CN110320260B - 基于MXenes和黑磷量子点增强的外泌体电致化学发光传感器 - Google Patents

基于MXenes和黑磷量子点增强的外泌体电致化学发光传感器 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于MXenes和黑磷量子点增强的外泌体电致化学发光传感器。特点是BPQDs能够催化Ru(dcbpy)3 2+的氧化，作为共反应试剂与Ru(dcbpy)3 2+形成自增强的Ru(dcbpy)3 2+‑BPQDs体系，发射强的ECL信号。MXenes具有良好的导电性和大的比表面积，能够增加BPQDs和Ru(dcbpy)3 2+的负载量，进一步放大ECL信号。SiO2纳米星(SiO2 NUs)和1‑羧基‑3‑甲基咪唑氯化铵（ILs）作为传感基底，不仅能够加速电子的传递，还能固定大量的适体，该适体能够特异性识别EpCAM蛋白，捕获exosomes,接着，exosomes识别标记有CD63抗体的信号探针，构成夹心型传感器，实现了对exosomes的高灵敏检测。本文发明拓宽了MXenes和BPQDs在ECL领域的应用。

Description

基于MXenes和黑磷量子点增强的外泌体电致化学发光传感器
技术领域
本发明属于新型功能材料与生物传感检测技术领域，具体涉及一种基于MXenes和黑磷量子点增强的电致化学发光传感器用于外泌体检测的制备方法。
背景技术
外泌体是一种直径为30~100 nm的囊泡小体，可以被绝大数类型的细胞如树突细胞，巨噬细胞，肿瘤细胞和干细胞等分泌产生。外泌体携带大量的蛋白质、脂质、DNA、RNA等生物信息分子，这使其成为细胞间信息传递的信使。大量与外泌体有关的报道表明，外泌体在抗肿瘤反应、肿瘤诊断中发挥着重要作用，有望成为疾病诊断的无创生物标志物。因此，开发高灵敏的外泌体的检测方法在临床诊断中具有重要的意义。
电致化学发光发光（ECL）是一种有效的分析方法，其具有灵敏度高、反应可控性强、仪器设备简单等优点，被广泛应用于生物分析。MXenes 是新型的二维过渡族金属碳化物或氮化物的简称，由于其优异的物理、化学、光学和电学性能，近年来受到了广泛的关注。此外，MXenes 具有大的比表面积和良好的吸附能力，可作为纳米载体应用于传感领域。黑磷（BP）纳米片是一种新型的二维纳米材料，被广泛应用在锂电池、光催化和气体传感器等方面。少层BP 纳米片（又称黑磷量子点（BPQDs））因为量子限制和边缘效应，表现出独特的电子和光学性质。BPQDs能够催化Ru(dcbpy)3 2+的氧化，作为共反应试剂与Ru(dcbpy)3 2+反应，发射强的ECL信号。MXenes作为探针载体，能够增加Ru(dcbpy)3 2+和BPQDs的负载量，进一步增强ECL信号。本发明利用MXenes 和BPQDs的放大作用，构建了一个灵敏的电致化学发光传感器，实现了对exosomes的检测，同时也丰富了新型纳米材料MXenes和BPQDs在ECL传感领域的应用。
发明内容
本发明的目的之一是基于MXenes和黑磷量子点的双重放大，构建一种高灵敏的电致化学发光传感器及其制备方法。
本发明的目的之二是将该电致化学发光传感器应用于外泌体（Exosomes）的高灵敏检测。
为实现发明目的，本发明采用如下技术方案：
1. 一种基于MXenes和黑磷量子点增强的电致化学发光传感器用于外泌体检测的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）玻碳电极（GCE）首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依次用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；
（2）滴加3 uL 浓度为5 mg/mL的SiO2纳米星(SiO2 NUs) 于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，制得SiO2 NUs修饰电极；
（3）滴加3 uL浓度为5 mg/mL的1-羧基-3-甲基咪唑氯化铵（ILs）溶液于步骤（2）所制得的电极界面，接着将电极浸入到含浓度比为2:1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的混合溶液中反应40 min, 活化ILs表面的羧基，制得SiO2 NUs/ ILs修饰电极；
（4）滴加3 uL 浓度为1μM 的适体（Aptamer）于步骤（3）制得的修饰电极界面, 室温下孵育40 min，用去离子水洗去物理吸附，制得Apt/ILs/SiO2 NUs修饰电极；
