CN109663571A - 一种磁性-金属有机框架mof材料的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种磁性‑金属有机框架MOF材料的制备方法，以无机羟基磷灰石纳米线作为支架；在羟基磷灰石纳米线表面上用磁性纳米颗粒功能化；以羟基磷灰石纳米线为模板，在mag‑HAP纳米线表面诱导组装形成Fe₃O₄的MOF纳米晶体。首先，羟基磷灰石纳米线表面具有丰富的活性位点，磁性纳米粒子直接在表面生长，避免了磁性纳米离子生长过程中的团聚。第二，磁性‑金属有机框架MOF材料具有多孔结构，孔容积大，亲水性好的特点，有助于提高富集效率和富集能力。第三，优异的超顺磁性磁响应能力简化了分离过程。本发明制备的mag‑MOF纳米纤维具有高选择性，低检测限，理想的富集回收率，优秀的富集能力以及良好的重复使用性。

Description

一种磁性-金属有机框架MOF材料的制备方法

技术领域

本发明涉及材料技术领域，尤其涉及一种磁性-金属有机框架MOF材料的制备方法。

背景技术

从复杂的生物样品中选择性捕获和鉴定靶向生物标志物，以便早期诊断疾病，这在生物医学领域是一个有吸引力和重要的话题。作为最重要的翻译后修饰物之一，蛋白质磷酸化介导一系列基本的生物学过程，如蛋白质折叠，免疫应答，信号转导和酶催化活性。磷酸化生物分子的综合分析和鉴定有助于理解生物反应过程，发现潜在的疾病的生物标志物。然而，用质谱法(MS)直接表征磷酸化多肽仍然是一个巨大的挑战，因为样品中磷酸肽的含量较低，以及收到高含量的非磷酸肽化合物的强烈信号干扰。因此，从复杂的生物样品中特异捕获磷酸肽的有效富集方法非常必要。

到目前为止，已经开发出许多策略和亲和材料以满足磷酸肽富集和鉴定的要求。最有效的方法利用磷酸盐和金属离子之间的强配位性质，如已经实现的金属氧化物亲和色谱(MOAC)和固定化金属离子亲和色谱(IMAC)。其中，一系列用不同的固定化金属离子制备的IMAC材料被应用于磷酸肽富集。这些结果表明具有大比表面积和大量结合位点的多孔IMAC材料有利于提高磷酸肽捕获效率。作为一种有前途的多孔材料，金属—有机骨架(MOFs)拥有相当大的表面积，均匀和可调的孔隙率，高的功能可调性以及丰富的活性位点。此外，由于拥有能结合不饱和金属离子与生物分子之间的可逆亲和相互作用，MOFs材料在蛋白质生物学研究中已成功应用于靶向生物分子富集。

在使用MOFs作为吸附剂对样品进行预处理的过程中，高速离心或过滤操作在分离时是不可或缺的，这不仅不方便，而且对低丰度生物分子来说可能会导致不可预料的损失和低检测灵敏度。磁性纳米粒子作为吸引人的材料之一，由于其在外部磁场作用下能做到快速响应和分离，引起了样品预处理领域的极大兴趣。到目前为止，已经开发了几种用于磷酸肽富集的磁性MOFs，例如，申请号为201510254064.9的中国专利文献报道了一种核壳型磁性金属有机骨架纳米颗粒的制备及其应用。尽管如此，由于MOF组分的比表面积较小，孔体积较小，含量较低，可能会限制富集效率和富集能力。另一方面，目前大多数磁性MOF复合材料都是仅具有核壳结构和几纳米直径的球体。此外，亲和材料多样的形态可能在一定程度上影响磷酸肽富集的富集能力和检测灵敏度。因此，具有可控和指定形态的磁性MOF材料的开发仍然能在磷酸化蛋白质组学研究中引起关注。

发明内容

本发明解决的技术问题在于提供一种磁性-金属有机框架MOF材料的制备方法，具有孔结构多，比表面积大，孔体积大，亲水性好，以及独特的磁响应能力。

有鉴于此，本发明提供了一种磁性-金属有机框架MOF材料的制备方法，包括以下步骤：在机械搅拌下将油酸和乙醇混合，然后在剧烈搅拌下依次加入CaCl₂水溶液，NaOH水溶液和NaH₂PO₄·2H₂O水溶液，转移至高压釜中，在160-200℃下反应，清洗，得到羟基磷灰石纳米线；在磁力搅拌下将所述羟基磷灰石纳米线和Fe(acac)₃分散于三甘醇中，然后转移至高压釜中，在200-240℃下反应10-20小时，清洗，得到mag-HAP纳米线；将所述mag-HAP纳米线交替分散于FeCl₃·6H₂O的乙醇溶液和1,3,5-苯三甲酸中，分别在50-70℃下保温10-20min，在每个循环中中间体以3000-5000rpm的速度离心分离，清洗，重复20-50个循环后干燥，得到磁性-金属有机框架MOF材料。

