CN110846412B - 一种双靶向解离多功能纳米平台及其应用 - Google Patents

一种双靶向解离多功能纳米平台及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种双靶向解离多功能纳米平台及其应用，所述纳米平台包括聚多巴胺包裹的纳米金颗粒，并且所述纳米金颗粒含有捕获细胞外囊泡的带羧基长链烷烃，以及与细胞外囊泡表面的唾液酸特异性识别的荧光染料，以及一段或多段与细胞外囊泡内miRNA上的碱基对匹配的DNA，所述DNA一端连接荧光基团另一端连接猝灭剂。本发明提供了一个基于聚多巴胺的仿生多功能纳米平台来捕获和检测外泌体，为理解不同外泌体生物标志物之间的相互作用提供了一条途径，并为基于外泌体的癌症诊断提供了一个有前景的工具，用于实现对于肿瘤细胞的早期发现与预防。

Description

一种双靶向解离多功能纳米平台及其应用
技术领域
本发明涉及细胞活体成像分析技术以及纳米材料制备领域，尤其涉及一种双靶向解离多功能纳米平台及其应用。
背景技术
细胞外囊泡(EVs)是具有磷脂双层膜的纳米级细胞外源性囊泡。几乎所有类型的细胞都分泌出囊泡。囊泡被与细胞膜类似的脂质双层所包裹，在其表面上带有配位受体，并且还包含一系列寡核苷酸，特别是microRNAs(miRNAs)。在过去的十年中，越来越多的证据表明，细胞外囊泡通过与受体细胞的相互作用在调节细胞间的通讯中起着重要的作用，从而可以传递功能性的生物信号。更重要的是，大多数类型的癌细胞会分泌大量包含肿瘤分子信息的囊泡，可以通过囊泡传输来改变受体细胞的功能和生理。此外，发现囊泡可促进癌症进展和转移，因此可作为潜在的临床生物标志物用于癌症诊断。与循环中的癌细胞(血液中少于10mL-1)相比，癌症衍生的囊泡中信息分子更为丰富，并且在血液中(1010mL-1)很容易被发现。因此，设计一种高效的策略来检测癌症衍生的囊泡并获取其分子信息具有极大的意义。
纳米颗粒，尤其是具有生物功能的核壳纳米颗粒，由于其多功能性和易修饰性而受到了特别关注，并被广泛用作生物传感器。特别地，等离子金核-聚合物壳层结构的纳米颗粒令人关注。一方面，金纳米颗粒(GNP)显示出强大的入射光吸收性，这使其成为生物成像应用中出色的荧光猝灭剂和生热剂；另一方面，聚合物壳层可以为纳米粒子提供各种结合位点用于进一步修饰。多巴胺(DA)是一种重要的神经递质，已被广泛用于在不同界面上形成保形层和连续层，因为DA的自聚合在弱碱性的pH下发生，并且形成的聚多巴胺(PDA)非常稳定且与大量官能团具有生物相容性，可以用作各种功能分子的结合位点。尽管已经有成功地将多巴胺包裹的金纳米颗粒进行生物应用，但仍未研究将其用于EV检测。
传统的EV分析检测通常包含两个步骤：EV分离和下游分子分析。目前已经开发了多种技术来纯化细胞培养上清液或体液中的EV，包括超速离心，超滤，密度梯度分离和磁分离。对于随后的分子分析，已使用了依赖于电子显微镜，酶联免疫吸附测定(ELISA)和蛋白质印迹的方法。但是，这些方法大多数不方便，费时，并且通常需要大量的后标记过程。已经开发出克服这些局限性的新方法，例如微流体平台，电化学传感器，拉曼散射，分子印迹和基于生物囊泡的膜融合。尽管取得了这些进展，但是这些方法通常侧重于检测完整的EV或单个EV生物标志物，因此无法提供多种EV成分的详细分子信息，更不用说研究不同成分之间的相互作用了。因此，迫切需要开发更先进的EV检测方法，以一次获得所有EV成分的信息。
发明内容
本发明的第一个目的在于，提供一种能快速捕获外泌体并对外泌体表面到内部的不同癌症生物标记物进行多层成像检测的，具有更高准确性的一种双靶向解离多功能纳米平台。
本发明的第二个目的在于，提供双靶向解离多功能纳米平台在检测细胞外囊泡的肿瘤标志物中的应用。
本发明的第三个目的在于，提供一种细胞外囊泡的肿瘤标志物检测方法。
为了实现上述目的，本发明提供了一种双靶向解离多功能纳米平台(GNP@PDA-NP)，所述纳米平台包括聚多巴胺包裹的纳米金颗粒，并且所述纳米金颗粒含有捕获细胞外囊泡的带羧基长链烷烃，以及与细胞外囊泡表面的唾液酸特异性识别的荧光染料，以及一段或多段与细胞外囊泡内miRNA上的碱基对匹配的DNA，所述DNA一端连接荧光基团另一端连接猝灭剂。
