CN113219180B - 一种外泌体pd-l1的研究方法 - Google Patents

一种外泌体pd-l1的研究方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种外泌体PD‑L1的研究方法，包括如下步骤：1)将细胞与非天然糖共培养，细胞泌出含有非天然糖的外泌体；2)将功能性探针标记到非天然糖上,所述的功能性探针具有第一标记；3)适体识别外泌体表面的蛋白，所述的适体具有第二标记；4)第一标记同第二标记相互作用，检测该相互作用的效果，从而检测外泌体蛋白的糖基化信息。即可原位检测外泌体PD‑L1的糖基化，操作简单，无需裂解细胞等侵入性操作，保持细胞的完整性和功能。

Description

一种外泌体PD-L1的研究方法
技术领域
本发明涉及一种外泌体PD-L1的研究方法。
背景技术
外泌体程序性死亡配体1(exoPD-L1)与T淋巴细胞表面的程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)结合，抑制T淋巴细胞的增殖、细胞因子产生和细胞毒性，从而抑制免疫应答。研究exoPD-L1导致的免疫抑制机制，发现更准确的exoPD-L1导致的免疫预测靶标，对于了解其作为免疫抑制生物标志物的重要性及其作为预测免疫治疗反应的生物标志物的潜力具有重要意义。
在现有技术中：
CN201910145354.8公开了一种PD L1外泌体的体外快速检测平台及检测方法，检测平台包括样品初滤区、纳滤区、显色物垫区、显色区和吸水垫区。所述显色区上的捕获抗体和显色物垫区上的显色物标记抗体中至少有一种为外泌体PD L1抗体。检测方法为先将待检样品经过初滤膜进行初步过滤，再经过纳滤膜进行过滤，得到外泌体；外泌体与显色物标记抗体特异性地结合，与显色物标记抗体特异性结合的外泌体再与捕获抗体结合，形成双抗体夹心；所述捕获抗体和显色物标记抗体至少有一种为外泌体PD L1抗体。此平台集成全血分离，外泌体纯化以及PD L1外泌体特异检测。
CN202010083389.6公开一种基于适配体传感器的高灵敏检测血清中PD L1的方法，属于用药辅助诊断领域。目前血清外泌体PD L1中的检测是基于抗原抗体杂交的酶联免疫技术，具有检测成本高、操作难度大等缺点。该发明以PD L1适配体为例，通过酶切辅助靶循环及Q PCR实现检测信号的多重放大，建立了一种PD L1超敏检测传感器。
以上的研究方法检测体液中所有的exoPD-L1，而临床研究表明，exoPD-L1的水平与肿瘤患者的基础病理情况不一致，以exoPD-L1水平区分肿瘤患者以及健康人存在假阳性和假阴性，并且exoPD-L1水平无法预测部分患者的免疫治疗反应。因此进一步研究exoPD-L1的抗肿瘤免疫机制，发现更准确的exoPD-L1免疫预测靶标，对于了解其作为免疫抑制生物标志物的重要性及其作为预测免疫治疗反应的生物标志物的潜力具有重要意义。
发明内容
本发明的主要目的，在于提供一种外泌体PD-L1的研究方法。
本发明解决其技术问题的所采用的技术方案是：
一种外泌体PD-L1的研究方法，包括如下步骤：
1)将细胞与非天然糖共培养，细胞将非天然糖代谢至细胞表面，泌出含有非天然糖的外泌体；
2)将功能性探针标记到非天然糖上,所述的功能性探针具有第一标记；
3)适体识别外泌体表面的PD-L1蛋白，所述的适体(aptamer)为具有第二标记的核酸适体；
4)第一标记同第二标记相互作用，检测该相互作用的效果，从而检测外泌体PD-L1糖基化信息。
优选地，所述的非天然糖包括可用于N-糖基化代谢标记的非天然糖中的至少一种。
优选地，所述的一种外泌体的糖基化研究方法，非天然糖可直接投入细胞培养基中与细胞共培养，或将其包裹于功能材料中与细胞共培养。
优选地，所述的第一标记包括发光染料、生物素化探针、纳米材料中的至少一种。
优选地，所述的第二标记为可修饰的PD-L1适体，PD-L1适体可被发光染料、生物素化探针、纳米材料中的至少一种修饰。
优选地，所述的发光染料包括现有激光共聚焦显微镜可激发的以及近红外激发的染料，包括波长范围为248-1100nm激发的染料中的至少一种。
优选地，所述的生物素化探针包括生物素化小分子、生物素化微珠中的至少一种。