优选的，得到羟基磷灰石纳米线的步骤中，所述油酸和乙醇的重量比为8-12：10-16。

优选的，所述CaCl₂、NaOH和NaH₂PO₄·2H₂O的重量比为2-4：5-20：1-5。

优选的，所述CaCl₂水溶液、NaOH水溶液和NaH₂PO₄·2H₂O水溶液的体积比为1-5：1-5：1-3。

优选的，得到羟基磷灰石纳米线的步骤中，反应温度为180℃，反应时间为24小时。

优选的，得到mag-HAP纳米线的步骤中，所述羟基磷灰石纳米线、Fe(acac)₃和三甘醇的比例为1-5g：0.2-1g：150-300ml。

优选的，得到mag-HAP纳米线的步骤中，反应温度为220℃，反应时间为12小时。

优选的，得到磁性-金属有机框架MOF材料的步骤中，保温温度为60℃，保温时间为15min。

优选的，得到磁性-金属有机框架MOF材料的步骤中，所述FeCl₃·6H₂O的乙醇溶液和1,3,5-苯三甲酸的体积比为1：1。

优选的，得到磁性-金属有机框架MOF材料的步骤中，离心分离的速度为4000rpm，在每个循环中离心分离的时间为3分钟。

本发明提供一种磁性-金属有机框架MOF材料的制备方法，以无机羟基磷灰石纳米线作为支架；在羟基磷灰石纳米线表面上用磁性纳米颗粒功能化；然后以羟基磷灰石纳米线为模板，采用逐层方法在mag-HAP纳米线表面诱导组装形成Fe₃O₄的MOF纳米晶体。首先，羟基磷灰石纳米线表面具有丰富的活性位点，磁性纳米粒子可以直接在表面上生长，解决了MIL-100纳米晶体(典型的MOF)定向有序组装的支架和模板问题，避免了磁性纳米离子生长过程中的团聚。第二，制备的磁性-金属有机框架MOF材料具有多孔结构，比表面积大，孔容积大，亲水性好的特点，有助于提高富集效率和富集能力。第三，优异的超顺磁性磁响应能力简化了分离过程。因此，本发明制备的mag-MOF纳米纤维具有高选择性，低检测限，理想的富集回收率，优秀的富集能力以及良好的重复使用性。本发明为构建具有不同固定金属离子的多种功能MOF纳米纤维选择性捕获和识别靶向生物分子提供了一种通用策略。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的样品的TEM图像；

图2为本发明实施例1制备的样品的FTIR光谱图；

图3为本发明实施例1制备的样品的TG曲线；

图4为本发明实施例1制备的样品的XRD图谱；

图5为本发明实施例1制备的mag-MOF纳米纤维的氮吸附-解吸等温线，插图是相应的BJH孔径分布曲线；

图6为本发明实施例1制备的mag-MOF纳米纤维的数字图像；

图7为β-酪蛋白分解(0.5pmol)的MALDI-TOF MS谱图；

图8为α-酪蛋白消化物的MALDI-TOF MS谱图；

图9为不同摩尔比的β-酪蛋白分解物(0.5pmol)和BSA消化物的肽混合物的MALDI-TOF MS谱图；

图10为用不同浓度的mag-MOF纳米纤维富集后的β-酪蛋白分解产物的MALDI-TOFMS谱图；

图11为不同量的mag-MOF纳米纤维富集后的β-酪蛋白分解产物的磷酸肽(ε1)的强度；

图12为含有两个¹²CH₃标记的标准磷酸肽和用mag-MOF纳米纤维富集后的两个¹⁴CH₃标记的等量标准磷酸肽的混合物的MALDI-TOF MS谱图；

图13为未富集的脱脂牛奶消化产物的MALDI-TOF MS谱图；

图14为用mag-MOF纳米纤维富集后的产物的MALDI-TOF MS谱图；

图15为直接分析的人血清的MALDI-TOF MS谱图1；

图16为用mag，MOF纳米纤维富集后的人血清1；

图17为直接分析的人血清的MALDI-TOF MS谱图2；

图18为用mag，MOF纳米纤维富集后的人血清2。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

本发明实施例公开了一种磁性-金属有机框架MOF材料的制备方法，包括以下步骤：在机械搅拌下将油酸和乙醇混合，然后在剧烈搅拌下依次加入CaCl₂水溶液，NaOH水溶液和NaH₂PO₄·2H₂O水溶液，转移至高压釜中，在160-200℃下反应，清洗，得到羟基磷灰石纳米线；在磁力搅拌下将所述羟基磷灰石纳米线和Fe(acac)₃分散于三甘醇中，然后转移至高压釜中，在200-240℃下反应10-20小时，清洗，得到mag-HAP纳米线；将所述mag-HAP纳米线交替分散于FeCl₃·6H₂O的乙醇溶液和1,3,5-苯三甲酸中，分别在50-70℃下保温10-20min，在每个循环中中间体以3000-5000rpm的速度离心分离，清洗，重复20-50个循环后干燥，得到磁性-金属有机框架MOF材料。