作为一个优选方案，所述带羧基长链烷烃包括二十八烷酸，十八烷酸和二十烷酸中的一种或多种。
作为一个优选方案，所述荧光染料包括3-(丹磺酰氨基)苯硼酸(DAPB)。
作为一个优选方案，所述纳米平台为修饰有DNA序列，二十八烷酸，3-(丹磺酰氨基)苯硼酸(DAPB)和聚多巴胺的金纳米颗粒。
作为一个优选方案，纳米金颗粒的粒径为10-200nm，优选60nm。
为了实现上述第二个目的，本发明提供了双靶向解离多功能纳米平台在检测细胞外囊泡的肿瘤标志物中的应用。
作为一个优选方案，利用所述双靶向解离多功能纳米平台进行铺板，使用荧光成像技术进行检测。
作为一个优选方案，所述肿瘤标志物包括唾液酸和miRNA。
为了实现上述第三个目的，本发明提供了一种细胞外囊泡的肿瘤标志物检测方法，基于所述双靶向解离多功能纳米平台来捕获和检测细胞外囊泡的肿瘤标志物。
作为一个优选方案，所述肿瘤标志物包括唾液酸和miRNA。
同时检测唾液酸和miRNA，快速捕获外泌体并对外泌体表面到内部的不同癌症生物标记物进行多层成像，准确性更好。miRNA包括miRNA21，miRNA-145,miRNA-25等肿瘤标志物。
捕获细胞外囊泡的带羧基长链烷烃用于插入细胞外囊泡的磷脂双层膜中从而捕获囊泡，一般包括二十八烷酸，十八烷酸和二十烷酸等，带羧基长链烷烃修饰时一般同时加入NHS和EDC进行修饰。
与细胞外囊泡表面的唾液酸特异性识别的荧光染料可以为3-(丹磺酰氨基)苯硼酸(DAPB)或者经过修饰的trisSia-Cy3，trisSia-Cy5荧光染料。
与细胞外囊泡内miRNA上的碱基对匹配的DNA序列是指根据所要检测的miRNA序列所对应的碱基序列，再在两端加上猝灭剂及荧光基团在生物工程公司进行合成。检测的miRNA根据需要可以为一种或多种，对应的匹配的DNA序列也可以为一段或多段，荧光基团根据需要选择相同或不相同。
本发明的荧光成像技术为本领域技术人员常规理解的荧光成像技术，实施例中使用共聚焦荧光显微镜进行成像。
本发明的优点在于，本发明提供了一个基于聚多巴胺的仿生多功能纳米平台来捕获和检测外泌体，该平台具有以下优点：(1)方便、省时、无需预处理，适用于细胞上清液和血清样品；(ii)快速捕获外泌体并对外泌体表面到内部的不同癌症生物标记物进行多层成像，准确性更好；(三)基于96孔板的高通量检测；(iv)有效区分癌细胞来源的外泌体与正常外泌体；(v)癌症现实诊断的潜力。该方法为理解不同外泌体生物标志物之间的相互作用提供了一条途径，并为基于外泌体的癌症诊断提供了一个有前景的工具，用于实现对于肿瘤细胞的早期发现与预防。
附图说明
图1GNP@PDA-NP的合成与对EV的检测过程，a)金纳米颗粒合成GNP@PDA-NP过程示意图；b)用于检测miRNA及唾液酸的工作原理图；c)通过双靶向解离多功能纳米板进行对于囊泡中的miRNA及唾液酸检测。
图2EV的检测优化过程，a)EV检测表面的制备过程；b)铺板加入量的优化；c)不同加入量下的蓝绿平均荧光强度；d)不同照射时间下的优化；e)不同照射时间下的蓝绿平均荧光强度。
具体实施方式
以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1.
实施例中检测的是miRNA21，所用DNA序列为5'-Cy3-GCGCG TCA ACA TCA GTC TGATAA GCT A CGCGC-BHQ2-3'。(SEQ ID NO.1)
(1)根据已有文献(S,Link,M.A.El-Sayed,J.Phys.Chem.B.1999,103,4212.)，合成13nm金胶作为种子。将50mL HAuCl4(0.01％)溶液加入圆底烧瓶中加热至沸腾，然后快速加入5mL柠檬酸钠溶液(38.8mM)并且持续搅拌30分钟，直到溶液变成红色，得到的13nm金种被用来制备粒径在60nm左右的纳米金。
(2)利用金种合成60nm的纳米金。将1mL金种溶液与100μL NH2OH·HCl(0.2M)混合后用纯水稀释至25mL，之后将3.0mL HAuCl4(0.01％)缓慢逐滴加入上述混合溶液中，持续搅拌30分钟直到溶液变成暗红色。将得到的纳米金溶液离心，用纯水洗涤，于4℃条件下保存。