优选地，所述的纳米材料包括各种纳米无机或有机材料中的至少一种。
优选地，所述的步骤4)的检测方法包括发光、质谱、色谱鉴定中的至少一种。
所述的外泌体的PD-L1糖基化的信息包括但不限于PD-L1糖基化的定性、定量、时空分布。
本技术方案与背景技术相比，具有如下优点：
1、本发明采用非天然糖与细胞共培养，泌出含有非天然糖的外泌体，用功能性探针标记非天然糖，非天然糖上的修饰及功能探针分子量小，不影响糖链的天然结构和蛋白的功能。
2.本发明用适体识别外泌体表面的PD-L1蛋白，与抗体相比，分子量小，识别效率高，识别不受PD-L1翻译后修饰的影响，亦不影响外泌体PD-L1的功能。
3.在功能性探针的第一标记和适体的第二标记作用下，即可原位检测外泌体PD-L1的糖基化，操作简单，无需裂解细胞等侵入性操作，保持细胞的完整性和功能，可用于外泌体PD-L1糖基化的功能研究。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为本发明的原理示意图。
图2为外泌体的物理性质表征。(A)未代谢标记的A735外泌体的TEM成像及NTA测定的粒径统计；(B)代谢标记的A735外泌体的TEM成像图及NTA测定的粒径统计。
图3为外泌体的免疫性质表征。(A)Western blot验证未代谢标记和代谢标记的外泌体的CD63和PD-L1表达；(B)流式细胞术验证未代谢标记和代谢标记的外泌体的CD63表达。
图4为PD-L1抗体和适体的对exoPD-L1的识别表征。(A)未代谢标记的A735外泌体的PD-L1抗体和适体的识别性能；(B)代谢标记的A735外泌体的PD-L1抗体和适体的识别性能。
图5为生物正交条件优化。(A)DBCO-Cy5浓度优化；(B)20μg/mL DBCO-Cy5条件下未代谢标记和代谢标记的外泌体的生物正交结果。
图6为代谢标记A375外泌体PD-L1糖基化原位荧光成像结果。
图7为代谢标记293T外泌体PD-L1糖基化原位荧光成像结果。
图8为糖代谢标记(A)、PD-L1适体识别(B)和生物正交标记(C)对PD-1结合的影响。
图9为外泌体PD-L1去除糖基及糖基化对PD-L1抗体和适体识别性能影响的表征。(A)流式验证PNGase F去糖的结果；(B)Western Blot验证PD-L1的去糖结果；(C)PD-L1抗体和PD-L1适体对去糖/不去糖的exoPD-L1的结合性能表征。
图10为外泌体PD-L1糖基化对PD-1识别的影响。(A)去糖/不去糖的外泌体与PD-1结合的CLSM成像；(B)定量去糖/不去糖的外泌体的DBCO-Cy5及FRET通道的荧光强度；(C)FRET信号与PD-1信号的皮尔森相关性。
图11为外泌体的糖基化在与CD8+T细胞识别和增殖活性抑制中的作用。(A)外泌体PD-L1抑制CD8+T细胞活性示意图；(B)去糖/不去糖外泌体与CD8+T细胞的结合成像；(C)定量去糖/不去糖外泌体对CD8+T细胞的增殖活性的抑制。
具体实施方式
1.外泌体PD-L1糖基化检测的原理
将A375细胞(黑色素瘤)与叠氮修饰的唾液酸代谢底物Ac4ManNAz培养，细胞将糖代谢至细胞膜表面形成唾液酸，再通过内吞外排泌出外泌体，从而将叠氮修饰的唾液酸标记在外泌体表面，后续与DBCO-Cy5炔基染料(溶解于DMSO)进行无铜生物正交反应标记糖链。使用Cy3标记的PD-L1适配体(TACAGGTTCTGGGGGGTGGGTGGGGAACCTGTT)识别外泌体表面PD-L1蛋白，通过Cy3与Cy5之间的荧光共振能量转移(FRET)实现特异性的PD-L1糖基化检测(加入等量DMSO培养的A375细胞的外泌体作为对照组)。
(1)细胞培养。将A375细胞(黑色素瘤)消化后重悬于含有1％FBS和1％双抗的DMEM培养基中，培养过夜。A375细胞贴壁后除去DMEM培养基，加入含有50μM Ac4ManNAz(溶解于0.1％DMSO)，1％FBS(去除外泌体)和1％双抗的DMEM培养基，培养60h(对照组为加入含0.1％DMSO的培养基)；
(2)外泌体分离。收集培养基，以3000g，20min离心去除细胞碎片；将上清收集，以16500g，45min离心除去大囊泡，收集上清后以100,000g，2h离心收集外泌体，并用PBS于100,000g，2h离心清洗外泌体；