（5） 取100 uL浓度为1.0×10-2 M的 三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌（Ru(dcbpy)3 2+）加入到含浓度比为2:1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的混合溶液中反应40 min, 再向所获得的溶液中加入100 uL浓度为5 mg/mL的聚乙烯亚胺（PEI）溶液，通过酰胺反应，得到Ru(dcbpy)3 2+-PEI复合物；将 100uL浓度为8 mg/mL的MXenes与100 uL浓度为0.1 mg/mL 的黑磷量子点（BPQDs）超声混合均匀，室温下振荡6 h, 得到MXenes-BPQDs复合溶液；将Ru(dcbpy)3 2+-PEI复合物加入到MXenes-BPQDs复合溶液中，室温下震荡6 h, 离心，洗涤，通过静电引力和物理吸附，得到MXenes-BPQDs@Ru(dcbpy)3 2+-PEI复合溶液，再向上述溶液中加入100 uL浓度为50 μg/mL的CD63抗体（AbCD63），室温下孵育50 min, 离心洗涤后，再加入1wt.%的BSA溶液封闭非特异性吸附位点，洗涤后，得到ECL 探针（MXenes-BPQDs@Ru(dcbpy)3 2+-PEI- AbCD63-BSA）并保存在4 °C冰箱中备用；
（6） 将步骤（4）制得的修饰电极浸入到不同浓度的exosomes悬浮液中并在室温下反应50 min, 制得Exosomes/Apt/ILs/SiO2 NUs修饰电极；
（7）取3 uL步骤（5）制得ECL探针滴加到步骤（6）所制得的修饰电极界面，室温下孵育40 min, 用去离子水冲洗电极表面,制得ECL 探针/Exosomes/Apt/ILs/SiO2 NUs修饰电极，并保存在4 °C冰箱中备用。
2. 所述的MXenes由下述方法制备的：将2.0 g的钛碳化铝粉末加入30 mL, 48%的氢氟酸溶液中反应24 h，离心分离洗涤后再干燥28 h，得到Ti3C2粉末；将该粉末分散到二甲亚砜（DMSO）溶液中，室温下搅拌24 h，然后用去离子水洗涤所得悬浮液数次，离心以分离粉末，直到上清液的pH达到7.0，将所得到的上清液保存在4 °C供以后使用。
3. 所述的黑磷量子点（BPQDs）由下述方法制备的：将10 mg的黑磷晶体粉末加入到含2 mL N-甲基吡啶烷酮 （NMP）的研钵中，充分研磨后，将混合物转移到含6 mL NMP的玻璃瓶中；密封仔细，在100 W的功率下，在冰浴中超声8 h, 然后在7000 rpm离心20 min, 再在10，000 rpm离心20 min得到BPQDs。
4. 外泌体 (Exosomes）的检测步骤：
（1）使用电化学工作站采用三电极体系进行测定，以上述的一种基于MXenes和黑磷量子点增强的电致化学发光传感器为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，在0.1 mol/mL pH 8.0的 PBS缓冲溶液中进行测试；
（2）采用电位范围0 ~ 1.6 V，扫描速率0.15 V/s电位窗口，电致化学发光设备光电倍增管700 V对不同浓度的exosomes进行检测，通过电致化学发光设备采集 1.1V的ECL信号强度，通过ECL信号强度与exosomes浓度之间的关系，绘制工作曲线；
（3）待测样品溶液exosomes溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。
本发明的显著优点为：
（1）基于MXenes和BPQDs的协同放大作用，构建了一个灵敏的电致化学发光传感器用于外泌体的检测。
（2）BPQDs能够催化Ru(dcbpy)3 2+的氧化，作为共反应试剂与Ru(dcbpy)3 2+形成自增强的Ru(dcbpy)3 2+-BPQDs体系，发射出强的ECL信号。
（3）MXenes具有大的比表面积和良好的吸附能力，能够负载大量的Ru(dcbpy)3 2+和BPQDs，进一步放大ECL信号。
附图说明
图1为本发明的电镜对照图，图中A为SiO2纳米星(SiO2 NU) 的透射电镜 (TEM)、图中B为BPQDs的透射电镜 (TEM)、图中C为MXenes的扫描电镜(SEM)。
图2为电致化学发光免疫传感的发光响应信号与外泌体 (Exosomes）浓度的线性关系图。
具体实施方式
本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。
实施例1
1. 一种基于MXenes和黑磷量子点增强的电致化学发光传感器用于外泌体检测的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1） 玻碳电极（GCE）首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依次用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；
（2）滴加3 uL 浓度为5 mg/mL的SiO2纳米星(SiO2 NUs) 于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，制得SiO2 NUs修饰电极；
（3）滴加3 uL浓度为5 mg/mL的1-羧基-3-甲基咪唑氯化铵（ILs）（购买自兰州中科凯特科工贸有限公司）溶液于步骤（2）所制得的电极界面，接着将电极浸入到含浓度比为2:1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的混合溶液中反应40 min, 活化ILs表面的羧基，制得SiO2 NUs/ ILs修饰电极；