作为优选方案，得到羟基磷灰石纳米线的步骤中，所述油酸和乙醇的重量比优选为8-12：10-16，更优选为10-12：12-16，更优选为10：14。所述CaCl₂、NaOH和NaH₂PO₄·2H₂O的重量比优选为2-4：5-20：1-5，更优选为2.2：10：2.8。所述CaCl₂水溶液、NaOH水溶液和NaH₂PO₄·2H₂O水溶液的体积比优选为1-5：1-5：1-3，更优选为2：2：1。反应温度优选为180℃，反应时间优选为24小时。

作为优选方案，所述得到羟基磷灰石纳米线的步骤具体为：在机械搅拌下将100gOA和140g乙醇混合在一起。在剧烈搅拌下将200mL CaCl₂(2.20g)水溶液，200mL NaOH(10.0g)水溶液和100mL NaH₂PO₄·2H₂O(2.80g)水溶液依次加入到混合物中。将混合物转移到1L聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中，并在180℃下保持24小时。自然冷却至室温后，所得产物分别用乙醇和水清洗三次。

得到mag-HAP纳米线的步骤中，所述羟基磷灰石纳米线、Fe(acac)₃和三甘醇的比例优选为1-5g：0.2-1g：150-300ml，更优选为1-3g：0.5-1g：180-300ml，更优选为1g：0.5g：180ml。反应温度优选为220℃，反应时间优选为12小时。

作为优选方案，得到mag-HAP纳米线的步骤具体为：在磁力搅拌下将1.0g羟基磷灰石纳米线和0.5g Fe(acac)₃分散在180mL TEG中。将均匀的混合物转移到六个100mL聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中，并在220℃下加热12小时。所获得的产物分别用水和乙醇清洗三次。

得到磁性-金属有机框架MOF材料的步骤中，保温温度优选为60℃，保温时间优选为15min。所述FeCl₃·6H₂O的乙醇溶液和1,3,5-苯三甲酸的体积比优选为1：1。离心分离的速度优选为4000rpm，在每个循环中离心分离的时间优选为3分钟

作为优选方案，得到磁性-金属有机框架MOF材料的步骤具体为：将400mgmag-HAP纳米线交替分散于H₃btc(40mL，10mmol L^-1)中，并在60℃下保持30min，和FeCl₃·6H₂O的乙醇溶液(40mL，10mmol L^-1)中，并在60℃下15min。在每个循环中，中间体以4000rpm的速度离心3分钟，并用乙醇清洗2次。重复30个循环后，在150℃下干燥12小时。

在本发明中，首先，羟基磷灰石(HAP)纳米线在支架上通过溶剂热反应起作用来制备。之后，将Fe₃O₄纳米颗粒固定在HAP纳米线表面以获得mag-HAP纳米线。接下来，采用逐层方法在表面组装MIL-100(Fe)纳米晶体以制造mag-MOF纳米纤维。

HAP纳米线被用作支架和模板，具有以下优点：HAP纳米线表面上有丰富的活性位点能诱导Fe₃O₄纳米颗粒的固定，并在原位集结，生长为MOF纳米晶体，避免用有机连接体进行冗杂的表面改性；纳米尺寸的直径和高纵横比的HAP纳米线有助于形成具有大的比表面积和高含量MOF组分的mag-MOF纳米纤维复合物，这一复合物可以赋予亲和材料大量结合位点并改善选择性捕获和识别低丰度的磷酸肽。

本发明开发了具有纳米线导向的磁性MOF(mag-MOF)纳米纤维的模板合成。使用表面磁性纳米颗粒功能化的无机羟基磷灰石纳米线，并用于充当MIL-100(Fe)纳米晶体的支架和指导可控组装的模板。mag-MOF纳米纤维表现出几个明显的优势。首先，羟基磷灰石纳米线在表面具有丰富的活性位点，磁性纳米粒子和MOF纳米晶体可以直接被固定在表面上，避免了使用有机粘结剂进行冗长的表面改性。第二，独特的结构和性质，例如高纵横比，大比表面积和相对高含量的MOF组分有助于提高富集效率和富集能力。第三，磁响应能力简化了分离过程。利用这些有利特性所制备出的mag-MOF纳米纤维显示出高选择性，低检测限，理想的富集回收率，优秀的富集能力以及良好的批次重复性。此外，mag-MOF纳米纤维已成功应用于从实际生物样品(包括非脂肪乳消化物和人血清)中选择性捕获和鉴定磷酸肽。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。

本发明实施例采用的原料均为市购。

化学品和材料

Aladdin Industrial Co.，Ltd(上海)生产的乙酰丙酮铁(III)(Fe(acac)₃)，1,3,5-苯三甲酸(H₃btc)和六水合氯化铁(III)(FeCl₃·6H₂O)。

购自Sigma-Aldrich(St，Louis，MO，USA)的牛血清白蛋白(BSA)，α-酪蛋白，β-酪蛋白，胰蛋白酶(TPCK处理)，二硫苏糖醇(DTT)，碘乙酰胺(IAA)，碳酸氢钠(NaHCO₃)，浓氨水溶液(NH₃·H₂O，28-30wt％)，2,5-二羟基苯甲酸(DHB)和芥子酸(SA)。