(3)外泌体与乳胶醛珠偶联。用BCA法定量外泌体的总蛋白浓度，将10μg外泌体与4μL乳胶醛珠于室温孵育2h，加入FBS使其终浓度为1％，室温孵育30min封闭，于6000rpm，3min离心去除上清，再以1％FBS离心清洗两次，重悬获得外泌体-乳胶醛珠复合物；
(4)生物正交反应。将获得的外泌体-乳胶醛珠复合物与1～20μM DBCO-Cy5于37℃反应1h，并以1％FBS清洗3次。
(5)PD-L1适体识别PD-L1。将获得的外泌体-乳胶醛珠复合物与200nM Cy3标记的PD-L1适体于室温反应30min，并以1％FBS清洗3次。
(6)原位外泌体PD-L1糖基化检测。用激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)对标记了DBCO-Cy5和PD-L1-Cy3适体的外泌体的Cy3通道，Cy5通道，FRET通道进行原位成像。
2.外泌体的物理鉴定
通过透射电子显微镜(TEM)以及纳米粒子跟踪分析仪(NTA)来分析代谢标记和未代谢标记外泌体的物理性质。取10μL外泌体滴加于铜网上沉淀1min，再加磷钨酸10μL染色1min，常温干燥。由图2可知，正常培养的外泌体和糖代谢标记外泌体均呈杯状，符合外泌体的形貌。经NTA测定颗粒平均粒径在50-200nm之间，符合外泌体的尺寸范围。因此糖代谢标记不影响外泌体的物理性质。
3.外泌体的免疫鉴定
(1)通过流式细胞术考察未代谢标记和代谢标记的外泌体的特异性靶标CD63的表达，取5μL外泌体-乳胶醛珠分别与CD63-APC抗体、IgG-APC室温孵育30min，并用1％FBS离心清洗3遍。用流式细胞仪鉴定CD63的表达，结果表明实验组与对照组均高表达CD63蛋白(图3B)。
(2)将外泌体与4％的罗氏试剂，1％的HMFS，RIPA裂解液于4℃孵育30min，之后于14000rpm，离心30min，取上清液，并进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳后将胶中的条带转模至PVDF膜上。将PVDF膜用Western blot封闭液封闭后，分别与CD63抗体、PD-L1抗体、Actin抗体在室温孵育2h并用Western blot洗涤液洗涤3次。去除洗涤液，加入HRP偶联的二抗，室温孵育1h，用Western blot洗涤液清洗3次，用显影液进行成像。成像结果表明实验组与对照组均表达等量CD63和PD-L1(图3)。
综上，代谢标记不影响A375外泌体的CD63和PD-L1表达。
4.PD-L1抗体和适体的识别性能表征
以FAM标记的PD-L1适体和APC标记的PD-L1抗体对未代谢标记的外泌体/代谢标记的外泌体的PD-L1表达进行考察，并考察适体与抗体对PD-L1的识别性能。
如上述制备外泌体-乳胶醛珠复合物，分别与APC标记的PD-L1抗体(对照为APC标记的IgG)以及200nM FAM标记的PD-L1适体(对照为200nM FAM标记的随机DNA序列)于室温孵育30min，并用1％FBS清洗后于流式细胞术检测荧光强度(图4)。流式分析结果表明未代谢标记的外泌体和代谢标记的外泌体的PD-L1荧光强度一致，这是因为糖代谢标记引入的叠氮分子量较小，并且只标记位于糖链末端的唾液酸，不影响亲和分子的识别效率。同时PD-L1适体的亲和力强于PD-L1抗体，这是由于PD-L1适体的分子量较小，受PD-L1的翻译后修饰基团的位阻影响小，识别效率更高，因此PD-L1适体更适合研究外泌体PD-L1的糖基化。
5.生物正交表征外泌体的糖基化
Ac4ManNAz代谢标记在外泌体表面引入叠氮修饰的唾液酸，接着引入DBCO-Cy5，可与叠氮进行无铜点击化学将糖荧光标记，减少对细胞的毒性。在37℃，反应时间1h的条件下分别对代谢标记和未代谢标记外泌体进行DBCO-Cy5标记，浓度优化结果表明DBCO-Cy5的最佳反应条件为20μg/mL,37℃，1h(图5A)，代谢标记的外泌体与不未代谢标记的外泌体的荧光强度有3.7倍的差异(图5B)，表明代谢标记和生物正交反应效率较高。
6.外泌体PD-L1糖基化原位荧光成像