(3)为了将纳米金包裹上5nm左右的聚多巴胺壳层，将1mL金胶溶液与1mL多巴胺溶液(0.1mg mL-1溶于pH 8.5，10mM Tris盐酸缓冲溶液)混合。在室温下置于摇床2小时后，溶液的颜色变成了深紫色。用离心机经10000转离心6min，得到聚多巴胺包裹的纳米金(GNP@PDA)，再分散于纯水中。
(4)10μL DNA(100μM)和3-(丹磺酰氨基)苯硼酸(DAPB)(0.3mg)加入1毫升GNP@PDA，并在室温搅拌过夜。然后，将混合物离心，用PBS洗涤两次，最后将产生的探针重悬于1mL纯水中。将NHS 2.5mg，EDC 1mg，二十八烷酸0.5mg加入上述溶液中，室温搅拌3h。通过10000rpm重复离心5min得到GNP@PDA-NP，并最终在纯水中再分散。
(5)细胞(1毫升，1×106mL-1)在培养3天后，从中吸出培养液，用离心机在5000转下离心3分钟。然后将GNP@PDA-NP(100μL)添加到上层清液(2mL)中孵育30分钟，然后在波长688nm的激光下照射30min后进行显微成像，用于检测外泌体中的唾液酸与miRNA-21。
若检测其他类型的miRNA，则更改DNA的碱基序列使之与所检测的miRNA的碱基序列所对应，若为实现几种miRNA的同时检测，则更改DNA序列一端的荧光基团使之发出不同荧光。
实施例2.
(1)同实施例1中一致，制得60nm的纳米金，也可制得在10-200nm的纳米金。
(2)在96孔板上每孔加入1mL 60nm金胶,在85℃下1h烘干。再加入1ml PDA溶液(0.1mg/mL)，在85℃下1h烘干。后将10μL DNA(100μM),DAPB(0.3mg)、2.5mg NHS、1mg EDC、0.5mg二十八烷酸溶于1mL纯水中混合后取100μL添加在每孔内孵育一夜,之后在85℃下15min烘干。
(3)细胞(1mL，1×106mL-1)在培养3天后，从中吸出培养液，用离心机在5000转下离心3分钟。将上层清液(2mL)添加到制备好96孔板内孵育30min，然后在波长688nm的激光下照射30min后进行显微成像，用于检测外泌体中的唾液酸与miRNA。从图2中可以看出，从加入量10-200微升时均有荧光，100微升时荧光强度最高。从照射时间8-60min均有荧光，30min时荧光强度最高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，比如设计不同的匹配DNA序列，同时检测多种miRNA，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华东理工大学
<120> 一种双靶向解离多功能纳米平台及其应用
<130> /
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcgcgtcaac atcagtctga taagctacgc gc 32

Claims (4)

1.一种双靶向解离多功能纳米平台，其特征在于，所述纳米平台包括聚多巴胺包裹的纳米金颗粒，并且所述纳米金颗粒含有捕获细胞外囊泡的带羧基长链烷烃，以及与细胞外囊泡表面的唾液酸特异性识别的荧光染料，以及一段或多段与细胞外囊泡内miRNA上的碱基对匹配的DNA，所述DNA一端连接荧光基团另一端连接猝灭剂，所述带羧基长链烷烃为二十八烷酸、十八烷酸或二十烷酸，所述荧光染料为3-(丹磺酰氨基)苯硼酸。
2.根据权利要求1所述的一种双靶向解离多功能纳米平台，其特征在于，所述纳米平台为修饰有DNA序列，二十八烷酸，3-(丹磺酰氨基)苯硼酸和聚多巴胺的金纳米颗粒。
3.根据权利要求1所述的一种双靶向解离多功能纳米平台，其特征在于，所述纳米金颗粒的粒径为10-200nm。
4.根据权利要求3所述的一种双靶向解离多功能纳米平台，其特征在于，所述纳米金颗粒的粒径为60nm。
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