从当地的超市购买的脱脂牛奶。

上海交通大学附属第六人民医院获取的健康人的血清。Merck(Darmstadt，Germany)购买的乙腈(MeCN)，三氟乙酸(TFA)和甲酸(FA)。

购自上海爱普肽有限公司(中国上海)的标准磷酸肽(LRRApSLGGK)。

从国药集团上海化学试剂有限公司购买的油酸(OA)，氯化钙(CaCl₂)，氢氧化钠(NaOH)，无水磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)，三甘醇(TEG)中国)。

去离子水。纯水(18.4MΩcm)通过Milli-Q系统(Millipore，Milford，MA，USA)纯化。

表征和测量

透射电子显微镜(TEM)图像使用透射电子显微镜(日立H-800，日本)记录。

在Thermo Nicolet 380光谱仪(Nicolet，Wisconsin，USA)上获得傅立叶变换红外(FTIR)光谱。

热重(TG)分析在Setsys 16/18(Setaram，Caluire，法国)上进行，流动空气中加热速率为10℃·min^-1。

使用X射线衍射仪(Rigaku D/max 2550V，CuKα辐射，λ＝1.54178A)获得X射线粉末衍射(XRD)图。

氮吸附—解吸分析在77K下用V-sorb 2800P(Gold APP instruments，China)进行。

在室温下在物理性能测量系统(PPMS，USA)上测试饱和磁化曲线。

在室温下使用3μL纯水在光学接触角系统(型号SL200B)上研究水接触角。

实施例1

mag-MOF纳米纤维通过三个步骤来制备。首先，用溶剂热法合成无机羟基磷灰石纳米线作为支架。具体而言：在机械搅拌下将100g OA和140g乙醇混合在一起。在剧烈搅拌下将200mL CaCl₂(2.20g)水溶液，200mL NaOH(10.0g)水溶液和100mL NaH₂PO₄·2H₂O(2.80g)水溶液依次加入到混合物中。将混合物转移到1L聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中，并在180℃下保持24小时。自然冷却至室温后，所得的HAP纳米线产物分别用乙醇和水清洗三次。

随后，在羟基磷灰石纳米线表面上用磁性纳米颗粒官能化。具体而言：在磁力搅拌下将1.0g羟基磷灰石纳米线和0.5g Fe(acac)₃分散在180mL TEG中。将均匀的混合物转移到六个100mL聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中，并在220℃下加热12小时。所获得的mag-HAP纳米线产物分别用水和乙醇清洗三次。

此外，采用逐层方法在mag-HAP纳米线表面上形成MOF纳米晶体。具体而言：将400mg mag-HAP纳米线交替分散于H₃btc(40mL，10mmol L^-1)中，并在60℃下保持30min，和FeCl₃·6H₂O的乙醇溶液(40mL，10mmol L^-1)中，并在60℃下15min。在每个循环中，中间体以4000rpm的速度离心3分钟，并用乙醇清洗2次。重复30个循环后，将制备好的mag-MOF纳米纤维在150℃下干燥12小时。

实施例2

核壳型Fe₃O₄@MOF纳米颗粒根据现有技术进行制备。

实施例3

生物样品的制备

将1毫克α-酪蛋白或β-酪蛋白溶于1毫升NH₄HCO₃缓冲液(50mmol·L^-1，pH＝8.3)中，用质量比为1:50(w/w)的胰蛋白酶与蛋白酶催化分解，在37℃下反应18小时。另外，在含有尿素(8mol·L^-1)的1mL NH₄HCO₃缓冲液(50mmol·L^-1，pH＝8.3)中，加入2mg BSA在60℃下变性20分钟。之后，加入20μL的DTT(1mol·L^-1)，并将混合物在60℃温育1小时。随后，加入7.4mgIAA，并将混合物放于黑暗中室温下温育1小时。最后，用NH₄HCO₃缓冲液(50mmol·L^-1，pH＝8.3)将处理过的BSA溶液稀释10倍，并在37℃下用质量比为1:50(w/w)的胰蛋白酶与蛋白酶催化分解，反应18小时。

将20μL脱脂牛奶分散在1mL NH₄HCO₃缓冲液(50mmol·L^-1，pH＝8.3)中，然后将样品以15000rpm的速度离心3min。收集的上清液在沸水中变性10分钟。冷却至室温后，将上清液用40μg胰蛋白酶于37℃下催化分解18小时。另外，人血清用纯水稀释10倍，使用前储存在-20℃环境中。

实施例4

磷酸肽的选择性捕获

将200μg制备的mag-MOF纳米纤维和一定量的α-酪蛋白分解物或β-酪蛋白分解物(含或不含BSA分解物)分散在400μL的加样缓冲液(MeCN-H₂O-TFA，60:39:1，v/v/v)。在25℃下温育15分钟后，借助磁体将Mag-MOF纳米纤维与混合溶液分离，并用400μL加样缓冲液清洁两次以去除非特异性吸附的干扰物。继续用30μL洗脱缓冲液(NH₃·H₂O，10wt％)洗脱捕获的磷酸肽，并用MALDI-TOF MS直接分析。