通过荧光共振能量转移(FERT)实现外泌体PD-L1糖基化的成像，以Cy3标记PD-L1适体识别外泌体表面PD-L1，DBCO-Cy5标记含叠氮唾液酸的糖链，只有Cy3标记的PD-L1适体和DBCO-Cy5标记同一PD-L1时才会产生FRET信号，继而通过激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)对外泌体表面PD-L1糖基化原位荧光成像。
将外泌体-乳胶醛珠复合物与20μg/mL DBCO-Cy5 37℃孵育1h，用1％FBS清洗后与400nM Cy3标记的PD-L1适体常温孵育30min，并用1％FBS清洗2次，。对照组为只加DBCO-Cy5或只加Cy3标记的PD-L1适体。
通过CLSM分析，结果表明只有同时标记Cy3-PD-L1适体和DBCO-Cy5时才有FRET信号(图6)，而不表达PD-L1的外泌体(293T细胞分泌的外泌体)没有FRET信号(图7)，因此通过代谢标记及PD-L1适体识别实现了原位外泌体PD-L1糖基化检测。
7.糖代谢标记、PD-L1适体识别和生物正交标记对PD-1结合的影响
研究表明，A375细胞分泌的外泌体表面的PD-L1可与T细胞表面PD-1相互作用，抑制T细胞活性，因此考察糖代谢标记、PD-L1适体识别和生物正交标记对A375外泌体PD-L1与PD-1结合的影响，以考察上述标记方法对外泌体的免疫抑制功能的影响。
(1)糖代谢标记对PD-1结合的影响。制备代谢标记和未代谢标记的外泌体与乳胶醛珠复合物后与2μg/mL biotin-PD-1孵育2h，离心清洗后与SA-PE孵育30min(对照组为不加biotin-PD-1)，流式结果表明代谢标记的外泌体和未代谢标记的外泌体与PD-1的结合程度一致，因此糖代谢标记不影响PD-1识别(图8A)。
(2)PD-L1适体识别和生物正交标记对PD-1结合的影响。制备代谢标记的A375外泌体与乳胶醛珠复合物后与200nM PD-L1适体于室温孵育30min或与10μM DBCO-Cy5于37℃孵育1h后离心清洗，并与2μg/mL biotin-PD-1及SA-PE孵育后于流式鉴定。流式结果表明PD-L1适体识别和生物正交标记不影响PD-1的识别(图8B-C)。
综上所述，糖代谢标记、PD-L1适体识别和生物正交标记均不影响PD-1的识别，因此可作为研究PD-L1与PD-1相互作用的工具。
8.外泌体PD-L1去除糖基及糖基化对PD-L1抗体和适体识别性能影响的表征
采用PNGase F去除PD-L1的糖基，并用流式细胞术和Western blot验证去除糖基的效果以及糖基化对PD-L1抗体和适体识别性能影响。
(1)将代谢标记的外泌体与25％PNGase F(去除N糖)于37℃孵育24h并用WesternBlot验证PD-L1的表达。Western Blot结果表明去糖后PD-L1的分子量由50kDa减少至33kDa(图9B)。将去糖和未去糖的代谢标记的外泌体与乳胶醛珠偶联与DBCO-Cy5进行生物正交反应，结果表明去糖后Cy5荧光通道的荧光强度减弱(图9A)，因此PNGase F可以去除外泌体的糖基。
(2)将去除糖基和未去糖的外泌体与乳胶醛珠偶联后分别与PD-L1适体和PD-L1抗体孵育，并用流式表征糖基对PD-L1适体和PD-L1抗体识别的影响。图9C表明糖基对PD-L1适体的识别无影响，而PD-L1抗体对去除糖基的PD-L1的结合力更强，因此PD-L1适体更适用于研究PD-L1的翻译后修饰及功能。
9.外泌体PD-L1糖基化对PD-1识别的影响
(1)将外泌体与25％PNGase F37℃反应24h后与乳胶醛珠偶联制备外泌体-乳胶醛珠复合物(对照为外泌体与等量PBS孵育)。
(2)将去糖/不去糖外泌体-乳胶醛珠复合物与400nM PD-L1 Aptamer-Cy3常温孵育30min，离心清洗后与10μg/ml DBCO-Cy5 37℃孵育1h，离心清洗后与2ug/ml biotin-PD-1常温孵育2h，离心清洗后与SA-PE常温孵育30min。
