CN108918873A - 一种基于PS@Au双重抑制ZnCdS的光电化学凝血酶适配体传感器的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于PS@Au双重抑制ZnCdS的光电化学凝血酶适配体传感器的制备方法及应用,属于光电化学传感器领域。利用简单的水热法合成锌、镉共掺杂硫化物ZnCdS纳米晶,其粗糙的表面和较大的比表面积,大大增加了ZnCdS的负载能力,增强其可见光吸收能力。以ZnCdS作为基底材料,以PS@Au作为二抗标记物,PS@Au具有良好的绝缘性,阻碍了光生电子的转移,而且PS@Au与ZnCdS间对可见光的吸收竞争也会有效地降低光电流信号,这双重抑制作用有效地提高了传感器的灵敏度,降低了传感器的检测限。再结合适配体优异的选择性,实现了对凝血酶适配体的高灵敏检测,这对凝血酶的分析检测具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于新型功能纳米材料、免疫分析和光电化学传感器领域,提供了一种基于PS@Au双重抑制ZnCdS的光电化学凝血酶适配体传感器的制备方法及应用。
背景技术
凝血酶是存在于哺乳动物体内一种极其重要的蛋白质,具有类似于激素的性质。它不仅对凝血过程有加速和巩固作用,还对血栓有抑制作用且可以使血小板活化,因此凝血酶在心血管疾病诊断与治疗中的作用非常重要。血液中凝血酶在浓度为pmol·L-1范围内即可进行与疾病有关的诊断,如血管生成、肿瘤生长以及转移的诊断。因此,建立具有高灵敏度、操作简便的凝血酶检测方法,在医学和临床上具有深远的影响。
目前对于凝血酶的检测方法有石英谐振器压电法、荧光标记法、表面增强拉曼光谱法等。然而,这些检测方法存在仪器昂贵、操作复杂,易受环境影响,检测灵敏度不高等问题。
本发明提供了一种快速、简便、灵敏度和选择性高的光电化学适配体传感器检测方法,具有时时在线检测,仪器操作便捷,特异性高,检测范围宽等优点。适配体是一类具有DNA或RNA功能的寡聚核苷酸,对蛋白质、小分子物质以及细胞等各种靶分子具有高度的亲和力和特异性。由于它们优异的温度稳定性、保存时间长、可以在指定的位置与不同的目标分子进行结合,包括有毒的以及弱免疫原性的目标物,并且不影响其生物活性,适配体已发展成一种非常有潜力的抗体替代物。其中,以光电化学检测方法为基础的适配体生物传感器由于其高灵敏度和易检测性,在小分子与蛋白质检测领域中前景广阔。
本发明成功构建了在可见光激发下检测凝血酶的光电化学凝血酶适配体传感器。该适配体传感器以锌、镉共掺杂硫化物ZnCdS纳米晶为基底,其优良的导电性和大的表面积能有效减小背景信号。氨基化的聚苯乙烯微球负载金纳米粒子PS@Au作为二抗标记物,抑制了光生电子的转移,极大地降低光电流信号。该光电化学凝血酶适配体传感器具有低成本、高灵敏、特异性好、检测快速、制备过程简单等优点,在可见光区域实现了实现对凝血酶的超灵敏检测,有效克服了目前凝血酶检测方法的不足。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种锌、镉共掺杂硫化物ZnCdS纳米晶的制备方法。
本发明的目的之二是成功合成氨基化的聚苯乙烯微球负载金纳米粒子PS@Au,以此作为二抗标记物,构建夹心型光电化学凝血酶适配体传感器。
本发明的目的之三是提供了一种基于PS@Au双重抑制ZnCdS的光电化学凝血酶适配体传感器的制备方法及应用,实现了对凝血酶的超灵敏检测。
本发明的技术方案如下:
1. 一种基于PS@Au双重抑制ZnCdS的光电化学凝血酶适配体传感器的制备方法及应用,所述的光电化学凝血酶适配体传感器由ITO工作电极、锌、镉共掺杂硫化物ZnCdS纳米晶、凝血酶适配体、牛血清白蛋白、凝血酶、氨基化的聚苯乙烯微球负载金纳米粒子的二抗孵化物PS@Au-TBA组成;
其特征在于,所述的制备方法包括以下制备步骤:
一、ZnCdS的制备;
二、PS@Au-TBA的制备;
三、光电化学凝血酶适配体传感器的制备;
其中,步骤一制备ZnCdS的具体步骤为:
称取1 ~ 3 g Zn(Ac)2·2H2O和1 ~ 3 g Cd(NO3)2·4H2O于圆底烧瓶中,加入20 ~ 40mL超纯水和1 ~ 2 mL氨水,再将5 ~ 10 mL离子液缓慢滴入圆底烧瓶中,将上述混合溶液超声30 ~ 40 min,另取2 ~ 4 g硫化钠溶于8 ~ 16 mL超纯水中并超声30 ~ 40 min,超声后将其在高速搅拌下滴加到圆底烧瓶中,反应1 ~ 2 h后溶液变为黄色,然后把混合液转移到50 ~ 100 mL反应釜中,在100 ~ 150℃下煅烧6 ~ 9 h,将产物用超纯水和无水乙醇各洗涤3次,并在90℃真空干燥箱中干燥10 ~ 12 h小时,然后使产物自然冷却至室温,得到黄色的锌、镉共掺杂硫化物ZnCdS纳米晶,将其溶于超纯水中,得到ZnCdS悬浮液;
所述的离子液为1-己基-3-甲基-咪唑六氟磷酸盐溶液;
其中,步骤二制备PS@Au-TBA的具体步骤为:
取0.01 ~ 0.02 g柠檬酸钠溶于40 ~ 80 mL超纯水中,然后依次加入2 ~ 4 mL、5 ~ 7mmol·L-1 的HAuCl4和200 ~ 400 µL氨基聚苯乙烯微球PS并搅拌5 ~ 10 min,然后在搅拌的条件下将溶液加热煮沸并反应15 ~ 30 min,待冷却至室温后离心并用超纯水洗涤2 ~ 3次,将得到的沉淀重新分散在50 ~ 100 µL超纯水中,逐滴滴加2 ~ 4 mL巯基化凝血酶适配体,边滴加边摇荡,混匀后将该溶液置于4℃下恒温震荡孵化12 ~ 14 h,再加入1 ~ 3 mL的BSA溶液,室温下震荡1 ~ 1.5 h用于封闭非特异性位点,制得PS@Au-TBA,并将其置于4℃冰箱中冷藏备用;
其中,步骤三制备光电化学凝血酶适配体传感器的具体步骤为:
(a)将氧化铟锡ITO电极切割至2.5 cm × 0.8 cm大小,依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗30 ~ 40 min,用氮气吹干后,将8 ~ 10 µL的ZnCdS悬浮液修饰到ITO电极上,室温下晾干,然后在400 ~ 500℃马弗炉中煅烧30 ~ 40 min,取出后自然冷却至室温,得到ITO/ZnCdS电极;
(b)在步骤(a)中得到的电极表面修饰4 ~ 8 μL浓度为 5 ~ 8 μmol·L-1的羧基化凝血酶适配体,在室温下反应1 ~ 2 h,使得凝血酶适配体的羧基和ZnCdS复合材料中Zn与Cd原子配位结合,再用超纯水洗涤去除未结合上的凝血酶适配体,4℃冰箱中晾干;
(c)在步骤(b)中得到的电极表面修饰4 ~ 8 μL的1 ~ 1.5 %牛血清蛋白溶液以封闭非特异性结合位点,室温下反应1 ~ 1.5 h,用超纯水洗涤,4℃冰箱中晾干;
(d)在步骤(c)中得到的电极表面滴加4 ~ 8 μL不同浓度的凝血酶溶液,15℃环境下孵化1 ~ 1.5 h,通过酶与适配体特异性识别免疫反应将其固定在电极表面,再用超纯水清洗多余的凝血酶,4℃冰箱中晾干;