为了处理复杂样品，将400μg制备的mag-MOF纳米纤维与人血清样品或从脱脂牛奶中提取的蛋白质的胰蛋白酶消化物在400μL加样缓冲液(MeCN-H₂O-TFA，60:39:1，v/v/v)孵育15分钟。洗涤完后，捕获的磷酸肽用30μL洗脱用缓冲液(NH₃·H₂O，10wt％)洗脱，并用MALDI-TOF MS直接分析。

实施例5

磷酸肽富集恢复测试

根据稳定同位素二甲基标记方法，用轻和重同位素分别标记等量的标准磷酸肽(LRRApSLGGK)。之后，通过上述的富集过程用mag-MOF纳米纤维富集重标记的磷酸肽。将洗脱液与相同量的轻标记磷酸肽混合，并直接用MALDI-TOFMS分析混合物。通过重标记的磷酸肽与轻标记的磷酸肽的相对强度计算标准磷酸肽的富集恢复能力。

实施例6

MALDI-TOF MS分析

在AB Sciex 5800MALDI-TOF/TOF质谱仪(AB Sciex，CA)上用反射器正模式进行基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析，在355nm处脉冲Nd/YAG发射激光。将0.5μL样品溶液和0.5μLDHB基质(溶于25mg·mL^-1的MeCN-H₂O-H₃PO₄(70:29:1，v/v/v)中)交替滴加到MALDI板上用于MS分析。对于蛋白质样品分析，使用SA基质(溶于MeCN-H₂O-FA(50:49.9:0.1，v/v/v)中的20mg mL-1)分析。

通过TEM对所制备的样品的形态进行表征，图1为本发明实施例1制备的样品的TEM图像。图1a为HAP纳米线的TEM图像，图1b为mag-HAP纳米线的数字图像，图1c为mag-MOF纳米纤维的TEM图像。插图显示相应功率采样的数字图像。在图1a中，获得的HAP样品由直径约20nm和高达数百的高纵横比纳米线组成。有趣的是，高纵横比的纳米线可以自行组成纳米线束。另外，从图1b中可以看出，与HAP纳米线的光滑表面不同，大量的小纳米颗粒被镶嵌在表面上。固定化的Fe₃O₄纳米颗粒的平均尺寸约有18nm。样品由白色变为灰黑色，进一步表明Fe₃O₄纳米颗粒已成功固定。此外，在mag-HAP纳米线上构建MOF纳米结构后，材料的颜色和形态发生了很大的变化。样品呈现黄色，预示mag-MOF纳米纤维成功形成。另外，在mag-MOF纳米纤维的TEM图像中观察到了典型的核-壳型结构。在mag-HAP纳米线的表面上引入厚度约为40nm高度均匀的MOF层涂层。应该指出的是，在这项研究中，有机连接体的表面修饰是不必要的。HAP纳米线表面具有丰富的Ca²⁺离子，有机结构单元苯-1,3,5-三羧酸可以与固有的Ca²⁺离子螯合以用于之后的LbL过程。在其他MOF复合材料的制备过程中，有机连接体的第一次表面改性是不可或缺的一步。相比之下，本研究提出的方法更方便，更通用且成本更低。

FTIR光谱学用于检查HAP纳米线，mag-HAP纳米线和mag-MOF纳米纤维的化学结构。图2为本发明实施例1制备的样品的FTIR光谱图，(i)HAP纳米线，(ii)mag-HAP纳米线，(iii)mag-MOF纳米纤维。如图2所示，在HAP纳米线的红外光谱中可以观察到PO₄ ^3-(1097，1030，962，604和561cm^-1)，吸附水(3428和1635cm^-1)和羟基(3572cm^-1)的特征吸收峰。但由于Fe-O特有的谱带吸收峰(560cm^-1)²⁶与PO₄ ^3-基团的吸收峰重叠，因此mag-MOF纳米线的FTIR光谱有轻微的变化。此外，mag-MOF纳米纤维的FTIR光谱出现了几个新的峰。在1718cm^-1处的吸收峰对应于羧基中C＝O的伸缩振动。此外，1575，1448和1383cm^-1处的吸收带是苯环的伸缩振动。所有这些结果都表明了mag-HAP纳米纤维的形成。

通过TG分析调查制备的样品的化学组分，图3为本发明实施例1制备的样品的TG曲线，(i)HAP纳米线，(ii)mag-HAP纳米线，(iii)mag-MOF纳米纤维。mag-MOF纳米纤维中6.86wt％的重量损失属于吸附水。相比之下，计算得到mag-MOF纳米纤维分解的重量损失为21.01wt％，进一步证明了mag-MOF纳米线上MOF的形成。失重值高于其他磁性MOF复合材料，表明所制备的mag-MOF纳米纤维中MOF组分的含量高于其他磁性MOF复合材料。

使用粉末XRD分析研究所制备的样品的晶体结构，图4为本发明实施例1制备的样品的XRD图谱，(i)HAP纳米线，(ii)mag-HAP纳米线，(iii)mag-MOF纳米纤维。图4中HAP纳米线的XRD图谱中的衍射峰可以被索引到羟基磷灰石的标准数据(JCPDS no.09-0432)。另外，在2θ＝35.4°处用菱形标记的衍射峰相对增强的强度相当于Fe₃O₄纳米颗粒的(311)晶面。此外，在2θ＝10.3°处用星号标记的低衍射峰是由于MIL-100(Fe)的(428)晶面。这些结果表明，制备的纳米纤维是由HAP，Fe₃O₄和MIL-100(Fe)组成的。