(3)荧光定量考察PD-L1糖基化对PD-1识别的影响。运用CLSM对Cy3通道(Cy3-PD-L1适体，表征PD-L1蛋白)、Cy5通道(DBCO-Cy5，表征糖基化)、FRET通道(表征PD-L1糖基化)，PE通道(biotin-PD-1+SA-PE,表征PD-1识别)进行成像(图10A)，并定量各通道的荧光强度。对Cy5通道和FRET通道荧光定量结果表明去除糖基后PD-L1的糖基化信号减弱(图10B)，对FRET通道和PE通道的相关性考察表明，PD-L1的糖基化信号和PD-1信号呈正相关性，并且皮尔森相关系数为0.8(图10C)，表明相关性极强，表明外泌体PD-L1的糖基化是外泌体PD-L1与PD-1识别的结构基础。
10.外泌体PD-L1糖基化在对CD8+T识别和增殖活性抑制中的作用
(1)对去糖/不去糖的代谢标记的外泌体用400nM Cy3标记的PD-L1适体和10μMDBCO-Cy5标记后于100,000g，2h超速离心清洗，并以25μg/mL浓度与CD8+T细胞(2×105/孔接种于96孔板)共培养2h，再用eFluor 450标记的CD8抗体标记CD8+T。于激光共聚焦显微镜下考察外泌体与CD8+T的结合情况。从图11B可以看出未去糖的外泌体明显结合于CD8+T表面，而去糖的外泌体不与CD8+T细胞结合，因此PD-L1的糖基化修饰是外泌体表面PD-L1与CD8+T细胞表面PD-1识别的结构基础。
(2)将CD8+T细胞用CFSE染料(指示细胞增殖活性)染色后接种于96孔板中(2×105个/孔)，与PBS、去糖/未去糖的A375外泌体共培养48h后，用流式细胞仪对CD8+T细胞的增殖进行表征。结果表明加了外泌体的CD8+T细胞的增殖均被抑制，并且随着外泌体的添加量的增加CD8+T细胞的增殖活性降低。此外加入去糖的外泌体的CD8+T细胞的增殖量是加入未去糖的外泌体的CD8+T细胞的增殖量的2倍(图11C)，因此外泌体PD-L1的糖基化有助于抑制CD8+T细胞的增殖活性。
综述，外泌体PD-L1的糖基化有助于PD-1的识别，继而抑制CD8+T细胞的增殖活性(图11A)。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (7)

1.一种外泌体PD-L1的研究方法，包括如下步骤：
1)将细胞与非天然糖共培养，细胞泌出含有非天然糖的外泌体；
2)将功能性探针标记到非天然糖上,所述的功能性探针具有第一标记；
3)适体识别外泌体表面的PD-L1，所述的适体为具有第二标记的适体；
4)检测第一标记同第二标记的相互作用的效果，从而获取外泌体PD-L1的糖基化信息；所述的非天然糖包括可用于N-糖基化代谢标记的非天然糖中的至少一种；
所述的第一标记包括发光染料、生物素化探针、纳米材料中的至少一种；
所述的具有第二标记的适体为可修饰的PD-L1适体，PD-L1适体被发光染料、生物素化探针、纳米材料中的至少一种修饰。
2.根据权利要求1所述的一种外泌体PD-L1的研究方法，其特征在于：非天然糖直接投入细胞培养基中与细胞共培养，或将其包裹于功能材料中与细胞共培养。
3.根据权利要求1所述的一种外泌体PD-L1的研究方法，其特征在于：所述的第一标记的发光染料包括现有激光共聚焦显微镜可激发的以及近红外激发的染料；发光染料的激发波长范围为248-1100nm。
4.根据权利要求1所述的一种外泌体PD-L1的研究方法，其特征在于：所述的生物素化探针包括生物素化小分子、生物素化微珠中的至少一种；所述的纳米材料包括纳米无机或有机材料中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的一种外泌体PD-L1的研究方法，其特征在于：所述的第二标记的PD-L1适体修饰的发光染料包括现有激光共聚焦显微镜可激发的以及近红外激发的染料；发光染料的激发波长范围为248-1100nm。
6.根据权利要求1所述的一种外泌体PD-L1的研究方法，其特征在于：所述的第二标记的PD-L1适体修饰的生物素化探针包括生物素化小分子、生物素化微珠中的至少一种；所述的第二标记的PD-L1适体修饰的纳米材料包括纳米无机或有机材料中的至少一种。
7.根据权利要求1至6任一项所述的一种外泌体PD-L1的研究方法，其特征在于：所述的外泌体的PD-L1糖基化信息包括PD-L1糖基化的定性、定量、时空分布。
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