（4）滴加3 uL 浓度为1μM 的适体（Aaptamer，购买自生工生物工程（上海）股份有限公司）于步骤（3）制得的修饰电极界面, 室温下孵育40 min，用去离子水洗去物理吸附，制得Apt/ILs/SiO2 NUs修饰电极；
（5） 取100 uL浓度为1.0×10-2 M的 三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌（Ru(dcbpy)3 2+）加入到含浓度比为2:1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的混合溶液中反应40 min, 再向所获得的溶液中加入100 uL浓度为5 mg/mL的聚乙烯亚胺（PEI）溶液，通过酰胺反应，得到Ru(dcbpy)3 2+-PEI复合物；将 100uL浓度为8 mg/mL的MXenes与100 uL浓度为0.1 mg/mL 的黑磷量子点（BPQDs）超声混合均匀，室温下振荡6 h, 得到MXenes-BPQDs复合溶液; 将Ru(dcbpy)3 2+-PEI复合物加入到MXenes-BPQDs复合溶液中，室温下震荡6 h, 离心，洗涤，通过静电引力和物理吸附，得到MXenes-BPQDs@Ru(dcbpy)3 2+-PEI复合溶液，再向上述溶液中加入100 uL浓度为50 μg/mL的CD63抗体（AbCD63，购买自生工生物工程（上海）股份有限公司），室温下孵育50 min, 离心洗涤后，再加入1wt.%的BSA溶液封闭非特异性吸附位点，洗涤后，得到ECL 探针（MXenes-BPQDs@Ru(dcbpy)3 2+-PEI- AbCD63-BSA）并保存在4 °C冰箱中备用；
（6） 将步骤（4）制得的修饰电极浸入到不同浓度的外泌体（Exosomes，购买自中国科学院上海生物科学研究所）悬浮液中并在室温下反应50 min, 制得Exosomes/Apt/ILs/SiO2 NU修饰电极；
（7）取3 uL步骤（5）制得ECL探针滴加到步骤（6）所制得的修饰电极界面，室温下孵育40 min, 用去离子水冲洗电极表面,制得ECL探针/Exosomes/Apt/ILs/SiO2 NUs修饰电极，并保存在4 °C冰箱中备用。
实施例2
上述实施例1的 SiO2纳米星(SiO2 NUs)的制备：将0.2916 g正硅酸乙酯(TEOS)、0.0384 g十六烷基三甲基铵(CTA)、6.94mg三乙醇胺(TEAH) 溶解于5 ml水中，并在80 °C搅拌2 h。得到的混合溶液过滤至pH = 7.3, 然后洗涤，再在100℃烘箱中干燥20小时，得到最终产物SiO2 Nus。
实施例3
上述实施例1的MXenes的制备：将2.0 g的钛碳化铝粉末（Ti3AlC2，购买自福斯曼科技有限公司）加入30 mL, 48wt% 的氢氟酸溶液中反应24 h，离心分离洗涤后再干燥28 h，得到Ti3C2粉末；将该粉末分散到二甲亚砜（DMSO）溶液中，室温下搅拌24 h，然后用去离子水洗涤所得悬浮液数次，离心以分离粉末，直到上清液的pH达到7.0，将所得到的上清液保存在4 °C供以后使用。
实施例4
上述实施例1的BPQDs的制备：将10 mg的黑磷晶体粉末加入到含2 mL N-甲基吡啶烷酮 （NMP）的研钵中，充分研磨后，将混合物转移到含6 mL NMP的玻璃瓶中；密封仔细，在100 W的功率下，在冰浴中超声8 h, 然后在7000 rpm离心20 min, 再在10，000 rpm离心20min得到BPQDs。
实施例5
外泌体（Exosomes）的检测步骤：
（1）使用电化学工作站采用三电极体系进行测定，以实施例1制得的一种基于MXenes和黑磷量子点增强的电致化学发光传感器工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，在0.1 mol/mL pH 8.0的 PBS缓冲溶液中进行测试；
（2）采用电位范围0 ~ 1.6 V，扫描速率0.15 V/s电位窗口，电致化学发光设备光电倍增管700 V对不同浓度的exosomes进行检测，通过电致化学发光设备采集 1.1 V的ECL信号强度，通过ECL信号强度与exosomes浓度之间的关系，绘制工作曲线；
（3）待测样品溶液exosomes溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。

Claims (5)

1.一种基于MXenes和黑磷量子点增强的电致化学发光传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1） 玻碳电极GCE 首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依次用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；