测定氮吸附-解吸等温线以表征所制备的样品的多孔结构，图5为本发明实施例1制备的mag-MOF纳米纤维的氮吸附-解吸等温线，插图是相应的BJH孔径分布曲线。HAP纳米线和mag-HAP纳米线的Brunauer-Emmett-Teller(BET)比表面积经测得分别为27.9和34.0m²·g^-1。相比之下，mag-MOF纳米纤维具有较大的BET比表面积，为403.6m²·g^-1。mag-MOF纳米纤维的孔体积计算为2.14cm3·g^-1。根据Barrett-Joyner-Halenda(BJH)孔径分布曲线，mag-MOF纳米纤维展现出几种中孔和大孔。中孔孔径(3.36nm)来源于MOF纳米结构，而相对较大的中孔孔径(40.3nm)和大孔径(63.4，79.9和169.8nm)可能源自mag-MOF纳米纤维的自组装。mag-MOF纳米纤维的BET比表面积值高于其他磁性MOFs。更重要的是，亲和材料的大BET比表面积和孔体积将拥有丰富的结合位点，快速的运输和目标的扩散能力，这对于高效捕获具有理想性能的生物目标是极其重要的。

制备的mag-MOF纳米纤维的另一个优点是独特的磁响应性和良好的亲水性。磁滞曲线显示这两种磁性复合材料在室温下没有明显的剩磁或矫顽力，这表明它们都具有超顺磁性。

图6为本发明实施例1制备的mag-MOF纳米纤维的数字图像，(i)分散的水溶液，(ii)磁分离,(iii)水接触角。制备的mag-MOF纳米纤维具有良好的亲水性，水接触角为0°，在水中具有优异的分散性。此外，由于Fe₃O₄成分具有独特的磁响应，当施加外部磁场时，制备的mag-MOF纳米纤维可在20分钟内迅速与水溶液分离。

mag-MOF纳米纤维在从标准蛋白质分解物中选择性捕获磷酸肽中的应用

由于制备的mag-MOF纳米纤维具有独特的多孔结构，较大的比表面积，较大的孔体积，较强的磁性以及不饱和铁与磷酸根基团之间的特异性亲和性能，因此被用作磷酸肽选择性捕获的亲和探针。简言之，就是将制备的mag-MOF纳米纤维在室温下与蛋白质分解物一起温育。磁力分离和洗涤操作后，捕获的磷酸肽被洗脱，然后用MALDI-TOF MS直接分析。

标准磷酸化蛋白(β-酪蛋白)分解首先用于评估mag-MOF纳米纤维的富集性能。图7为β-酪蛋白分解(0.5pmol)的MALDI-TOF MS谱图，(a)直接分析，(b)由mag-MOF纳米纤维富集，(c)由Fe₃O₄@MOF纳米颗粒富集；去磷酸化肽用#符号标记。从图7a中可以看出，对于β-酪蛋白分解的直接分析，仅能检测到一个磷酸肽(β1)峰，且MS信号强度差，信噪比(S/N)低，而其他磷酸肽的峰被丰富的非磷酸肽严重压制。相反，mag-MOF纳米纤维富集后，非磷肽多肽峰的MS信号明显消失，三个靶向磷酸肽(β1，β2和β3)及其脱磷酸化的肽可以清楚地检测到它们具有很强的MS信号强度和很高的S/N比(图7b)。为了比较，Fe₃O₄@MOF纳米颗粒也被用来捕获磷酸肽。然而，三种鉴定的磷酸肽(β1，β2和β3)表现出相对较低的S/N比。例如，分别在mag-MOF纳米纤维和Fe₃O₄@MOF纳米颗粒富集后，MS的谱图中S/N比计算得4425和3069。mag-MOF纳米纤维表现出更优异的捕获性能。这种结果可以获益于大比表面积，大孔体积，较高含量的MOF组分以及大量用于选择性富集磷酸肽的结合位点。

为了进一步研究mag-MOF纳米纤维对磷酸肽的特异性富集能力，我们采用了另一种标准磷酸化蛋白(α-酪蛋白)分解物。图8为α-酪蛋白消化物的MALDI-TOF MS谱图，(a)直接分析，(b)由mag-MOF纳米纤维富集，(c)由Fe₃O₄@MOF微球体富集；去磷酸化的肽用#符号标记。在对α-酪蛋白分解物的直接分析(图8a)中可以看到其MS谱是由具有较高MS信号强度的非磷酸肽峰主导的，并且只能检测到一个磷酸肽(α7)峰。幸运的是，通过由制备所得的mag-MOF纳米纤维(图6b)或Fe₃O₄@MOF纳米颗粒(图8c)富集后，非磷酸肽的峰被有效去除，具有高MS信号强度和S/N比的磷酸肽峰主导了光谱。mag-MOF纳米纤维的富集能力优于Fe₃O₄@MOF纳米颗粒。例如，在mag-MOF纳米纤维和Fe₃O₄@MOF纳米颗粒富集后，测得质谱中α7的S/N比值分别为3307和2446。本发明制备的mag-MOF纳米纤维对磷酸肽具有优异的富集特异性。

