CN110887822A - 一种胚胎分泌蛋白的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于检测方法领域，具体的涉及一种胚胎分泌蛋白的检测方法。本发明的检测方法包括如下步骤：取待测胚胎分泌蛋白的捕获抗体和标记抗体，将捕获抗体连接在荧光磁珠上，标记抗体用生物素标记；然后将荧光磁珠与待测胚胎分泌蛋白混合并孵育，接着与标记抗体及联袂亲和素标记的β‑半乳糖苷酶混合并孵育形成磁珠免疫复合物，磁珠免疫复合物与反应底物包裹在微液滴中进行孵育，最后通过多色激光诱导荧光检测器检测荧光强度，得到待测胚胎分泌蛋白的含量。本发明利用酶促反应不断催化底物反应生成荧光物质，可实现待测蛋白的信号放大，具有更高的检测灵敏度，解决了目前检测灵敏度不高的技术问题。

Description

一种胚胎分泌蛋白的检测方法
技术领域
本发明属于检测方法领域，具体的涉及一种胚胎分泌蛋白的检测方法。
背景技术
在复杂的生物样品中对某一微量蛋白进行定量检测对于临床生物标志物的筛选、疾病发展过程的监控以及疾病发展阶段的确定具有重要的意义。胚胎生长发育过程中会分泌多种蛋白，这些蛋白与胚胎发育及着床过程中的多种功能密切相关。微流控芯片技术(Microfluidics)是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。由于它在生物、化学、医学等领域的巨大潜力，已经发展成为一个生物、化学、医学、流体、电子、材料和机械等学科交叉的崭新研究领域。
目前，常规蛋白检测方法，如质谱法、酶联免疫检测法、电化学检测法和化学发光检测法等，虽然上述的检测方法能够进行正常的检测，但是检测灵敏度均难以突破pg/mL，无法满足某些临床项目的应用要求。例如，在众多胚胎分泌蛋白中筛选出与胚胎种植潜能相关的蛋白，为临床上移植胚胎的筛选提供依据是生殖医学研究中热点。然而，多数胚胎分泌蛋白的含量在fg级，且培养液的体积只有20～30μL。目前检测灵敏度高的所有相关研究的检测方法均为荧光成像法，对于仪器的成像功能要求极高。对于以液滴为反应器的研究，需要复杂结构的芯片保证液滴单层分布，且该类检测无法排出假阳性信号的干扰。这些因素导致了存在仪器复杂、昂贵、准确性差等问题从而影响了相关研究在临床上的应用。
因此，目前常规检测方法无法满足检测要求。发展更高灵敏度且成本低的蛋白检测方法，对于推动相关临床研究至关重要。
荧光磁珠是磁珠中比较特殊的一种，是近年来发展起来的一项新的免疫学技术，它将固化试剂特有的优点与免疫学反应的高度特异性结合于一体并且具有荧光性，以免疫学为基础，渗透到病理、生理、药理、微生物、生化以及分子遗传学等各个领域，其在免疫检测、细胞分离、生物大分子纯化和分子生物学等方面得到了越来越广泛的应用。运用核-壳的合成方法合成含有超顺磁性物质的高分子表面覆盖的复合材料、稳定性好和能进行后期标记的物质，利用这些物质表面的功能基团如氨基、羧基和巯基等进行抗体的共价或者非共价偶联，可用于结合相应的抗原或抗体，这样在外加磁场的吸引下可做定向移动，从而达到分离，检测，纯化基因、蛋白质、细胞和微生物等的目的。不同的胚胎具有不同的抗体对，所述抗体对即捕获抗体和标记抗体，这些抗体对都能够在市面上购买，用于检测分泌蛋白的含量。
发明内容
本发明为了解决上述背景技术中现有的目前检测灵敏度不高的技术问题，提供一种胚胎分泌蛋白的检测方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种胚胎分泌蛋白的检测方法，包括以下步骤：