（2） 滴加3 μL 浓度为5 mg/mL的SiO2 纳米星SiO2 NUs 于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，制得SiO2 NUs修饰电极；
（3） 滴加3 μL浓度为5 mg/mL的1-羧基-3-甲基咪唑氯化铵 ILs 溶液于步骤（2）所制得的电极界面，接着将电极浸入到含浓度比为2:1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 EDC 及N-羟基琥珀酰亚胺NHS的混合溶液中反应40 min, 活化ILs表面的羧基，制得SiO2 NUs/ ILs修饰电极；
（4） 滴加3 μL 浓度为1 μM 的适体Apt于步骤（3）制得的修饰电极界面, 室温下孵育40 min，用去离子水洗去物理吸附，制得Apt/ILs/SiO2 NUs修饰电极；
（5） 取100 μL浓度为1.0×10-2 M的 三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌 Ru(dcbpy)3 2+ 加入到含浓度比为2:1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC及N-羟基琥珀酰亚胺NHS的混合溶液中反应40 min, 再向所获得的溶液中加入100 μL浓度为5 mg/mL的聚乙烯亚胺PEI溶液，通过酰胺反应，得到Ru(dcbpy)3 2+-PEI复合物；将 100 μL浓度为8 mg/mL的MXenes与100μL浓度为0.1 mg/mL 的黑磷量子点BPQDs 超声混合均匀，室温下振荡6 h, 得到MXenes-BPQDs复合溶液；将Ru(dcbpy)3 2+-PEI复合物加入到MXenes-BPQDs复合溶液中，室温下震荡6 h, 离心，洗涤，通过静电引力和物理吸附，得到MXenes-BPQDs@Ru(dcbpy)3 2+-PEI复合溶液，再向上述溶液中加入100 μL浓度为50 μg/mL 的CD63抗体AbCD63，室温下孵育50 min, 离心洗涤后，再加入1wt.%的BSA溶液封闭非特异性吸附位点，洗涤后，得到ECL 探针MXenes-BPQDs@Ru(dcbpy)3 2+-PEI- AbCD63-BSA并保存在4 °C冰箱中备用；
（6） 将步骤（4）制得的修饰电极浸入到不同浓度的Exosomes悬浮液中并在室温下反应50 min, 制得Exosomes/Apt/ILs/SiO2 NUs修饰电极；
（7） 取3 μL步骤（5）制得ECL探针滴加到步骤（6）所制得的修饰电极界面，室温下孵育40 min, 用去离子水冲洗电极表面,制得ECL探针/Exosomes/Apt/ILs/SiO2 NUs修饰电极，并保存在4 °C冰箱中备用。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的MXenes由下述方法制备的：将2.0 g的钛碳化铝粉末加入30 mL, 48wt% 的氢氟酸溶液中反应24 h，离心分离洗涤后再干燥28h，得到Ti3C2粉末；将该粉末分散到二甲亚砜DMSO溶液中，室温下搅拌24 h，然后用去离子水洗涤数次，离心以分离粉末，直到上清液的pH达到7.0，将所得到的上清液保存在4 °C供以后使用。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的黑磷量子点BPQDs由下述方法制备的：将10 mg的黑磷晶体粉末加入到含2 mL N-甲基吡啶烷酮 NMP的研钵中，充分研磨后，将混合物转移到含6 mL NMP的玻璃瓶中；密封仔细，在100 W的功率下，在冰浴中超声8 h, 然后在7000 rpm离心20 min, 再在10000 rpm离心20 min得到BPQDs。
4.权利要求1-3任一所述的方法制备的一种基于MXenes和黑磷量子点增强的电致化学发光传感器。
5.权利要求4所述的一种基于MXenes和黑磷量子点增强的电致化学发光传感器；其特征在于，用于外泌体Exosomes检测，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站采用三电极体系进行测定，以权利要求4所述的基于MXenes和黑磷量子点增强的电致化学发光传感器为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，在0.1 mol/mL pH 8.0的 PBS缓冲溶液中进行测试；
（2）采用电位范围0 ~ 1.6 V，扫描速率0.15 V/s电位窗口，电致化学发光设备光电倍增管700 V对不同浓度的Exosomes进行检测，通过电致化学发光设备采集 1.1 V的ECL信号强度，通过ECL信号强度与Exosomes浓度之间的关系，绘制工作曲线；
（3）对含有Exosomes 的待测样品溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。
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