mag-MOF纳米纤维富集磷酸肽的高选择性在丰富的非磷酸肽干扰下进一步检验。使用β-酪蛋白分解产物和BSA分解产物的混合物作为测试样品。图9为不同摩尔比的β-酪蛋白分解物(0.5pmol)和BSA消化物的肽混合物的MALDI-TOF MS谱图，(a)以1:100的摩尔比直接分析；(b，c)用mag-MOF纳米纤维富集后，分别分析1：100和1：500的摩尔比。去磷酸化的肽用#符号标记。如图9a所示，当β-酪蛋白和BSA的摩尔比为1：100时，未检测到磷酸肽峰。幸运的是，经mag-MOF纳米纤维富集后，检测到三种靶向磷酸肽和去磷酸肽的MS信号强度和S/N比增强了(图9b)。即使β-酪蛋白和BSA的摩尔比提高到1：500，三种靶向磷酸肽和去磷酸肽仍然可以在干净的背景下被明显识别出来(图9c)。显然，这一结果表明，mag-MOF纳米纤维可以从一种复杂的肽混合物中特异性捕获低丰度的磷酸肽。

mag-MOF纳米纤维在磷酸肽富集中的检测限，富集回收率，富集能力和批次间重复性的研究

由于复杂生物样品中靶向生物分子的浓度可能非常低，因此检测灵敏度是一个关键的评估参数。用mag-MOF纳米纤维富集三种不同浓度的β-酪蛋白分解产物，并分别用MALDI-TOF MS分析洗出液。图10为用不同浓度的mag-MOF纳米纤维富集后的β-酪蛋白分解产物的MALDI-TOF MS谱图，(a)50fmol(0.5μL)，(b)5fmol(0.5μL)，(c)0.5fmol(0.5μL)；去磷酸化的肽用#符号标记。从图10a中可以看出，当使用50fmol的β-酪蛋白分解产物时，可以清楚地鉴定出三个靶向的磷酸肽峰，其中最高的S/N比为904.1(β1)。即使当β-酪蛋白分解产物的总量减少到0.5fmol时(图10c)，仍然可以在S/N比为19.7的情况下鉴定出一个磷酸肽(β1)峰。所得检测灵敏度优于许多IMAC和OMCA材料，如Fe₃O₄@polydopamine-Ti⁴⁺(2fmol)，介孔γ-Fe₂O₃(50fmol)，骨状GdF₃(80fmol)，和石墨烯@polydopamine@TiO₂(5fmol)。检测灵敏度高可能是由于其具有较大的比表面积，较高的MOF组分含量，大量的Fe³⁺离子，特异性亲和力的相互作用，良好的亲水性以及mag-MOF纳米纤维独特的磁性。这一结果表明，制备所得的mag-MOF纳米纤维可用于低浓度磷酸肽的检测和鉴定。

使用同位素二甲基标记方法评估mag-MOF纳米纤维对磷酸肽的富集恢复率。通过富集的标准磷酸肽(重同位素标记的磷酸肽)的MS信号强度除以未富集的标准磷酸肽(轻同位素标记的磷酸肽)的MS信号强度计算富集恢复率。图11为不同量的mag-MOF纳米纤维富集后的β-酪蛋白分解产物的磷酸肽(ε1)的强度。图12为含有两个¹²CH₃标记的标准磷酸肽和用mag-MOF纳米纤维富集后的两个¹⁴CH₃标记的等量标准磷酸肽的混合物的MALDI-TOF MS谱图。如图11所示，mag-MOF纳米纤维对磷酸肽的富集回收率高达87.79％。该值略高于其他亲和材料，如Fe₃O₄@MOF纳米粒子(84.47％)，³³Fe₃O₄@SiO₂@(HA/CS)₁₀-Ti⁴⁺(85.45％)，石墨烯@polydopamine@TiO₂(86.70％)，和Fe₃O₄@polydopamine-Nb⁵⁺(60％)。

同时mag-MOF纳米纤维对磷酸肽的富集能力也进行了研究。采用不同质量的mag-MOF纳米纤维(4-32μg)来富集相同质量的β-酪蛋白分解产物(1.5μg)。图12中记录了mag-MOF纳米纤维的量对所选磷酸肽(β1)的MS信号强度的影响。当β1的MS信号强度达到最大值时，几乎所有的磷酸肽都结合到材料上。mag-MOF纳米纤维的结合容量计算为93.8mg·g^-1。这些结果表明，制备的材料上的多孔结构，大的比表面积，高含量的MOF组分和大量的Fe³⁺离子极大地提高了mag-MOF纳米纤维对磷酸肽的富集能力。