a、取待测胚胎分泌蛋白的捕获抗体和标记抗体，将所述捕获抗体连接在荧光磁珠上，将所述标记抗体用生物素标记；
b、将步骤a中的所述荧光磁珠与待测胚胎分泌蛋白混合并孵育，接着将所述荧光磁珠取出清洗3～5遍，将清洗后的所述荧光磁珠、步骤a得到的用生物素标记的所述标记抗体以及联袂亲和素标记的β-半乳糖苷酶混合后，孵育，然后将所述荧光磁珠取出清洗3～5遍，再用PBS缓冲液重悬所述荧光磁珠；
c、将步骤b得到的重悬后的所述荧光磁珠置于微流控芯片的第一样品孔中，将荧光底物置于第二样品孔中，将液滴生成油置于油相进样孔中，通过注射器将所述荧光磁珠免疫复合物和荧光底物以及所述液滴生成油按照1:1:5的流速比注入微流控芯片形成油包水液滴，将生成的油包水液滴用毛细管进行收集，收集完成后将毛细管两端封闭，进行孵育；
d、将步骤c中得到的孵育完成的毛细管中的油包水液滴导入检测芯片，在鞘流的作用下，当油包水液滴经过检测窗口时，多色激光诱导荧光检测器检测得到荧光磁珠荧光信号和荧光底物酶促产物荧光信号，根据计算公式得到平均每个磁珠上所连酶的数量，具体计算公式如下：
AEB＝-ln(1-f)
其中：f为n/N；
N为检测到的荧光磁珠信号为阳性的油包水液滴数量，单位为个；
n为荧光磁珠荧光信号和荧光底物酶促产物荧光信号均为阳性的油包水液滴数量，单位为个；
AEB为平均每个磁珠上连接酶的数量，单位为个；
以AEB为纵坐标，单位为pg/mL的浓度为横坐标绘制标准曲线，根据标准曲线计算待测胚胎分泌蛋白浓度。
本发明的有益效果是：多色激光诱导荧光检测器可以同时检测荧光磁珠和底物酶促产物的荧光信号，只有两种荧光信号均检测到的液滴才会被记作是阳性信号，由此可以排除游离β半乳糖苷酶包裹在液滴中形成的假阳性信号。该发明相较于常规蛋白检测方法具有更高的检测灵敏度，检测灵敏度均难以突破pg/mL。解决了现有的目前检测灵敏度不高的技术问题。所需样本体积只需要20～30μL，且该方法具有一定的通用性和成本相对于荧光成像法要低得多，通过改变抗体对，可以对不同种类的蛋白进行定量检测。由于确定的胚胎的分泌蛋白具有确定的抗体对，即捕获抗体和标记抗体，利用β-半乳糖苷酶(βGAL)作为标签标记抗体并利用其荧光素2-β-D-吡喃半乳糖苷(FDG)之间的酶促反应实现待测蛋白的信号放大。在步骤a中，将荧光磁珠上覆盖待测胚胎分泌蛋白的捕获抗体。步骤b中，荧光磁珠与待测胚胎分泌蛋白混合获得，该发明利用β-半乳糖苷酶标记待测荧光磁珠上的待测胚胎分泌蛋白，清洗后的荧光磁珠与标记抗体及链霉亲和素标记的β-半乳糖苷酶混合并孵育利用酶促反应不断催化底物反应生成荧光物质，可有效实现待测胚胎分泌蛋白的信号放大。同时微流控液滴技术的引入即在微流控芯片上形成了液滴，可快速富集荧光物质达到可测浓度。本发明的胚胎分泌蛋白来源于深圳中山泌尿外科医院的成品。高灵敏的多色激光诱导荧光检测器的使用可实现更微量荧光物质的检测，一定程度上可以减少反应时间，并且与荧光成像相比可减少人为主观因素的干扰，使读取的信号更加客观。由于所用磁珠数量远大于待测蛋白数量，因此磁珠上捕获待测蛋白情况符合泊松分布；
Figure BDA0002271123100000041
K为磁珠上带有酶的数量，P为连有K个酶的磁珠占总磁珠的比例，λ为平均每个珠子上连有酶的数量。
当K＝0时，P(0)＝e-λ
所以，λ＝-ln(P(0))＝-ln(1-P(X＞0))。
即：AEB＝-ln(1-f)，其中：
f为n/N；