(e)在步骤(d)中得到的电极表面滴涂4 ~ 8 µL PS@Au-TBA,15℃环境下孵化1 ~ 1.5h,通过氨基与羧基的结合将其固定在电极表面,再用超纯水清洗,4℃冰箱中晾干,即制得光电化学凝血酶适配体传感器。
2. 所制备的光电化学凝血酶适配体传感器的应用,其特征在于,包括如下应用步骤:
a. 标准溶液配制:配制一组包括空白标样在内的不同浓度的凝血酶标准溶液;
b. 工作电极修饰:将所制备的光电化学凝血酶适配体传感器作为工作电极,将步骤a中配制的不同浓度的凝血酶标准溶液分别滴涂到工作电极上;
c. 工作曲线绘制:以饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为辅助电极,与步骤b所修饰好的工作电极组成三电极体系,在PBS缓冲溶液中进行测试;采用i-t测试手段对分析物进行检测,设置电压为0 V,运行时间100 s,激发光源为LED灯;检测对不同浓度的凝血酶标准溶液产生的光电流强度,绘制工作曲线;含有不同浓度的凝血酶标准溶液的光电流强度记为I i,I i与凝血酶标准溶液浓度c的对数之间成线性关系,绘制I i - logc工作曲线;
d. 凝血酶的检测:用待测的人体血清样品代替步骤b中的凝血酶标准溶液,按照步骤b和c中的方法进行检测,根据响应光电流强度I和工作曲线,得到待测样品中凝血酶的含量;
所述的PBS缓冲溶液为10 mL ~ 15 mL、pH为5.0 ~ 8.0的含0.1 mol/L抗坏血酸的磷酸盐缓冲溶液。
本发明的有益成果
(1)本发明通过新的合成发法,成功制备ZnCdS纳米晶。ZnCdS纳米晶的表面多孔结构可以促进可见光的吸收,加速电子空穴对的分离并增加其导电性。以ZnCdS为基底,其粗糙的表面和较大的比表面积,大大增加了ZnCdS的负载能力,而且ZnCdS优良的导电性能有效减小背景信号,有利于光电化学凝血酶适配体传感器的分析检测。
(2)本发明成功合成PS@Au,PS微球球形度高,尺寸较均匀,单分散性能良好,使得负载的金纳米粒子分散均匀,增强了传感器的稳定性,而且Au与巯基化的凝血酶适配体以金硫键结合,有利于适配体的稳定结合。以PS@Au作为二抗标记物,其良好的绝缘性阻碍了光生电子的转移,而且PS@Au与ZnCdS间对可见光的吸收竞争也会有效地降低光电流信号,这双重抑制作用有效地提高了传感器的灵敏度,降低了传感器的检测限。
(3)本发明成功构建了一种基于PS@Au双重抑制ZnCdS的光电化学凝血酶适配体传感器,其操作简单、信号响应范围宽、检测限低,实现了对凝血酶适配体的高灵敏检测。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明,但不限于此。
实施例1 制备ZnCdS的具体步骤为:
称取1 g Zn(Ac)2·2H2O和1.5 g Cd(NO3)2·4H2O于圆底烧瓶中,加入20 mL超纯水和1mL氨水,再将5 mL离子液缓慢滴入圆底烧瓶中,将上述混合溶液超声30 min,另取2 g硫化钠溶于8 mL超纯水中并超声30 min,超声后将其在高速搅拌下滴加到圆底烧瓶中,反应1 h后溶液变为黄色,然后把混合液转移到50 mL反应釜中,在100℃下煅烧8 h,将产物用超纯水和无水乙醇各洗涤3次,并在90℃真空干燥箱中干燥10 h小时,然后使产物自然冷却至室温,得到黄色的锌、镉共掺杂硫化物ZnCdS纳米晶,将其溶于超纯水中,得到ZnCdS悬浮液;
所述的离子液为1-己基-3-甲基-咪唑六氟磷酸盐溶液。
实施例2制备ZnCdS的具体步骤为:
称取2 g Zn(Ac)2·2H2O和3 g Cd(NO3)2·4H2O于圆底烧瓶中,加入40 mL超纯水和2mL氨水,再将10 mL离子液缓慢滴入圆底烧瓶中,将上述混合溶液超声40 min,另取4 g硫化钠溶于16 mL超纯水中并超声40 min,超声后将其在高速搅拌下滴加到圆底烧瓶中,反应1.5 h后溶液变为黄色,然后把混合液转移到100 mL反应釜中,在120℃下煅烧8 h,将产物用超纯水和无水乙醇各洗涤3次,并在90℃真空干燥箱中干燥12 h小时,然后使产物自然冷却至室温,得到黄色的锌、镉共掺杂硫化物ZnCdS纳米晶,将其溶于超纯水中,得到ZnCdS悬浮液;
所述的离子液为1-己基-3-甲基-咪唑六氟磷酸盐溶液。
实施例3制备ZnCdS的具体步骤为:
称取1 g Zn(Ac)2·2H2O和1.5 g Cd(NO3)2·4H2O于圆底烧瓶中,加入20 mL超纯水和1mL氨水,再将5 mL离子液缓慢滴入圆底烧瓶中,将上述混合溶液超声30 min,另取2 g硫化钠溶于8 mL超纯水中并超声30 min,超声后将其在高速搅拌下滴加到圆底烧瓶中,反应2 h后溶液变为黄色,然后把混合液转移到50 mL反应釜中,在150℃下煅烧8 h,将产物用超纯水和无水乙醇各洗涤3次,并在90℃真空干燥箱中干燥10 h小时,然后使产物自然冷却至室温,得到黄色的锌、镉共掺杂硫化物ZnCdS纳米晶,将其溶于超纯水中,得到ZnCdS悬浮液;
所述的离子液为1-己基-3-甲基-咪唑六氟磷酸盐溶液。
实施例4制备PS@Au-TBA的具体步骤为:
取0.01 g柠檬酸钠溶于40 mL超纯水中,然后依次加入2 mL、5 mmol·L-1 的HAuCl4和200 µL氨基聚苯乙烯微球PS并搅拌5 min,然后在搅拌的条件下将溶液加热煮沸并反应15min,待冷却至室温后离心并用超纯水洗涤2 次,将得到的沉淀重新分散在50 µL超纯水中,逐滴滴加2 mL巯基化凝血酶适配体,边滴加边摇荡,混匀后将该溶液置于4℃下恒温震荡孵化12 h,再加入1 mL 的BSA溶液,室温下震荡1 h用于封闭非特异性位点,制得PS@Au-TBA,并将其置于4℃冰箱中冷藏备用。
实施例5制备PS@Au-TBA的具体步骤为:
取0.02 g柠檬酸钠溶于80 mL超纯水中,然后依次加入4 mL、6 mmol·L-1 的HAuCl4和400 µL氨基聚苯乙烯微球PS并搅拌10 min,然后在搅拌的条件下将溶液加热煮沸并反应30min,待冷却至室温后离心并用超纯水洗涤3 次,将得到的沉淀重新分散在100 µL超纯水中,逐滴滴加4 mL巯基化凝血酶适配体,边滴加边摇荡,混匀后将该溶液置于4℃下恒温震荡孵化14 h,再加入2 mL 的BSA溶液,室温下震荡1 h用于封闭非特异性位点,制得PS@Au-TBA,并将其置于4℃冰箱中冷藏备用。
实施例6制备PS@Au-TBA的具体步骤为:
取0.01 g柠檬酸钠溶于40 mL超纯水中,然后依次加入2 mL、7 mmol·L-1 的HAuCl4和300 µL氨基聚苯乙烯微球PS并搅拌5 min,然后在搅拌的条件下将溶液加热煮沸并反应15min,待冷却至室温后离心并用超纯水洗涤2 次,将得到的沉淀重新分散在50 µL超纯水中,逐滴滴加2 mL巯基化凝血酶适配体,边滴加边摇荡,混匀后将该溶液置于4℃下恒温震荡孵化13 h,再加入1 mL 的BSA溶液,室温下震荡1 h用于封闭非特异性位点,制得PS@Au-TBA,并将其置于4℃冰箱中冷藏备用。
实施例7制备光电化学凝血酶适配体传感器的具体步骤为:
(a)将氧化铟锡ITO电极切割至2.5 cm × 0.8 cm大小,依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗30 min,用氮气吹干后,将8 µL的ZnCdS悬浮液修饰到ITO电极上,室温下晾干,然后在400℃马弗炉中煅烧30 min,取出后自然冷却至室温,得到ITO/ZnCdS电极;
(b)在步骤(a)中得到的电极表面修饰4 μL浓度为 5 μmol·L-1的羧基化凝血酶适配体,在室温下反应1 h,使得凝血酶适配体的羧基和ZnCdS复合材料中Zn与Cd原子配位结合,再用超纯水洗涤去除未结合上的凝血酶适配体,4℃冰箱中晾干;
(c)在步骤(b)中得到的电极表面修饰4 μL的1 %牛血清蛋白溶液以封闭非特异性结合位点,室温下反应1 h,用超纯水洗涤,4℃冰箱中晾干;
(d)在步骤(c)中得到的电极表面滴加4 μL不同浓度的凝血酶溶液,15℃环境下孵化1h,通过酶与适配体特异性识别免疫反应将其固定在电极表面,再用超纯水清洗多余的凝血酶,4℃冰箱中晾干;
(e)在步骤(d)中得到的电极表面滴涂4 µL PS@Au-TBA,15℃环境下孵化1 h,通过氨基与羧基的结合将其固定在电极表面,再用超纯水清洗,4℃冰箱中晾干,即制得光电化学凝血酶适配体传感器。
实施例8制备光电化学凝血酶适配体传感器的具体步骤为
(a)将氧化铟锡ITO电极切割至2.5 cm × 0.8 cm大小,依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗40 min,用氮气吹干后,将10 µL的ZnCdS悬浮液修饰到ITO电极上,室温下晾干,然后在450℃马弗炉中煅烧40 min,取出后自然冷却至室温,得到ITO/ZnCdS电极;
(b)在步骤(a)中得到的电极表面修饰6 μL浓度为 6 μmol·L-1的羧基化凝血酶适配体,在室温下反应1.5 h,使得凝血酶适配体的羧基和ZnCdS复合材料中Zn与Cd原子配位结合,再用超纯水洗涤去除未结合上的凝血酶适配体,4℃冰箱中晾干;
(c)在步骤(b)中得到的电极表面修饰6 μL的1 %牛血清蛋白溶液以封闭非特异性结合位点,室温下反应1.5 h,用超纯水洗涤,4℃冰箱中晾干;
(d)在步骤(c)中得到的电极表面滴加6 μL不同浓度的凝血酶溶液,15℃环境下孵化1.5 h,通过酶与适配体特异性识别免疫反应将其固定在电极表面,再用超纯水清洗多余的凝血酶,4℃冰箱中晾干;
(e)在步骤(d)中得到的电极表面滴涂6 µL PS@Au-TBA,15℃环境下孵化1.5 h,通过氨基与羧基的结合将其固定在电极表面,再用超纯水清洗,4℃冰箱中晾干,即制得光电化学凝血酶适配体传感器。
实施例9制备光电化学凝血酶适配体传感器的具体步骤为:
(a)将氧化铟锡ITO电极切割至2.5 cm × 0.8 cm大小,依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗30 min,用氮气吹干后,将10 µL的ZnCdS悬浮液修饰到ITO电极上,室温下晾干,然后在500℃马弗炉中煅烧30 min,取出后自然冷却至室温,得到ITO/ZnCdS电极;
(b)在步骤(a)中得到的电极表面修饰8 μL浓度为 7 μmol·L-1的羧基化凝血酶适配体,在室温下反应1 h,使得凝血酶适配体的羧基和ZnCdS复合材料中Zn与Cd原子配位结合,再用超纯水洗涤去除未结合上的凝血酶适配体,4℃冰箱中晾干;
