旋转蒸发、过膜、复溶，得到样品液；测定样品液的SERS强度信号特征值，根据步骤(2)所得的TTC检测标准曲线，计算食品样品中TTC的含量，以及加标回收率；
所述食品样品与Na2EDTA-Mcilvaine缓冲液添加量比为：5mg:20mL。
2.一种基于EDTA驱动式纳米微胶囊SERS传感体系的快速检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述磁性捕捉探针和信号探针的制备方法包括以下步骤：
S1.EDTA驱动式纳米微胶囊的制备：采用一锅共沉淀法制备四氨基苯硫酚，然后采用层层自组装技术，在碳酸钙核心层外构建PEI交联层以及适配体网络层；
S2.壳聚糖功能化磁纳米微珠的制备：在磁纳米微珠表面自组装壳聚糖层，形成壳聚糖功能化磁纳米微珠；
S3.磁性捕捉探针和信号探针构建：用戊二醛交联法通过氨基缩合作用分别在EDTA驱动式纳米微胶囊和壳聚糖功能化磁纳米微珠的表面组装适配体网络层，磁分离之后洗涤，并使用PBS定容，形成功能化磁性捕捉探针和信号探针。
3.根据权利要求2所述的一种基于EDTA驱动式纳米微胶囊SERS传感体系的快速检测方法，其特征在于，步骤S1具体包括以下步骤：
将CaCl2溶液、Na2CO3溶液和4-ATP溶液混合后搅拌，然后经离心、洗涤，并储存过夜，得到CaCO3-4-ATP，然后将所述CaCO3-4-ATP与PEI溶液超声混合后离心、洗涤，分散至PBS缓冲液中，得到所述EDTA驱动式纳米微胶囊；
所述CaCl2溶液的浓度为1mol/L；
Na2CO3溶液的浓度为1mol/L；
所述4-ATP溶液的浓度为0.5-0.8mg/mL；
所述CaCl2溶液、Na2CO3溶液与4-ATP溶液加入体积比为0.615mL：0.615mL：0.1mL；
所述CaCO3-4-ATP与PEI溶液的添加量之比为：2mg:2mL；
PEI溶液浓度为0.5-1％。
4.根据权利要求2或3所述的一种基于EDTA驱动式纳米微胶囊SERS传感体系的快速检测方法，其特征在于，步骤S3中所述信号探针的制备方法包括以下步骤：
在溶液中加入精确体积的戊二醛，并将混合物置于恒温搅拌器中，在25℃下搅拌2.0小时，以激活氨基；离心除去多余的戊二醛，加入60μL适配体(100μM)，在25℃下缓慢震荡6h，得到PEI-CaCO3NMCs-4-ATP-Apt，最后，将溶液混合物用PBS和洗涤三次，分散在500μL体积相同的缓冲溶液中，并保存在4℃的冰箱中；
所述PEI-CaCO3NMCs与适配体添加量之比为2mg:60μL；所述戊二醛体积浓度为20-30％，适配体浓度为80-120μM，孵育温度为室温，孵育时间为6～8h。
5.根据权利要求2所述的一种基于EDTA驱动式纳米微胶囊SERS传感体系的快速检测方法，其特征在于，步骤S2具体包括以下步骤：
将三氯化铁和乙二醇的混合物与NaAc和CS混合后搅拌30min，然后转移到反应釜中反应，再经洗涤，得到壳聚糖功能化磁纳米微珠；
所述乙二醇、FeCl3、NaAc、CS的添加量之比为(30-50)mL:0.82g:3.6g:1g；
所述反应温度为180-220℃，反应时间10-14h。
6.根据权利要求2或5所述的一种基于EDTA驱动式纳米微胶囊SERS传感体系的快速检测方法，其特征在于，步骤S3中所述磁性捕捉探针的制备方法包括以下步骤：
将戊二醛溶液与壳聚糖功能化磁纳米微珠混合后振荡，然后用磁棒收集激活的CS-Fe3O4MNPs并洗涤，将适配体添加到激活的CS-Fe3O4MNPs中并摇床中保存12h后离心，洗涤三次后加入至PBS缓冲液中保存；
所述戊二醛溶液与壳聚糖功能化磁纳米微珠的添加量之比为1mL:2mg；
所述戊二醛溶液浓度为20-30％。
7.根据权利要求1所述的一种基于EDTA驱动式纳米微胶囊SERS传感体系的快速检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述抗生素标准溶液磁性捕捉探针和信号探针的体积比为10.0μL∶10.0μL∶10.0μL；
所述孵育时间为30-50min。
8.根据权利要求1所述的一种基于EDTA驱动式纳米微胶囊SERS传感体系的快速检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述EDTA浓度为0.1M，体积为8-12μL；
所述反应温度为室温，反应时间为15～30min；
所述SERS光谱为200～2000cm-1。
9.根据权利要求1-3、5和7-8中任一项所述的一种基于EDTA驱动式纳米微胶囊SERS传感体系的快速检测方法，所述适配体序列为5’-NH2-CGTACGGAATTCGCTAGCCCCCCGGCAGGCCACGGCTTGGGTTGGT CCCACTGCGCGTGGATCCGAGCTCCACGTG-3’。
10.根据权利要求1所述的一种基于EDTA驱动式纳米微胶囊SERS传感体系的快速检测方法在肉制品抗生素检测中的应用。
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