N为检测到的荧光磁珠信号为阳性的油包水液滴数量，n为荧光磁珠荧光信号和荧光底物酶促产物荧光信号均为阳性的油包水液滴数量；
AEB为平均每个磁珠上连接酶的数量。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，在步骤a中，所述荧光磁珠的直径为5～10um，所述荧光磁珠的表面的功能基团为羧基或N-羟基琥珀酰亚胺。
采用上述进一步方案的有益效果是，荧光磁珠确定直径和功能基团能够更好与其他反应物结合，起到了更好的吸附作用。且具有荧光性能，方便筛选。
进一步，在步骤b中，所述孵育的温度均为37℃，所述孵育的时间均为25～35min；所述清洗均采用纯水；所述PBS缓冲液的体积为5～20uL。
采用上述进一步方案的有益效果是，上述确定的操作条件能够让最后的检测结果更准确。
进一步，所述孵育的时间均为30min；所述PBS缓冲液的体积为10uL。
采用上述进一步方案的有益效果是，更加准确的反应条件，能够让本发明的检测方法更加的准确。
进一步，在步骤c中，所述荧光底物为荧光素2-β-D-吡喃半乳糖苷或试卤灵-2-β-D-吡喃半乳糖苷。
进一步，当荧光底物为荧光素2-β-D-吡喃半乳糖苷时，在步骤d中，所述多色激光诱导荧光检测器的激发波长为488nm，荧光收集波段为525nm；
当荧光底物为试卤灵-2-β-D-吡喃半乳糖苷时，在步骤d中，所述多色激光诱导荧光检测器的激发波长为558nm，荧光收集波段为580nm。
采用上述进一步方案的有益效果是，确定荧光底物和多色激光诱导荧光检测器的检测条件，能够得到更加准确的待测胚胎分泌蛋白的含量。
进一步，在步骤c中，所述液滴生成油为氟油、矿物油和石蜡油中的任意一种，所述孵育的温度为37℃，所述孵育的时间为1-3h。
采用上述进一步方案的有益效果是，确定的液滴与荧光底物和荧光磁珠一起，更好的实现油包水液滴的形成。
进一步，在步骤d中，阳性信号为荧光素检测通道的信号＞0.2V且相应的荧光磁珠检测信号＞1V。
采用上述进一步方案的有益效果是，步骤d中的曲线线性范围为0.10～50.00pg/mL，采集频率为100KHZ。高灵敏多色激光诱导荧光检测器可以同时检测荧光磁珠和荧光底物酶促产物的荧光信号，只有两种荧光信号均检测到的液滴才会被记作是阳性信号，由此可以排除游离β半乳糖苷酶包裹在液滴中形成的假阳性信号。该发明相较于常规蛋白检测方法具有更高的检测灵敏度。
附图说明
图1为本发明实施例1的多色激光诱导荧光检测器检测信号荧光强度图；
图2为本发明实施例2的多色激光诱导荧光检测器检测信号荧光强度图；
图3为本发明实施例3的多色激光诱导荧光检测器检测信号荧光强度图；
图4为本发明实施例1中定量标准曲线图；
图5为本发明实施例4的胚胎分泌蛋白的检测荧光信号荧光强度图；
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1、
一种胚胎分泌蛋白的检测方法，包括以下步骤：
a、取胚胎的绒毛膜促性腺激素的浓度为o的捕获抗体和标记抗体，将捕获抗体连接在荧光磁珠上，标记抗体用生物素标记,所述荧光磁珠的激发、发射波长分别为660nm和690nm；
b、将步骤a中的荧光磁珠与取分泌蛋白浓度为o的胚胎培养液混合在37℃下孵育30min，接着将荧光磁珠取出清洗3～5遍，清洗后的荧光磁珠与标记抗体及链霉亲和素标记的β-半乳糖苷酶混合并在37℃下孵育30min，然后将荧光磁珠取出清洗5遍，清洗后用10uL的PBS缓冲液重悬荧光磁珠；