(c)在步骤(b)中得到的电极表面修饰8 μL的1 %牛血清蛋白溶液以封闭非特异性结合位点,室温下反应1 h,用超纯水洗涤,4℃冰箱中晾干;
(d)在步骤(c)中得到的电极表面滴加8 μL不同浓度的凝血酶溶液,15℃环境下孵化1h,通过酶与适配体特异性识别免疫反应将其固定在电极表面,再用超纯水清洗多余的凝血酶,4℃冰箱中晾干;
(e)在步骤(d)中得到的电极表面滴涂8 µL PS@Au-TBA,15℃环境下孵化1 h,通过氨基与羧基的结合将其固定在电极表面,再用超纯水清洗,4℃冰箱中晾干,即制得光电化学凝血酶适配体传感器。
实施例10 所制备的光电化学凝血酶适配体传感器的应用,其特征在于,包括如下应用步骤:
a. 标准溶液配制:配制一组包括空白标样在内的不同浓度的凝血酶标准溶液;
b. 工作电极修饰:将所制备的光电化学凝血酶适配体传感器作为工作电极,将步骤a中配制的不同浓度的凝血酶标准溶液分别滴涂到工作电极上;
c. 工作曲线绘制:以饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为辅助电极,与步骤b所修饰好的工作电极组成三电极体系,在PBS缓冲溶液中进行测试;采用i-t测试手段对分析物进行检测,设置电压为0 V,运行时间100 s,激发光源为LED灯;检测对不同浓度的凝血酶标准溶液产生的光电流强度,绘制工作曲线;含有不同浓度的凝血酶标准溶液的光电流强度记为I i,I i与凝血酶标准溶液浓度c的对数之间成线性关系,绘制I i - logc工作曲线;
d. 凝血酶的检测:用待测的人体血清样品代替步骤b中的凝血酶标准溶液,按照步骤b和c中的方法进行检测,根据响应光电流强度I和工作曲线,得到待测样品中凝血酶的含量;
所述的PBS缓冲溶液为10 mL ~ 15 mL、pH为5.0 ~ 8.0的含0.1 mol/L抗坏血酸的磷酸盐缓冲溶液。
Claims (2)
1.一种基于PS@Au双重抑制ZnCdS的光电化学凝血酶适配体传感器的制备方法及应用,所述的光电化学凝血酶适配体传感器由ITO工作电极、锌、镉共掺杂硫化物ZnCdS纳米晶、凝血酶适配体、牛血清白蛋白、凝血酶、氨基化的聚苯乙烯微球负载金纳米粒子的二抗孵化物PS@Au-TBA组成;
其特征在于,所述的制备方法包括以下制备步骤:
一、ZnCdS的制备;
二、PS@Au-TBA的制备;
三、光电化学凝血酶适配体传感器的制备;
其中,步骤一制备ZnCdS的具体步骤为:
称取1 ~ 3 g Zn(Ac)2·2H2O和1 ~ 3 g Cd(NO3)2·4H2O于圆底烧瓶中,加入20 ~ 40mL超纯水和1 ~ 2 mL氨水,再将5 ~ 10 mL离子液缓慢滴入圆底烧瓶中,将上述混合溶液超声30 ~ 40 min,另取2 ~ 4 g硫化钠溶于8 ~ 16 mL超纯水中并超声30 ~ 40 min,超声后将其在高速搅拌下滴加到圆底烧瓶中,反应1 ~ 2 h后溶液变为黄色,然后把混合液转移到50 ~ 100 mL反应釜中,在100 ~ 150℃下煅烧6 ~ 9 h,将产物用超纯水和无水乙醇各洗涤3次,并在90℃真空干燥箱中干燥10 ~ 12 h小时,然后使产物自然冷却至室温,得到黄色的锌、镉共掺杂硫化物ZnCdS纳米晶,将其溶于超纯水中,得到ZnCdS悬浮液;
所述的离子液为1-己基-3-甲基-咪唑六氟磷酸盐溶液;
其中,步骤二制备PS@Au-TBA的具体步骤为:
取0.01 ~ 0.02 g柠檬酸钠溶于40 ~ 80 mL超纯水中,然后依次加入2 ~ 4 mL、5 ~ 7mmol·L-1 的HAuCl4和200 ~ 400 µL氨基聚苯乙烯微球PS并搅拌5 ~ 10 min,然后在搅拌的条件下将溶液加热煮沸并反应15 ~ 30 min,待冷却至室温后离心并用超纯水洗涤2 ~ 3次,将得到的沉淀重新分散在50 ~ 100 µL超纯水中,逐滴滴加2 ~ 4 mL巯基化凝血酶适配体,边滴加边摇荡,混匀后将该溶液置于4℃下恒温震荡孵化12 ~ 14 h,再加入1 ~ 3 mL的BSA溶液,室温下震荡1 ~ 1.5 h用于封闭非特异性位点,制得PS@Au-TBA,并将其置于4℃冰箱中冷藏备用;
其中,步骤三制备光电化学凝血酶适配体传感器的具体步骤为:
(a)将氧化铟锡ITO电极切割至2.5 cm × 0.8 cm大小,依次用丙酮、乙醇和超纯水超声清洗30 ~ 40 min,用氮气吹干后,将8 ~ 10 µL的ZnCdS悬浮液修饰到ITO电极上,室温下晾干,然后在400 ~ 500℃马弗炉中煅烧30 ~ 40 min,取出后自然冷却至室温,得到ITO/ZnCdS电极;
(b)在步骤(a)中得到的电极表面修饰4 ~ 8 μL浓度为 5 ~ 8 μmol·L-1的羧基化凝血酶适配体,在室温下反应1 ~ 2 h,使得凝血酶适配体的羧基和ZnCdS复合材料中Zn与Cd原子配位结合,再用超纯水洗涤去除未结合上的凝血酶适配体,4℃冰箱中晾干;
(c)在步骤(b)中得到的电极表面修饰4 ~ 8 μL的1 ~ 1.5 %牛血清蛋白溶液以封闭非特异性结合位点,室温下反应1 ~ 1.5 h,用超纯水洗涤,4℃冰箱中晾干;
(d)在步骤(c)中得到的电极表面滴加4 ~ 8 μL不同浓度的凝血酶溶液,15℃环境下孵化1 ~ 1.5 h,通过酶与适配体特异性识别免疫反应将其固定在电极表面,再用超纯水清洗多余的凝血酶,4℃冰箱中晾干;
(e)在步骤(d)中得到的电极表面滴涂4 ~ 8 µL PS@Au-TBA,15℃环境下孵化1 ~ 1.5h,通过氨基与羧基的结合将其固定在电极表面,再用超纯水清洗,4℃冰箱中晾干,即制得光电化学凝血酶适配体传感器。
2.如权利要求1所述的制备方法所制备的光电化学凝血酶适配体传感器的应用,其特征在于,包括如下应用步骤:
a. 标准溶液配制:配制一组包括空白标样在内的不同浓度的凝血酶标准溶液;
b. 工作电极修饰:将如权利要求1所述的制备方法所制备的光电化学凝血酶适配体传感器作为工作电极,将步骤a中配制的不同浓度的凝血酶标准溶液分别滴涂到工作电极上;
c. 工作曲线绘制:以饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为辅助电极,与步骤b所修饰好的工作电极组成三电极体系,在PBS缓冲溶液中进行测试;采用i-t测试手段对分析物进行检测,设置电压为0 V,运行时间100 s,激发光源为LED灯;检测对不同浓度的凝血酶标准溶液产生的光电流强度,绘制工作曲线;含有不同浓度的凝血酶标准溶液的光电流强度记为I i,I i与凝血酶标准溶液浓度c的对数之间成线性关系,绘制I i - logc工作曲线;
d. 凝血酶的检测:用待测的人体血清样品代替步骤b中的凝血酶标准溶液,按照步骤b和c中的方法进行检测,根据响应光电流强度I和工作曲线,得到待测样品中凝血酶的含量;
所述的PBS缓冲溶液为10 mL ~ 15 mL、pH为5.0 ~ 8.0的含0.1 mol/L抗坏血酸的磷酸盐缓冲溶液。
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