对mag-MOF纳米纤维的批次间重复性也做了研究。将三批准备好的mag-MOF纳米纤维分别应用于β-酪蛋白分解产物的选择性捕获，三种靶向磷酸肽峰高的RSD值。RSD计算结果低于10％。这一结果表明mag-MOF纳米纤维对于磷酸肽富集具有良好的批次间重复性。

mag-MOF纳米纤维在从实际生物样品中选择性捕获磷酸肽中的应用

受上述实验结果的鼓舞，mag-MOF纳米纤维进一步用于从实际生物样品中选择性捕获和鉴定低丰度的磷酸肽。图13为未富集的脱脂牛奶消化产物的MALDI-TOF MS谱图；图14为用mag-MOF纳米纤维富集后的产物的MALDI-TOF MS谱图图15为直接分析的人血清的MALDI-TOF MS谱图1；图16为用mag，MOF纳米纤维富集后的人血清1；图17为直接分析的人血清的MALDI-TOF MS谱图2；图18为用mag，MOF纳米纤维富集后的人血清2。对脱脂牛奶的消化产物的直接分析，如图13所示，非磷酸肽主导MS谱，因此几乎没有观察到磷酸肽峰。幸运的是，经mag-MOF纳米纤维富集后，明显观察到9个磷酸肽峰以及具有相对高MS信号强度的去磷酸化肽。

类似地，对于稀释的人血清样品，如图15所示，由于大量非磷酸肽和高盐含量的干扰，没有检测到磷酸肽峰。相反，4种磷酸肽清晰地检测到高的MS信号强度(图16)。另一方面，人血清含有几种高丰度蛋白质，如白蛋白和免疫球蛋白。在图17中，MS谱中出现人血清白蛋白(67KDa)的三个峰。富集后，这些峰在干净的背景下消失(图18)，这表明了mag-MOF纳米纤维在大量非磷酸肽和蛋白质的干扰下对磷酸肽的高富集选择性。综上所述，所有这些结果表明所制备的mag-MOF纳米纤维具有实际应用能力，可用于从复杂的实际生物样品中选择性捕获和鉴定低丰度磷酸肽。

本发明实施例中，一种具有多孔结构，较大的比表面积，较大的孔体积，良好的亲水性和独特的磁响应性能的新型磁性金属-有机框架(mag-MOF)纳米纤维成功地由纳米线定向模板组装完成了。本发明无需用有机连接体进行额外的表面改性，就可以方便地实现磁性纳米粒子的固定化和MOF纳米晶体在无机纳米线表面上的形成。此外，在从标准蛋白质分解产物和实际生物混合物中捕获和鉴定低丰度磷酸肽的实验中，mag-MOF纳米纤维被证明具有高选择性，低检测限，高富集能力，理想的富集恢复率，优秀的批次间可重复性以及实际可行的应用。可以相信mag-MOF纳米纤维可以成为从复杂生物样品中捕获磷酸肽的潜在的候选试剂。此外，这项研究可以为设计和制备具有不同的固定化金属离子的功能性MOF纳米纤维，从而用于选择性提取和识别靶向生物分子提供新思路。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种磁性-金属有机框架MOF材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

在机械搅拌下将油酸和乙醇混合，然后在剧烈搅拌下依次加入CaCl₂水溶液，NaOH水溶液和NaH₂PO₄·2H₂O水溶液，转移至高压釜中，在160-200℃下反应，清洗，得到羟基磷灰石纳米线；

在磁力搅拌下将所述羟基磷灰石纳米线和Fe(acac)₃分散于三甘醇中，然后转移至高压釜中，在200-240℃下反应10-20小时，清洗，得到mag-HAP纳米线；

将所述mag-HAP纳米线交替分散于FeCl₃·6H₂O的乙醇溶液和1,3,5-苯三甲酸中，分别在50-70℃下保温10-20min，在每个循环中间体以3000-5000rpm的速度离心分离，清洗，重复20-50个循环后干燥，得到磁性-金属有机框架MOF材料。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，得到羟基磷灰石纳米线的步骤中，所述油酸和乙醇的重量比为8-12：10-16。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述CaCl₂、NaOH和NaH₂PO₄·2H₂O的重量比为2-4：5-20：1-5。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述CaCl₂水溶液、NaOH水溶液和NaH₂PO₄·2H₂O水溶液的体积比为1-5：1-5：1-3。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，得到羟基磷灰石纳米线的步骤中，反应温度为180℃，反应时间为24小时。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，得到mag-HAP纳米线的步骤中，所述羟基磷灰石纳米线、Fe(acac)₃和三甘醇的比例为1-5g：0.2-1g：150-300ml。

7.根据权利要求1-6任意一项所述的制备方法，其特征在于，得到mag-HAP纳米线的步骤中，反应温度为220℃，反应时间为12小时。

8.根据权利要求1-6任意一项所述的制备方法，其特征在于，得到磁性-金属有机框架MOF材料的步骤中，保温温度为60℃，保温时间为15min。

9.根据权利要求1-6任意一项所述的制备方法，其特征在于，得到磁性-金属有机框架MOF材料的步骤中，所述FeCl₃·6H₂O的乙醇溶液和1,3,5-苯三甲酸的体积比为1：1。

10.根据权利要求1-6任意一项所述的制备方法，其特征在于，得到磁性-金属有机框架MOF材料的步骤中，离心分离的速度为4000rpm，在每个循环中离心分离的时间为3分钟。