c、将步骤b中重旋后的荧光磁珠置于第一样品孔，荧光素2-β-D-吡喃半乳糖苷置于第二样品孔，将氟油置于油相进样孔，通过注射器将所述荧光磁珠免疫复合物和荧光底物以及所述液滴生成油按照1:1:5的流速比注入微流控芯片形成油包水液滴，接着将生成的油包水液滴用毛细管进行收集，收集完成后将毛细管两端封闭在37℃孵育2h；
d、将步骤c中得到的孵育完成的毛细管中的油包水液滴导入检测芯片，在鞘流的作用下，当油包水液滴经过检测窗口时，多色激光诱导荧光检测器检测得到油包水液滴的荧光信号，所述多色激光诱导荧光检测器的2个激发波长分别为488nm和658nm，2个荧光收集波段为525nm和685nm，根据计算公式得，具体计算公式如下：
AEB＝-ln(1-f)
其中：f为n/N；
N为检测到的荧光磁珠信号为阳性的油包水液滴数量，n为荧光磁珠荧光信号和荧光底物酶促产物荧光信号均为阳性的油包水液滴数量；
AEB为平均每个磁珠上连接酶的数量
绒毛膜促性腺激素是一种糖蛋白。
在多色激光诱导荧光检测器的测量过程中，n为33，N为10012，AEB为0.0033。
实施例2、
与实施例1的区别在于，取胚胎培养液的绒毛膜促性腺激素的浓度为0.1pg/mL。
在多色激光诱导荧光检测器的测量过程中n为137，N为9978，AEB为0.0138。
实施例3、
与实施例1的区别在于，取胚胎培养液的绒毛膜促性腺激素的浓度为1pg/mL。
在多色激光诱导荧光检测器的测量过程中，n为1135，N为9871，AEB为0.1221。
实施例4、
与实施例1的区别在于，取胚胎分泌的人绒毛膜促性腺激素。
在多色激光诱导荧光检测器的测量过程中，n为636，N为9989，AEB为0.0658。实施例4中的得到的胚胎分泌的人绒毛膜促性腺激素的多色激光诱导荧光检测器得到的荧光检测信号如图5所示。
为了证明本发明的检测结果的准确性，特做以下的实验，具体的实验如下：
实验1、
实施例1至实施例3中的多色激光诱导荧光检测器得到的荧光检测信号如图1至图3所示，其中磁珠荧光信号＞1.0V为荧光磁珠阳性信号计数为N，酶促底物产物荧光信号＞0.2V为酶促产物阳性信号，磁珠荧光信号和酶促底物荧光信号均为阳性则计数为n。其中标注*的为假阳性峰，即酶促底物产物荧光信号＞0.2V，中磁珠荧光信号＜1.0V。如图1至图3所示。横坐标是时间，单位是秒(s)；纵坐标是荧光信号(V)。然后根据AEB＝-ln(1-f)的计算公式，得出实施例1的AEB为0.0033，实施例2的AEB为0.0138，实施例3的AEB为0.1221。
实验2、
由于已知的实施例1至实施例3的胚胎分泌的人绒毛膜促性腺激素的浓度分别为0pg/mL、0.1pg/mL和1pg/mL。再根据实施例1至实施例3中得到的AEB制备如图4所示的标准曲线。横坐标是胚胎分泌蛋白的浓度(pg/mL)即是胚胎分泌的人绒毛膜促性腺激素的浓度，纵坐标为AEB即平均每个磁珠上连接酶的数量。
实验3、
由于实施例4中的得到的胚胎分泌的人绒毛膜促性腺激素的多色激光诱导荧光检测器得到的荧光检测信号如图5所示。横坐标是时间，单位是秒(s)；纵坐标是信号(V)。且由于AEB值为0.0658，最终根据如图4所示的标准曲线换算出胚胎分泌的人绒毛膜促性腺激素浓度为0.655pg/mL。
在本说明书的描述中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“具体实施例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或实例。而且，描述的具体特征、结构、材料或特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种胚胎分泌蛋白的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、取待测胚胎分泌蛋白的捕获抗体和标记抗体，将所述捕获抗体连接在荧光磁珠上，将所述标记抗体用生物素标记；
b、将步骤a中的所述荧光磁珠与待测胚胎分泌蛋白混合并孵育，接着将所述荧光磁珠取出清洗3～5遍，将清洗后的所述荧光磁珠、步骤a得到的用生物素标记的所述标记抗体以及联袂亲和素标记的β-半乳糖苷酶混合后，孵育，然后将所述荧光磁珠取出清洗3～5遍，再用PBS缓冲液重悬所述荧光磁珠；
c、将步骤b得到的重悬后的所述荧光磁珠置于微流控芯片的第一样品孔中，将荧光底物置于第二样品孔中，将液滴生成油置于油相进样孔中，通过注射器将所述荧光磁珠免疫复合物和荧光底物以及所述液滴生成油按照1:1:5的流速比注入微流控芯片形成油包水液滴，将生成的油包水液滴用毛细管进行收集，收集完成后将毛细管两端封闭，进行孵育；
d、将步骤c中得到的孵育完成的毛细管中的油包水液滴导入检测芯片，在鞘流的作用下，当油包水液滴经过检测窗口时，多色激光诱导荧光检测器检测得到荧光磁珠荧光信号和荧光底物酶促产物荧光信号，根据计算公式得到平均每个磁珠上所连酶的数量，具体计算公式如下：
AEB＝-ln(1-f)
其中：f为n/N；
N为检测到的荧光磁珠信号为阳性的油包水液滴数量，单位为个；
n为荧光磁珠荧光信号和荧光底物酶促产物荧光信号均为阳性的油包水液滴数量，单位为个；
AEB为平均每个磁珠上连接酶的数量，单位为个；
以AEB为纵坐标，单位为pg/mL的浓度为横坐标绘制标准曲线，根据标准曲线计算待测胚胎分泌蛋白浓度。
2.根据权利要求1所述的胚胎分泌蛋白的检测方法，其特征在于，在步骤a中，所述荧光磁珠的直径为5～10um，所述荧光磁珠表面的功能基团为羧基或N-羟基琥珀酰亚胺。
3.根据权利要求1所述的胚胎分泌蛋白的检测方法，其特征在于，在步骤b中，所述孵育的温度均为37℃，所述孵育的时间均为25～35min；所述清洗均采用纯水；所述PBS缓冲液的体积为5～20uL。
4.根据权利要求3所述的胚胎分泌蛋白的检测方法，其特征在于，所述孵育的时间均为30min；所述PBS缓冲液的体积为10uL。
5.根据权利要求1所述的胚胎分泌蛋白的检测方法，其特征在于，在步骤c中，所述荧光底物为荧光素2-β-D-吡喃半乳糖苷或试卤灵-2-β-D-吡喃半乳糖苷。
6.根据权利要求5所述的胚胎分泌蛋白的检测方法，其特征在于，当荧光底物为荧光素2-β-D-吡喃半乳糖苷时，在步骤d中，所述多色激光诱导荧光检测器的激发波长为488nm，荧光收集波段为525nm；
当荧光底物为试卤灵-2-β-D-吡喃半乳糖苷时，在步骤d中，所述多色激光诱导荧光检测器的激发波长为558nm，荧光收集波段为580nm。
7.根据权利要求1所述的胚胎分泌蛋白的检测方法，其特征在于，在步骤c中，所述液滴生成油为氟油、矿物油和石蜡油中的任意一种，所述孵育的温度为37℃，所述孵育的时间为1-3h。
8.根据权利要求1所述的胚胎分泌蛋白的检测方法，其特征在于，在步骤d中，阳性信号为荧光素检测通道的信号＞0.2V且相应的荧光磁珠检测信号＞1V。
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